Autoreferat

Transkrypt

Autoreferat

AUTOREFERAT
Omówienie cyklu publikacji pt.
GLIKANY I GLIKOKONIUGATY ŚCIANY KOMÓRKOWEJ WYBRANYCH
GATUNKÓW BAKTERII
Zbigniew Kaczyński
Wydział Chemii Uniwersytetu Gdańskiego
Gdańsk, 2012
Glikany i glikokoniugaty ściany komórkowej wybranych gatunków bakterii
2
1. Zbigniew Kaczyński
2. Posiadane stopnie naukowe:
Doktor nauk chemicznych w zakresie chemii
Wydział Chemii Uniwersytetu Gdańskiego (2002);
Rozprawa doktorska pt. I-rzędowa struktura O-antygenu bakterii Salmonella
Abortusequi i II-rzędowa struktura O-antygenu bakterii Salmonella Aberdeen.
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu
2002-…
Wydział Chemii UG, adiunkt,
2002-2005 Centrum Naukowe w Borstel (Niemcy) staż podoktorski,
1998-2002 Wydział Chemii UG, specjalista.
4. Osiągnięcia wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 roku
a. Glikany i glikokoniugaty ściany komórkowej wybranych gatunków bakterii
b. Wykaz publikacji
H1. Czerwicka M., Forsythe S.J., Bychowska A., Dziadziuszko H., Kunikowska D.,
Stepnowski P., Kaczyński Z.* Structure of the O-polysaccharide isolated from
Cronobacter sakazakii 767. Carbohydr. Res. 2010, 345, 908-913. IF2010=1.898
H2. Gajdus J., Kaczyński Z.,* Śmietana J., Stepnowski P. Structural determination of the
O-antigenic polysaccharide from Salmonella Mara (O:39). Carbohydr. Res. 2009, 344,
1054-1057. IF2009=2.025
H3. Czerwicka M., Marszewska K., Bychowska A., Dziadziuszko H., Brzozowski K.,
Łojkowska E., Stepnowski P., Kaczyński Z.* Chemical structure of the Opolysaccharide isolated from Pectobacterium atrosepticum SCRI 1039. Carbohydr. Res.
2011, 346, 2978-2981. IF2010=1.898
H4. Kaczyński Z., Braun S., Lindner B., Niehaus K., Holst O. Investigation of the chemical
structure and biological activity of oligosaccharides isolated from rough-type Xanthomonas
campestris pv. campestris B100 lipopolysaccharide. J. Endotoxin Res. 2007, 13, 101-108.
IF2007=3.371
H5. Meredith T.C., Mamat U., Kaczyński Z., Lindner B., Holst O., Woodard R.W.
Modification of Lipopolysaccharide with Colanic Acid (M-antigen) Repeats in
Escherichia coli. J. Biol. Chem. 2007, 282, 7790-7798. IF2007=5.581
3
H6. Pinta E., Duda K.A., Hanuszkiewicz A., Kaczyński Z., Lindner B., Miller W.L.,
Hyytiäinen H., Vogel C., Borowski S., Kasperkiewicz K., Lam J.S., RadziejewskaLebrecht J., Skurnik M., Holst O. Identification and Role of a 6-Deoxy-4-KetoHexosamine in the Lipopolysaccharide Outer Core of Yersinia enterocolitica Serotype
O:3. Chem. Eur. J. 2009, 15, 9747-9754. IF2009=5.382
H7. Kaczyński Z., Karapetyan G., Evidente A., Iacobellis N.S., Holst O. The structure of a
putative exopolysaccharide of Burkholderia gladioli pv. agaricicola. Carbohydr. Res.
2006, 341, 285-288. IF2006=1.703
H8. Fraysse N., Lindner B., Kaczyński Z., Sharypova L., Holst O., Niehaus K., Poinsot V.
Sinorhizobium meliloti strain 1021 produces a low-molecular mass capsular
polysaccharide that is a homopolymer of 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid
harbouring a phospholipidic anchor. Glycobiology 2005, 15, 101-108. IF2005=3.512
H9. Hanuszkiewicz A., Kaczyński Z., Lindner B., Goldmann T., Vollmer E., Debarry J.,
Heine H., Holst O. The structural analysis of the capsular polysaccharide from
Acinetobacter lwoffii F78. Eur. J. Org. Chem. 2008, 36, 6183-6188. IF2008=3.016
H10. Theilacker C., Kaczyński Z., Kropec A., Fabretti F., Sange T., Holst O., Huebner J.
Opsonic Antibodies to Enterococcus faecalis Strain 12030 Are Directed Against
Lipoteichoic Acid. Infect. Immun. 2006, 74, 5703-5712. IF2006=4.004
H11. Fabretti F., Theilacker C., Baldassarri L., Kaczyński Z., Kropec A., Holst O., Huebner
J. Alanine esters of enterococcal lipoteichoic acid play a role in biofilm formation and
resistance to antimicrobial peptides. Infect. Immun. 2006, 74, 4164-4171. IF2006=4.004
H12. Theilacker C., Kaczyński Z., Kropec A., Sava I., Ye L., Bychowska A., Holst O.,
Huebner J., Serodiversity of Opsonic Antibodies against Enterococcus faecalis Glycans of the Cell Wall Revisited. PloS ONE 2011, e17839. IF2010=4.411
H13. Theilacker C., Holst O., Lindner B., Huebner J., Kaczyński Z.* The structure of the
wall teichoic acid isolated from Enterococcus faecalis strain 12030. Carbohydr. Res.
2012, 354, 106–109. IF2010=1.898
H14. Bychowska A., Theilacker C., Czerwicka M., Marszewska K., Huebner J., Holst O.,
Stepnowski P., Kaczyński Z.* Chemical structure of wall teichoic acid isolated from
Enterococcus faecium strain U0317. Carbohydr. Res. 2011, 346, 2816-2819.
IF2010=1.898
* Autor korespondencyjny
4
c. Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem
ich ewentualnego wykorzystania
I. Wstęp
Pełne zrozumienie biologicznej funkcji glikanów i glikokoniugatów w organizmach
żywych musi prowadzić do wniosku, że ich znaczenie może być porównywane tylko do roli, jaką
odgrywają kwasy nukleinowe i białka. Monosacharydy, podobnie jak aminokwasy i nukleotydy,
stanowią rodzaj alfabetu informacji biologicznej, tylko w odróżnieniu od nich, o większej
i praktycznie nieograniczonej zdolności kodującej.1 Ta potencjalnie nieograniczona zdolność
kodująca ma istotny wpływ na ogromne zróżnicowanie biosyntezowanych molekuł,
co przekłada się bezpośrednio na bardzo złożone oddziaływania mikroorganizmów
z otaczającym je środowiskiem, a zwłaszcza organizmem gospodarzem.
Na szczególną uwagę zasługują glikokoniugaty wyizolowane z bakterii powodujących
szereg groźnych chorób ludzi, zwierząt i roślin. Znajomość ich struktur chemicznych stanowi
bardzo cenne narzędzie w poznaniu i zrozumieniu procesów biosyntezy, co przyczynia się
do medycznego, biotechnologicznego i przemysłowego wykorzystania nabytej wiedzy w rozwoju
nowych technik diagnostycznych i środków terapeutycznych.
Pomimo tego, że w ostatnich latach rola glikanów i glikokoniugatów w procesach
chorobowych, rozpoznaniu immunologicznym oraz innych procesach środowiskowych została
stosunkowo dobrze poznana, to ciągle sporo zagadek pozostaje do wyjaśnienia.
Celem naukowym badań własnych opisywanych w autoreferacie było wyizolowanie
oraz określenie struktury chemicznej różnych glikanów i glikokoniugatów ściany komórkowej
bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Najczęściej badaniom strukturalnym towarzyszyły,
bardzo istotne z punktu widzenia chemotaksonomii i diagnostyki, badania biologiczne, mające
na celu wyjaśnienie mechanizmów oddziaływania patogen-gospodarz (bakteria-człowiek/
zwierzę/roślina) oraz mechanizmów biosyntezy wyizolowanych glikokoniugatów. Ponadto,
dla bakterii Gram-dodatnich zaplanowano badania pod kątem potencjalnego wykorzystania
wyizolowanych i strukturalnie scharakteryzowanych glikanów i glikokoniugatów do produkcji
szczepionek, które mogą być wykorzystywane do zapobiegania chorobom wywoływanym przez
bakterie z rodzaju Enterococcus i stanowić alternatywę dla antybiotykowego sposobu leczenia.
1
Anthony Moran w Microbial glycobiology. Structures, relevance and applications.
5
W przedkładanym autoreferacie omawiane prace podzielono na dwie części (bakterie
Gram-ujemne [H1-H9] i bakterie Gram-dodatnie [H10-H14]) poprzedzone krótkim
wprowadzeniem literaturowym charakteryzującym obiekty badań.
II. Glikany i glikokoniugaty ściany komórkowej wybranych gatunków
bakterii
Bakterie są mikroorganizmami, które mogą zasiedlać większość miejsc na ziemi.
Niektóre gatunki są w stanie przetrwać temperaturę -4 °C, inne żyją w temperaturach do 115 °C.
Na szczególną uwagę zasługują bakterie chorobotwórcze, dla których optymalna temperatura
wzrostu wynosi 30-37 °C, czyli zakres temperatury ciała ludzkiego i innych ssaków. Wśród
bakterii są gatunki, które rosną tylko w obecności tlenu atmosferycznego oraz takie, dla których
tlen jest zabójczy. Należy również wspomnieć o istnieniu mikroorganizmów rosnących przy
niskich stężeniach tlenu atmosferycznego (tzw. względne beztlenowce), do których należy
większość bakterii chorobotwórczych. Bakterie mogą przetrwać w szerokim zakresie pH (0,7-9),
przy dużym stężeniu soli oraz w warunkach wysokiego ciśnienia lub narażenia na działanie
promieniowania UV. Ponadto duża część bakterii musi funkcjonować w komórkach
gospodarza (bakterie symbiotyczne lub patogenne) [1].
Bardzo zróżnicowane warunki, w których bakterie żyją i się rozmnażają, spowodowały,
że wykształciły one specjalne ściany komórkowe, które zabezpieczają je przed niekorzystnym
wpływem otocznia, a jednocześnie umożliwiają z nim komunikację. Ściana komórkowa jest
podstawową osłoną bakterii, zwiększającą ich odporność i umożliwiającą prawidłowe
funkcjonowanie.
Jedną
z
ważniejszych
właściwości
ściany komórkowej
jest
jej
przepuszczalność, która została wykorzystana do podzielenia bakterii na Gram-ujemne
i Gram-dodatnie (barwienie fioletem krystalicznym metodą Grama).
Ściana komórkowa każdej bakterii zawiera stosunkowo dużo różnorodnych
glikokoniugatów, które odgrywają kluczową rolę w komunikowaniu się bakterii
z otaczającym ją środowiskiem. Dlatego też, dokładna znajomość struktur chemicznych
cukrowych składników ściany komórkowej tych mikroorganizmów jest niezbędna do
poznania mechanizmów oddziaływania ich ze środowiskiem, w tym jakże ważnych
mechanizmów wywoływania infekcji bakteryjnych, ich zapobiegania oraz zwalczania.
Glikany i glikokoniugaty są trudnymi obiektami badań, na skutek dużej liczby
możliwych struktur, jakie teoretycznie mogą być utworzone z monosacharydów i składników
niecukrowych oraz ze względu na złożone metody ich wyodrębniania i oczyszczania. Biorąc pod
6
uwagę budowę glikokoniugatów oraz konieczność wykonywania wielu reakcji chemicznych
trudno jest zaproponować jedną procedurę analityczną w badaniach strukturalnych. Najczęściej
trzeba zastosować kilka metod, a ich wybór zależy od rodzaju i wielkości próbki oraz od
dostępnej aparatury badawczej. Powszechnie stosuje się analizy chemiczne (analiza cukrowa
i metylacyjna, utlenianie jodanem(VII) sodu i tlenkiem chromu(VI), redukcyjne
rozszczepianie, acetoliza, metanoliza), degradację enzymatyczną, chromatografię gazową
i cieczową (GC i HPLC), spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR),
spektrometrię mas (MS) oraz spektrometrię mas połączoną z chromatografią gazową
lub cieczową (GC-MS lub LC-MS).
II. 1. Bakterie Gram-ujemne
Ściany komórkowe różnych bakterii Gram-ujemnych mają bardzo zbliżoną budowę,
niezależnie od tego, czy należą do bakterii całkowicie niepatogennych (Rhodobacter,
Rhodomicrobium), nieszkodliwych lub chorobotwórczych dla ludzi i zwierząt, w zależności
od warunków środowiskowych, (Escherichia, Salmonella, Acinetobacter), czy patogennych
w stosunku do roślin (Xanthomonas, Pectobacterium, Erwinia). Jest to unikalna i wielofunkcyjna
struktura warunkująca charakterystyczny kształt bakterii, chroniąca je przed zmieniającym
się ciśnieniem osmotycznym, a także przed środowiskiem zewnętrznym, którym może być
np. układ odpornościowy gospodarza. Część elementów znajdujących się na powierzchni tych
mikroorganizmów stanowi materiał antygenowy, który może być rozpoznawalny przez układ
immunologiczny człowieka.
Ściana komórkowa zbudowana jest z dwóch podwójnych warstw lipidowych (błona
cytoplazmatyczna i błona zewnętrzna), pomiędzy którymi znajduje się przestrzeń
periplazmatyczna zawierająca 2-3 warstwy peptydoglikanu (Rys. 1) [2]. Peptydoglikan (PG),
zwany także mureiną, jest liniowym polimerem zbudowanym z reszt N-acetyloglukozaminy
(GlcNAc) i kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc) połączonych wiązaniami β-(1→4)
glikozydowymi. PG jest bardzo często modyfikowany przez bakterie poprzez podstawienie
grupami: N-acetylowymi (N-Ac) i O-acetylowymi (O-Ac), resztą kwasu glikolowego, a także
przez przyłączenie różnych polimerów ściany komórkowej. Działanie to ma na celu
zwiększenie odporności na lizozym (muramidaza), będącym głównym czynnikiem systemu
odporności wrodzonej gospodarza. Do reszt MurNAc przyłączone są krótkie łańcuchy reszt
peptydowych,
które
mogą
tworzyć
poprzeczne
mostki
pomiędzy
łańcuchami
GlcNAc→MurNAc. Tak połączony układ wykazuje strukturę elastycznej, rozciągliwej, ale
7
stosunkowo wytrzymałej sieci otaczającej błonę cytoplazmatyczną, nadając kształt bakterii
oraz zapewniając stabilność osmotyczną [3,4,5,6]
Rys. 1. Model ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych
Błona zewnętrzna zbudowana jest z dwóch warstw asymetrycznie ułożonych lipidów.
Warstwę wewnętrzną tworzą fosfolipidy, natomiast zewnętrzną - lipopolisacharydy (LPS).
Lipopolisacharyd jest glikokoniugatem stanowiącym bardzo ważny element ściany komórkowej
zarówno dla samych bakterii jak i dla zainfekowanych organizmów. Z jednej strony chroni
on bakterię przed działaniem soli kwasów żółciowych w jelitach oraz w jakimś stopniu przed
antybiotykami. Z drugiej zaś strony, fragmenty części korowej i O-specyficznego
polisacharydu (OPS) stanowią receptory dla bakteriofagów, co pośrednio może przyczynić
się do zniszczenia bakterii [1].
LPS patogennych bakterii, nazywany również endotoksyną, jest istotnym czynnikiem
chorobotwórczym. Wykazuje dosyć zróżnicowaną toksyczność, która jest uzależniona od jego
budowy. Czasami endotoksyny tych patogennych mikroorganizmów są nietoksyczne
lub bardzo mało toksyczne. Takim przykładem może być Helicobacter pylori, której LPS
wykazuje bardzo małą toksyczność i aktywność immunologiczną, ale z drugiej strony
przyczynia się do rozwoju chronicznej choroby wrzodowej [7].
LPS jest zbudowany z: lipidu A, który zakotwicza całą molekułę w błonie zewnętrznej
i reprezentuje jej endotoksyczny fragment, części rdzeniowej związanej kowalencyjnie
z lipidem A i regulującej jego toksyczność oraz O-swoistego polisacharydu (O-antygen,
OPS), połączonego kowalencyjnie z częścią korową i wykazującego silnie właściwości
antygenowe (Rys. 2) [8].
8
LPS nazywany jest typem S (ang. smooth - gładki), jeżeli w jego skład wchodzą lipid
A, część korowa oraz OPS lub typem R (ang. rough - szorstki), jeżeli pozbawiony jest części
O-antygenowej. R-LPS może być produkowany przez niektóre dzikie gatunki bakterii
(Campylobacter jejuni, Bordetella pertussis). Jednakże najczęściej jest otrzymywany
w laboratoriach badawczych w wyniku modyfikacji genetycznych i wykorzystywany do
badań właściwości biologicznych ściany komórkowej, które zależą m.in. od rodzaju
i struktury chemicznej elementów znajdujących się na jej powierzchni.
Rys. 2. Schemat budowy lipopolisacharydu
Lipid A, biorąc pod uwagę jego strukturę, jest najbardziej konserwatywną częścią LPSu bakterii Gram-ujemnych. Zbudowany jest z części cukrowej złożonej z połączonych
wiązaniem β-(1→6) dwóch reszt glukozaminy, które są podstawione resztami kwasów
tłuszczowych o różnej długości w pozycjach 3 i 3’ (estrowo) oraz w pozycjach 2 i 2’
(amidowo). Ponadto w pozycjach 1 i 4’ znajdują się grupy fosforanowe. Do grup
fosforanowych mogą być przyłączone m.in. dodatkowe reszty: fosforanowe, etanoloaminy,
arabinozaminy (Arap4N), czy galaktozaminy (GalpN) [9]. Liczba i rodzaj wymienionych
podstawników a także rozmieszczenie reszt kwasów tłuszczowych przy poszczególnych
resztach GlcN istotnie wpływa na przestrzenny kształt lipidu A, co przekłada się na jego
aktywność biologiczną, m.in. oddziaływanie z białkami systemu odpornościowego zarówno
zwierząt jak i roślin [8,10].
Region rdzeniowy (część korowa) LPS-u, w którego skład może wchodzić do 15 reszt
cukrowych, zbudowany jest z heksozowej części zewnętrznego (OC – outer core)
i wewnętrznej heptozowej (IC – inner core). Zawsze charakterystycznym elementem części
rdzeniowej jest Kdo (kwas-3-deoksy-oktulozonowy), który łączy się z lipidem A wiązaniem
α-(1→6), sam natomiast może być podstawiany jedną lub dwiema resztami Kdo w pozycji
C-4 oraz resztą heptozy w pozycji C-5, tworząc tzw. część korową wewnętrzną Hep-(1→7)-
9
Hep-(1→3)-Hep-(1→5)-Kdo. Część korowa zewnętrzna, zbudowana głównie z heksoz,
rozpoczyna się najczęściej od reszty Glc przyłączonej do końcowej reszty heptozy [→7)-Hep(1→] w pozycji C-3. Ten fragment LPS-u, może być podstawiony grupami fosforanowymi,
grupami acetylowymi lub resztami aminokwasów [11,12,13]. Ponadto, jak wspomniano
wcześniej, ma on regulujący wpływ na toksyczne właściwości lipidu A [14].
OPS, wykazujący silne właściwości antygenowe, stanowi najbardziej peryferyjną część
cząsteczki LPS. Jest on zbudowany z powtarzających się jednostek oligosacharydowych.
W skład każdej powtarzającej się jednostki wchodzi najczęściej 2-8 reszt cukrowych [15].
OPS charakteryzuje się bardzo dużą zmiennością w składzie cukrowym, rodzaju wiązań
i podstawników niecukrowych zarówno w obrębie rodzajów, jak i gatunków bakterii.
Najczęściej występującymi monosacharydami w OPS-ie są Glc i Gal, często można spotkać
Man, Rib, Ara i Xyl, 6-deoksycukry (Rha i Fuc), 3,6-di-deoksycukry (Abe, Tyv), aminocukry
(GlcN, GalN, QuiN, FucN),
kwasy uronowe (GlcA, GalA) i wiele innych. Należy
wspomnieć o różnych podstawnikach niecukrowych, do których należą m.in. O-Ac, N-Ac,
reszta kwasu mlekowego, czy kwasu pirogronowego [16].
Omawiając glikokoniugaty występujące w ścianie komórkowej bakterii Gramujemnych, należy wspomnieć o warstwie polisacharydowej, która może tworzyć otoczkę
wokół niektórych gatunków bakterii. Najczęściej w jej skład wchodzą polisacharydy kapsularne
(K-antigen – niem. Kapsul antigen; CPS – ang. capsular polysaccharide) oraz egzopolisacharydy
(EPS – ang. exopolysaccharide). Pierwsze z nich są zakotwiczone w warstwie lipidowej
błony zewnętrznej za pomocą łączników lipidowych, natomiast drugie nie są przyłączone
kowalencyjnie do ściany komórkowej bakterii, tylko tworzą rodzaj śluzowatej sieci
otaczającej komórkę bakteryjną [17]. Warstwa CPS, która może zawierać nawet do 90% wody,
chroni bakterię przed odwodnieniem, a także stanowi fizyczną barierę uniemożliwiającą
rozpoznanie epitopów znajdujących się na powierzchni ściany komórkowej przez elementy
systemu odpornościowego gospodarza. Jednocześnie, polisacharydy kapsularne znajdujące
się na powierzchni bakterii, wykazują silne właściwości antygenowe. CPS bierze udział
w produkcji biofilmów, ułatwiając adhezję bakterii do komórek gospodarza. CPS i EPS
wyizolowane z bakterii będących patogenami ludzkimi są wykorzystywane do produkcji
sprzężonych szczepionek [18].
Prace własne dotyczące wyodrębnienia i określenia struktury chemicznej glikanów
wyizolowanych z bakterii Gram-ujemnych podzielono na trzy części, na podstawie rodzaju
analizowanego materiału: OPS [H1-H3], część korowa [H4-H6] i polisacharydy kapsularne
[H7-H9].
10
II. 1. 1. OPS
Niezmiernie ważna jest dobra znajomość budowy ściany komórkowej bakterii
a w szczególności tych jej elementów, które odgrywają największą rolę w patogenezie.
W przypadku bakterii Gram-ujemnych są to polisacharydowe O-antygeny. Ustalenie struktury
chemicznej jednostek powtarzalnych O-polisacharydów jest istotne zarówno z punktu
widzenia chemotaksonomii, jak i diagnostyki czy produkcji odpowiednich szczepionek.
W cytowanych poniżej pracach opisano wyodrębnienie oraz badania strukturalne OPS-ów
dwóch bakterii będących patogenami ludzkimi (Cronobacter sakazakii 767 i Salmonella Mara
(O:39)) oraz jednej będącej patogenem roślinnym (Pectobacterium atrosepticum SCRI 1039).
Bakterie rodzaju Cronobacter na ogół nie są groźne dla człowieka, jednak mogą być
przyczyną zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków, zaś u dorosłych - powodować
zakażenia ran, dróg oddechowych i moczowych, a także posocznice. Pomimo, że zakażenia
wywołane przez te bakterie są stosunkowo rzadkie, to jednak ich skutki są bardzo poważne,
zwłaszcza u dzieci, u których śmiertelność sięga nawet 80%. Niezbędne jest usprawnienie
diagnostyki, ponieważ szybka identyfikacja przyczyny choroby bardzo pomaga w znalezieniu
odpowiedniego sposobu leczenia, a często i uratowanie życia (od momentu zakażenia do zgonu
niemowlęcia często nie mija więcej niż kilkanaście dni).
Szczep 767 bakterii C. sakazakii był wyizolowany od noworodka, który zmarł w wyniku
zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w inkubatorze na OIOM we Francji w 1994 roku.
Zaproponowana przez nas struktura chemiczna OPS-u (Rys. 3) opisuje jeden z pierwszych
polisacharydów opublikowanych dla bakterii Cronobacter sakazakii [H1].
HO
HO
HO
H3C
O
HO
HOOC
O
HO
HO
O
HO
HO
HO
HO
HO
O
O
O
CH
H O
2
75
O
O
NHAc
(50%) AcO
H3C
HO
O
O
O
HO
HO
O
HO
HO
H3C
O
OH
2
75
Rys. 3. Struktura chemiczna O-antygenu polisacharydowego wyizolowanego ze szczepu 767 bakterii
C. sakazakii
11
Chorobotwórcze dla człowieka i zwierząt, bakterie Salmonella wywołują zatrucia
pokarmowe (salmonellozy), które w zależności od zainfekowanego organizmu oraz od szczepu
bakterii mogą mieć przebieg łagodny lub ostry. Wszystkie szczepy tej bakterii (>2500)
zostały podzielone na 45 serogrup. OPS wyizolowany z Salmonella Mara jest pierwszym
w pełni strukturalnie scharakteryzowanym polisacharydem wyizolowanym z serogrupy O:39
(Rys. 4). Na podstawie uzyskanych rezultatów [H2], potwierdziliśmy obecność epitopów
antygenowych, które wcześniej zaproponowano w wyniku przeprowadzonych testów
serologicznych
OH
O
HO
OH
O
H3C
HO
AcHN
O
O
CH
4
OH O
H
H3C
O
OH
HO
OH
O
45
O
CH
2
NHAc
CH
4
44
Rys. 4. Struktura chemiczna O-antygenu polisacharydowego wyizolowanego z bakterii Salmonella Mara O:39
Oprócz wspomnianych patogenów ludzkich i zwierzęcych na uwagę zasługują
bakteryjne patogeny roślin, powodujące znaczne straty w rolnictwie. Izolowanie i określanie
struktury chemicznej OPS-ów z bakterii fitopatogennych ma na celu nie tylko taksonomiczną
klasyfikację mikroorganizmów, ale zrozumienie, ciągle stosunkowo mało poznanych,
mechanizmów oddziaływań bakteria-roślina [19].
Bakteria Pectobacterium atrosepticum SCRI 1039 wywołuje miękką zgniliznę oraz czarną
nóżkę ziemniaka. Jest ona również organizmem modelowym w badaniach nad mechanizmami
regulowania życia koloni bakterii, m.in. wytwarzaniem czynników wirulencji [20]. Określona
przez nas struktura chemiczna OPS-u wyizolowanego z tego mikroorganizmu przedstawiona
jest na Rys. 5 [H3].
12
HO
O
HO
HO
CH
2
O
OH
2
O
H3C
HO
HO
O
O
H3C
HO
O
O
11
O
H3C
OH
HO HO
HO
O
HO
O
CH
NHAc
Rys. 5. Struktura chemiczna O-antygenu polisacharydowego wyizolowanego z bakterii Pectobacterium
atrosepticum SCRI 1039; reszta fukozy podstawiona grupami O-Ac przy C-2 lub C-3, lub C-4
II. 1. 2. Część korowa
W ramach przeprowadzonych badań wyodrębniliśmy oraz określiliśmy strukturę
chemiczną części korowych roślinnego patogena Xanthomonas campestris pv. campestris,
oraz dwóch patogenów ludzkich (Escherichia coli K-12 i Yersinia enterocolitica O:3).
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) jest bakterią powodującą czarną
zgniliznę białej kapusty, uwidoczniającą się w postaci żółtych blaszek oraz postępujących
w głąb rośliny czerniejących wiązek przewodzących. Zaobserwowano dwa rodzaje reakcji
roślin na infekcje powodowane przez bakterie Xcc B100. Zainfekowane rośliny wykazywały
objawy opisane powyżej, albo były w stanie rozpoznać patogeny i uruchomić skuteczne reakcje
obronne. Na podstawie obserwacji niekontrolowanego wzrostu poziomu aktywnych form
tlenu, w tym H2O2 (tzw. stres oksydacyjny), stwierdzono, że także LPS wyizolowany ze ściany
komórkowej bakterii Xcc B100 jest zdolny do wywołania reakcji obronnych w modelowej
hodowli komórkowej tytoniu [21].
Celem naszych badań było określenie, czy oligosacharydy otrzymane po usunięciu
kwasów tłuszczowych z części lipidowej R-LPS-u będą wykazywać właściwości biologiczne.
Okazało się, że wyizolowane dwa oligosacharydy, różniące się obecnością dwóch reszt mannozy
(Rys. 6), są również w stanie wywołać reakcję obronną komórki tytoniu. Na podstawie
przeprowadzonych badań stwierdziliśmy, że pentasacharyd zbudowany z reszt Man, Glc, Kdo
oraz dwóch reszt GlcN zawiera fragment odpowiadający za niektóre biologiczne funkcje
całego LPS’u, czy wręcz całej komórki bakteryjnej [H4].
13
OH
OH
O
OH
HO
HO
OH
O
HO
O
OH
OH
O
O
HO
OH
O
O
OH
O
O
P
OH
OH
O
OH
H
OH
O
O
HO
OH
O
HO
P
OH
O
O
O
HO
O
NH2
HO
HO
O
NH2
O
OH
P
OH
O
Rys. 6. Struktura chemiczna oligosacharydu 1 wyizolowanego z LPS-u bakterii Xanthomonas campestris
pv. campestris. Struktura oligosacharydu 2 różni się brakiem dwóch końcowych reszt mannozy
Escherichia coli jest bakterią reprezentowaną przez wiele szczepów, które powszechnie
występują w okrężnicy ssaków. Szczep K-12 jest wrażliwy na działanie czynników
środowiskowych, nie jest zdolny do kolonizowania jelit ludzkich. Nie stwierdzono też jego
negatywnego wpływu na inne mikroorganizmy i rośliny. Ze względu na powyższe
właściwości, stanowi on modelową bakterię w mikrobiologii i jest jednym z najczęściej
badanych mikroorganizmów.
Komórki E. coli K-12, podobnie jak wielu innych Gram-ujemnych bakterii są otoczone
egzopolisacharydem (M-antygen; colanic acid (CA)), który w odróżnieniu od innych
polisacharydów kapsularnych nie jest ściśle związany ze ścianą komórkową, lecz tworzy
luźną strukturę okrywającą bakterię. Na podstawie wyników naszych badań, jako pierwsi
udowodniliśmy, że w sprzyjających warunkach biosyntezy LPS-u (indukcja CA oraz obecność
ligazy WaaL), CA zostaje przyłączony w pozycji C-7 do
L-glicero-D-manno-heptozy
znajdującej się w zewnętrznej części rdzeniowej LPS-u. Ponadto stwierdziliśmy, że przyłączony
M-antygen jest identyczny z wcześniej opublikowanymi strukturami zewnątrzkomórkowego
CA, jeżeli chodzi o sekwencję reszt cukrowych, różni się natomiast miejscem podstawienia
reszt cukrowych, konfiguracją anomerycznych atomów węgla oraz liczbą i dystrybucją grup
O-Ac [22,23]. Chemiczna struktura części korowej wraz z przyłączonym M-antygenem, została
przedstawiona na Rys. 7 [H5]. Wyniki naszych badań stanowią kolejny krok do zrozumienia
mechanizmów syntezy polisacharydów powierzchniowych bakterii.
14
Rys. 7. Struktura chemiczna oligosacharydu wyizolowanego z LPS’u ze szczepu K-12 bakterii E. coli.
Strzałką zaznaczono miejsce przyłączenia M-antygenu do części korowej; Py – kwas pirogronowy, P-EtN
- fosfoetanoloamina
Yersinia enterocolitica powoduje, najczęściej u dzieci do piątego roku życia, odzwierzęcą
chorobę zakaźną zwaną jersiniozą, objawiającą się ostrymi lub przewlekłymi dolegliwościami
przewodu pokarmowego. W lipopolisacharydzie bakterii Y. enterocolitica O:3 (Ye O:3)
stwierdzono, że OPS jest bezpośrednio przyłączony do wewnętrznej części rdzeniowej,
co odróżnia ten LPS od większości LPS-ów bakterii Gram-ujemnych, w których OPS
jest przyłączony do zewnętrznej części korowej. OC bakterii Ye O:3 jest oligosacharydem,
który jest ważnym czynnikiem wirulencji wpływającym na odporność tej komórki
na bakteriobójcze peptydy w pierwszym etapie infekcji [24].
W opublikowanej wcześniej strukturze oligosacharydu wyizolowanego z LPS Ye O:3,
pierwszą resztą zewnętrznej części korowej była reszta FucpNAc [25]. Wyniki naszych badań
strukturalnych oligosacharydów korowych, wyizolowanych z innych mutantów tej bakterii,
dostarczyły
sprzecznych
informacji
odnośnie
składu
cukrowego.
Zidentyfikowaliśmy
nieopisywaną we wcześniejszych badaniach resztę QuiN. Ponadto, w zależności od warunków
otrzymywania oligosacharydów, uzyskiwaliśmy różny stosunek ilościowy FucN i QuiN,
przy niezmienionych udziałach pozostałych reszt cukrowych. Na podstawie tych wyników
wysnuliśmy hipotezę, że OC LPS’u Ye O:3 nie zawiera wcześniej zidentyfikowanej FucpNAc
lecz 2-acetamido-2,6-dideoksy-D-ksylo-heks-4-ulopyranozę (Sugp), która w odpowiednich
warunkach może być redukowana do FucpNAc lub QuipNAc. Ponadto, w roztworze wodnym,
grupa ketonowa ulega hydratacji, tworząc gem-diol o masie molekularnej odpowiadającej
reszcie HexNAc. Przypuszczenia te zostały potwierdzone za pomocą eksperymentu, w którym
wysuszony LPS był inkubowany z H218O, a przygotowana w ten sposób próbka analizowana
za pomocą ESI-FTICR-MS. Na podstawie rezultatów szeregu przeprowadzonych analiz
zaproponowaliśmy strukturę części korowej bakterii Y. enterocolitica O:3 pokazaną na Rys. 8
[H6].
15
Analizując wyniki równolegle prowadzonych badań biologicznych, stwierdziliśmy,
że za syntezę zidentyfikowanej reszty Sugp odpowiada enzym WbcP. Ponadto udowodniliśmy,
że znajdująca się w położeniu aksjalnym grupa hydroksylowa związana z C-4 reszty Sugp
w bardzo istotny sposób wpływa na właściwości biologiczne opisywanego OC.
Rys. 8. Struktury chemiczne oligosacharydów LPS-u Y. enterocolitica O:3: a) – oligosacharyd korowy
wyizolowany po hydrolizie kwasów tłuszczowych (hydrazyna/KOH) z LPS-u Ye O3-R1; b) – skorygowana
struktura oligosacharydu stanowiącego fragment LPS-u bakterii Ye O:3. Wszystkie reszty cukrowe
występują w formie pierścieni sześcioczłonowych. Anomeryczne atomy węgla reszt A, C, D, E, G, I, J, L,
N, O posiadają konfigurację α, natomiast reszt B, F, H, K, K’, M, P konfigurację β; SugN - 2-acetamido2,6-dideoksy-D-xylo-heks-4-ulopiranoza
II. 1. 3. Polisacharydy kapsularne
W omawianych publikacjach opisaliśmy wyodrębnianie i analizę strukturalną
polisacharydów kapsularnych bakterii Burkholderia gladioli pv. agaricicola, Sinorhizobium
meliloti 1021 oraz Acinetobacter lwoffii F78.
Bakterie Burkholderia gladioli infekują zarówno ludzi jak i rośliny. Szereg szczepów
tej bakterii powoduje różne choroby na plantacjach m.in. cebuli, ryżu, mieczyków i irysów.
Szczep Burkholderia gladioli pv. agaricicola powoduje pojawienie się miękkiej zgnilizny
na owocnikach, charakteryzującej się naciekami na owocnikach pieczarki szlachetnej, co jest
przyczyną znacznych szkód w plantacjach tego grzyba. Na skutek dużych strat ekonomicznych
powodowanych przez te bakterie rozpoczęto prace mające na celu wyizolowanie
oraz chemiczne i biologiczne scharakteryzowanie toksycznych substancji odpowiedzialnych
16
za proces gnicia. Wstępne badania wskazały, że związki odpowiedzialne za gnicie
owocników należą do lipodepsipeptydów. Rozpoczęto również badania strukturalne LPS-u
oraz polisacharydu kapsularnego wyizolowanego z tej bakterii w celu określenia ich roli
w oddziaływaniach roślina-bakteria oraz wpływu na proces chorobotwórczy [H7,U2].
Struktura jednostki powtarzalnej polisacharydu kapsularnego wyizolowanego przez nas
ze ściany komórkowej bakterii Burkholderia gladioli pv. agaricicola dotychczas nie została
zidentyfikowana w innych bakteriach powodujących choroby roślin (Rys. 9) [H7].
H3C
H C
2
H4C
11
O
OH
H3C
HO
HO
O
OH
H3C
O
HO
O
OH
H3C
O
HO
O
OH
CH
4
41
O
CH
2
Rys. 9. Struktura chemiczna polisacharydu kapsularnego wyizolowanego z bakterii Burkholderia gladioli
pv. agaricicola
Bakterie Sinorhizobium meliloti są zdolne do kolonizowania roślin motylkowych,
wchodząc z nimi w rodzaj współżycia, zwanego symbiozą. Mikroorganizmy te produkują
różne glikokoniugaty, które są kluczowe w komunikowaniu się z rośliną oraz we wspomnianym
wcześniej procesie infekowania. Jednym z takich związków jest otaczający komórkę
polisacharyd kapsularny, którego rola w oddziaływaniach z rośliną nie jest do końca poznana.
Wcześniej
prowadzone
badania
wykazały
obecność
polisacharydów
kapsularnych
zbudowanych z reszty glukozy i kwasu 3-deoksy-D-manno-oktulozonowego (Kdo) [26].
Na podstawie wyników naszych badań strukturalnych zidentyfikowaliśmy dwa różne
homopolisacharydy kapsularne w szczepie 1021 bakterii Sinorhizobium meliloti. Jeden z nich
zbudowany z reszt →2)-β-D-Glcp-(1→, natomiast drugi - bardzo nietypowy - zbudowany z reszt
→7)-β-D-Kdop-(2→ (Rys. 10) [H8]. Ponadto udało się zidentyfikować fragment lipidowy
przyłączony do polisacharydowego łańcucha Kdo, którego obecność jednoznacznie wskazuje,
że opisywany glikokoniugat jest zakotwiczony w warstwie lipidowej błony zewnętrznej
ściany komórkowej.
17
OH
OH 20
OH
20
20
H2O
20
O
20
O
O
20
HO
20
HO
20
OH2
20
O
20
Rys. 10. Struktura chemiczna jednostki powtarzalnej polisacharydu kapsularnego wyizolowanego ze
szczepiu 1021 bakterii Sinorhizobium meliloti
Bakterie
z
rodzaju
Acinetobacter
są
bardzo
powszechnie
występującymi
mikroorganizmami, które mogą być izolowane z gleby, wody, ścieków, czy wręcz z powierzchni
ludzkiej skóry. Generalnie uważane są za bakterie niepatogenne, aczkolwiek szczepy należące
do tzw. kompleksu A. calcoaceticus-A. baumanii mogą powodować trudne w leczeniu
oportunistyczne infekcje szpitalne [27,28].
Szczep F78 bakterii Acinetobacter lwoffii został wyizolowanego z obory w Bawarii
w ramach projektu dotyczącego mikrobiologicznych czynników wpływających na uodpornienie
organizmów na alergię. W ramach naszych badań wyodrębniliśmy i strukturalne
scharakteryzowaliśmy nowy polisacharyd kapsularny, którego jednostka powtarzalna zbudowana
jest z trzech reszt cukrowych posiadających stosunkowo dużą liczbę grup aminowych [H9].
Każda grupa aminowa podstawiona jest grupą Ac lub resztą alaniny, lub resztą alaniny
podstawioną grupą Ac, lub resztą kwasu masłowego. Niestety ze względu na dużą
heterogenność niemożliwe było jednoznaczne przypisane wszystkich wymienionych
podstawników do poszczególnych grup aminowych (Rys. 11).
H3C
R2HN
CH
HO
NHR3
O
O
R4HN
NHR1
O
H3C
O
HOOC
O
NHAc
O
Rys. 11. Struktura chemiczna polisacharydu kapsularnego wyizolowanego ze szczepu F78 bakterii
Acinetobacter lwoffii. R1 – 3-HBA lub alanina, R2 – alanina lub 3-HBA, R3 – acetyl lub 3-HBA, R4 – 3HBA lub acetyl; HBA – kwas masłowy
18
II. 2. Bakterie Gram-dodatnie
Do bakterii Gram-dodatnich, podobnie jak do bakterii Gram-ujemnych, należy wiele
gatunków nieszkodliwych, ale również kilka bardzo patogennych (Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis). Ściana komórkowa bakterii Gramdodatnich różni się wyraźnie od ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, aczkolwiek
posiada kilka prawie identycznych elementów (Rys. 1 i Rys. 12). Na podobnie zbudowanej
i pełniącej zbliżone funkcje błonie cytoplazmatycznej umiejscowiony jest PG. Jego skład jest
analogiczny do PG-u bakterii Gram-ujemnych, przy czym znacznie różni się od niego
grubością utworzonej warstwy (odpowiednio 20-80 nm w porównaniu do <7 nm). Oprócz
funkcji mechanicznej, stanowi on miejsce, w którym zakotwiczone są inne polimery ściany
komórkowej takie jak kwasy tejchojowe, czy białka powierzchniowe.
Rys. 12. Model ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich
W zewnętrznej części ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich można wyróżnić
dwa charakterystyczne glikokoniugaty: kwas lipotejchojowy (LTA) i kwas tejchojowy
(WTA) [29]. LTA i WTA zbudowane są najczęściej z reszt glicerolu lub reszt rybitolu
połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi i tworzącymi długie łańcuchy. Reszty rybitolu
lub glicerolu są często podstawiane różnymi monosacharydami, krótkimi oligosacharydami,
resztą alaniny lub innych aminokwasów. LTA zakończony jest krótkim łącznikiem
oligosacharydowym, do którego przyłączone są kwasy tłuszczowe. Łącznik ten jest
zakotwiczony w błonie cytoplazmatycznej, natomiast polimeryczna część LTA „przebija się”
przez warstwę PG, wystając ponad powierzchnię ściany komórkowej. Polimeryczny łańcuch
WTA, podobnie jak LTA, zakończony jest resztą disacharydową zbudowaną z ManNAc
19
i GlcNAc, która z kolei przyłączona jest wiązaniem fosfodiestrowym do C-6 jednej z reszt
MurNAc będącej elementem PG. Zarówno LTA jak i WTA odgrywają dużą rolę
w oddziaływaniach komórki bakteryjnej z receptorami gospodarza, regulują homeostazę
kationów oraz wpływają na fizykochemiczne właściwości ściany komórkowej [1].
Dodatkowo, na powierzchni bakterii Gram-dodatnich, podobnie jak u bakterii Gramujemnych, mogą znajdować się polisacharydy kapsularne, które spełniają analogiczną rolę
i mogą mieć zbliżoną budowę. Większość bakterii Gram-dodatnich produkuje również
egzopolisacharydy, które wchodzą w skład tworzonych biofilmów.
W pracach opisywanych w autoreferacie przedstawiono wyniki badań glikokoniugatów
wyodrębnionych z Gram-dodatnich bakterii rodzaju Enterococcus [H10-H14].
Patogenne gatunki E. faecium i E. faecalis wywołują około 10% wszystkich klinicznych
infekcji bakteryjnych. Do najpoważniejszych chorób powodowanych przez enterokoki należą:
posocznica (bakteriemia), zapalenia układu moczowego (bakteriuria), mięśnia sercowego
(endocarditis), opon mózgowo-rdzeniowych oraz pęcherzyka i dróg żółciowych, a także
zakażenie ran po zabiegach chirurgicznych oraz infekcje przy zabiegach diagnostycznych
lub leczniczych w obrębie układu moczowego,
Stale rośnie liczba enterokokowych szczepów opornych na powszechnie dostępne
antybiotyki. Ostatnie badania wykazały, że w niektórych krajach europejskich (m.in.
Portugalia, Cypr, Irlandia, Włochy) ponad 20% szpitalnych izolatów E. faecium jest oporna
na glikopeptydowe antybiotyki, będące podstawą terapii przeciwdrobnoustrojowej [30].
Enterokoki oporne na wankomycynę (VRE - Vancomycin-Resistan Enterococcus), uważaną
za lek ostatniej szansy w ciężkich infekcjach, powodują znaczącą zachorowalność
i śmiertelność, zwłaszcza wśród pacjentów po przebytych ciężkich chorobach, długotrwałej
terapii antybiotykowej i długiej hospitalizacji. Pojawienie się wśród enterokoków odporności
na wankomycynę, w połączeniu ze wzrastającym poziomem odporności na inne klasy
antybiotyków, powoduje, że obecne możliwości terapeutyczne są znacznie ograniczone.
W związku z tym, niezbędne jest rozwinięcie immunoterapeutycznego podejścia do kontroli
infekcji powodowanych przez enterokoki. Najlepszym sposobem zapobiegania i leczenia tego
typu chorób są odpowiednie szczepionki. Do ich przygotowania niezbędna jest znajomość
struktury chemicznej antygenowych polisacharydów, które zostaną przyłączone do nośnika
białkowego.
Dotychczas ukazała się jedna praca, w której przedstawiono kompletną strukturę
polisacharydu kapsularnego wyizolowanego z bakterii E. faecium i E. faecalis [31]. Jak się
jednak później okazało, w zaproponowanej strukturze popełniono błąd dotyczący sposobu
20
połączenia zidentyfikowanych składników w jednostce powtarzalnej. Ponadto w latach 70tych ubiegłego wieku opublikowano struktury polisacharydów wyizolowanych z E. faecalis
[32,33], jednakże trudno jest do nich się odnieść, ponieważ do analiz wykorzystano
stosunkowo proste metody chemiczne, bez metod spektroskopowych. W każdym bądź razie
na podstawie uzyskanych przez nas wyników nie udało się potwierdzić obecności takich
polisacharydów.
W ramach naszych badań wyizolowano szereg polisacharydowych antygenów ze ściany
komórkowej szczepów bakterii E. faecalis należących do serotypów CPS-A - CPS-D,
wg. systemu klasyfikacji zaproponowanego przez Hufnagel i współpracowników [34].
Ze szczepu 12030 wyodrębniliśmy kwasy lipotejchojowe, w których, na podstawie
wyników analizy strukturalnej, zidentyfikowaliśmy cztery różne jednostki powtarzalne
(Rys. 13). Jedna z nich, zbudowana z reszty glicerolu, podstawionego resztą kojibiozy
w pozycji 2, a ponadto z dwiema resztami alaniny związanymi estrowo z dwiema resztami
glukozy w pozycjach C-6 (Rys. 13d), stanowi zupełnie nowy element strukturalny
polisacharydów wyizolowanych z enterokoków [H10]. Obecność takiego LTA jest niezwykle
intrygujące ze względu na obecność reszt alaniny, która jest wykorzystywana przez bakterie
do modulowania ładunku zgromadzonego na powierzchni ściany komórkowej, w zależności
od warunków środowiskowych [H10]. Trzy pierwsze struktury (Rys. 13a-c) zostały
zaproponowane już wcześniej [35]. Jednakże dopiero w naszej pracy po raz pierwszy w pełni
je scharakteryzowaliśmy za pomocą metod chemicznych i spektroskopowych. Ponadto
na podstawie wyników naszych badań zweryfikowaliśmy błędną strukturę oraz pochodzenie
wcześniej opisanego polisacharydu kapsularnego [31]. Okazało się, że opisany przez autorów
polisacharyd jest w rzeczywistości kwasem lipotejchojowym, który został pozbawiony części
lipidowej w wyniku zastosowanej procedury wyodrębniania, sprzyjającej odszczepieniu tego
fragmentu cząsteczki [H10].
a)
O
O
21
O
b)
OH
O
O
P
P
OH
O
O
H2N
HO
d)
c)
OH
OH
O
OH
HO
HO
O
H2N
O
HO
HO
O
P
O
O
O
O
OH
O
O
O
HO
HO
O
H2N
OH
O
O
HO
HO
O
P
O
O
OH
O
O
Rys. 13. Struktury chemiczne jednostek powtarzalnych LTA wyizolowanych ze szczepu 12030 bakterii
Enterococcus faecalis
Jak wspomniano wcześniej, reszty alaniny przyłączone do LTA są wykorzystywane
przez bakterie do modulowania ładunku zgromadzonego na powierzchni ściany komórkowej.
Kwasy lipotejchojowe pozbawione reszt alaniny wykazują silny ładunek ujemny pochodzący
od grup fosforanowych, podczas gdy podstawienie resztami alaniny kompensuje ten ładunek
poprzez obecność ładunku dodatniego (kation amoniowy). Skłoniło to nas do porównania
właściwości biologicznych i struktury LTA wyodrębnionych ze szczepów dzikich oraz LTA
wyizolowanych z mutantów pozbawionych genu dltA, odpowiedzialnego za przyłączanie
alaniny. Do badań wykorzystano m.in. opisany powyżej szczep 12030 E. faecalis oraz
przygotowany jego mutant 2030∆dltA [H11]. Kwasy tejchojowe wyizolowane z mutanta
poddane zostały kompletnej analizie strukturalnej. Na podstawie uzyskanych wyników
potwierdziliśmy strukturę zasadniczego łańcucha polisacharydowego oraz brak przyłączonych
reszt alaniny. W porównaniu do szczepu dzikiego, otrzymany mutant produkował znacząco
mniej biofilmu oraz był bardziej wrażliwy na działanie przeciwbakteryjnych peptydów
(nizyna, polimyksyna B). Na podstawie tych wyników można stwierdzić, że podstawienie
kwasów tejchojowych resztami alaniny ma istotny wpływ na patogenezę bakterii,
co prowadzi do zwiększenia produkcji biofilmu, obniżenia odporności na przeciwbakteryjne
peptydy i zwiększenia adhezji do komórek eukariotycznych [H11].
Ze szczepów E. faecalis typ 2 i FA2-2 (serotyp CPS-C) oraz typ 5 (serotyp CPS-D)
wyodrębniliśmy i strukturalnie scharakteryzowaliśmy polisacharydy kapsularne (Rys. 14).
Zasługują one na szczególną uwagę ze względu na obecność w jednostce powtarzającej się
22
stosunkowo rzadko spotykanej w strukturach bakteryjnych reszty Galf, z którą jest eterowo
związana w pozycji C-3 reszta kwasu mlekowego [H12]. Jest to pochodna cukrowa pierwszy
raz zidentyfikowana w glikokoniugatach bakteryjnych.
OH
OH
a)
b)
O
O
HO
HO
O
O
O
Ac-O
O
OH
HO
O-LA
OH
O-LA
O
O
OH
OH
Rys. 14. Struktury chemiczne jednostek powtarzalnych polisacharydów kapsularnych wyizolowanych z
bakterii Enterococcus faecalis: a) – szczep type 2, b) szczepy type 5 i FA2-2
Pomimo licznych prób, nie udało się wyizolować takich samych lub podobnych
polisacharydów kapsularnych ze szczepów należących do serotypów CPS-A oraz CPS-B.
Dla wszystkich wyizolowanych i strukturalnie scharakteryzowanych polisacharydów
kapsularnych oraz kwasów lipotejchojowych przeprowadzone zostały badania biologiczne
w ramach współpracy międzynarodowej z Uniwersytetem we Freiburgu (Niemcy)
[H10,H11,H12]. Materiał ten posłużył do produkcji przeciwciał króliczych, które
wykorzystano w szeregu testów immunologicznych. Wyniki tych badań jednoznacznie
wykazały, że opisywane polisacharydy są celem przeciwciał opłaszczających (opsonin)
wyprodukowanych przeciwko antygenowym fragmentom ściany komórkowej szeregu
szczepów E. faecalis. Uzyskane wyniki pozwoliły również określić budowę zewnętrznej
powierzchni
ściany
komórkowej
bakterii
pod
kątem
obecności
składników
polisacharydowych. Okazało się, że najbardziej eksponowanym elementem ściany
komórkowej szczepów bakterii należących do serotypów CPS-A i CPS-B są kwasy
lipotejchojowe, natomiast serotypów CPS-C i CPS-D polisacharydy kapsularne (Rys. 15)
[H10,H11,H12].
Na podstawie uzyskanych wyników, jednoznacznie stwierdzono, że polisacharydy
kapsularne wyizolowane z serotypów CPS-C i CPS-D są obiecującym materiałem
do produkcji szczepionek przeciwko znacznej liczbie szczepów E. faecalis.
23
Rys. 15. Model budowy ściany komórkowej bakterii Enterococcus : a) - szczepy należące do serotypów A i
B, b) - szczepy należące do serotypów C i D
W ramach badań bakterii rodzaju Enterococcus wyizolowano również nietypowe kwasy
tejchojowe ze szczepu 12030 E. faecalis (Rys. 16) oraz szczepu U0317 E. faecium (Rys. 17)
[H13,H14]. Przy czym, struktura kwasu tejchojowego wyodrębnionego ze szczepu U0317
jest pierwszym opublikowanym polisacharydem ściany komórkowej bakterii E. faecium.
Struktura większości kwasów tejchojowych produkowanych przez bakterie Gram-dodatnie
oparta jest na polimerycznych łańcuchach →(1→5)-Rbo-P- lub →(1→3)-Gro-P-, z którymi
mogą być związane różne podstawniki (Rbo – rybitol, Gro – glicerol). Wspomniane powyżej
WTA mają bardziej złożoną budowę, w wyniku włączenia dodatkowych reszt cukrowych do
głównego łańcucha polisacharydowego.
HO
O
O
HO
HO
OH OH
OH
O
O
HO
OH
OH
O
O
O
NHAc
O
HO
HO
OH
O
HO
O
NHAc
O
HO
P
O
O
OH
OH
OH
Rys. 16. Struktura chemiczna jednostki powtarzalnej kwasu tejchojowego wyizolowanego ze szczepu
12030 bakterii Enterococcus faecalis.
24
R
HO
O
O
HO
HO
OH
OH
O
AcHN
O
O
NHAc
O
O
P
OH
OH
Rys. 17. Struktura chemiczna jednostki powtarzalnej kwasu tejchojowego wyizolowanego ze szczepu
U0317 bakterii Enterococcus faecium.
Wyizolowane kwasy tejchojowe poddano również badaniom biologicznym, niestety
uzyskane wyniki nie były tak zachęcające jak dla wcześniej opisanych polisacharydów
kapsularnych. Wynikało to z faktu, że oba polisacharydy nie są wyeksponowane na powierzchni
ściany komórkowej bakterii, przez co niemożliwe było otrzymanie odpowiednich przeciwciał
skierowanych przeciwko tym cząsteczkom. Jednakże wyizolowane i strukturalnie
scharakteryzowane polisacharydy stanowią istotny krok w kierunku zdefiniowania
oddziaływań na poziomie molekularnym pomiędzy enterokokowymi polisacharydami
i receptorami gospodarza.
W dalszej perspektywie, po otrzymaniu specyficznych surowic względem różnych
polisacharydów wyodrębnionych ze ściany komórkowej bakterii z rodzaju Enterococcus,
zostanie zaktualizowana i rozszerzona jedna z obecnie wykorzystywanych serologicznych
klasyfikacji szczepów enterokoków [34].
Docelowo, planowane jest wraz z partnerami naukowymi (Klinika Uniwersytecka
we Freiburgu (Niemcy) oraz Centrum Naukowe w Borstel (Niemcy)) wykorzystanie
antygenów
przyłączonych
do
białkowych
nośników
jako
szczepionek
przeciwko
enterokokowym infekcjom polisacharydowych. Należy wspomnieć, że pierwsze próby
wykonane dla E. faecalis przyniosły obiecujące rezultaty. Część wyników przedstawionych
powyżej badań strukturalnych i immunochemicznych została opatentowana, a uzyskanymi
patentami spore zainteresowanie wykazują firmy farmaceutyczne [P1,P2,P3].
25
III. Podsumowanie
Wyniki badań przedstawione w autoreferacie dotyczą wyodrębniania i określenia
struktury chemicznej następujących glikanów i glikokoniugatów:
Bakterie Gram-ujemne:
OPS
Cronobacter sakazakii 767
Salmonella Mara (O:39)
Pectobacterium atrosepticum SCRI 1039
Część korowa
Xanthomonas campestris pv. campestris B100
Escherichia coli K-12
Yersinia enterocolitica Serotype O:3
Polisacharyd kapsularny
Burkholderia gladioli pv. agaricicola
Sinorhizobium meliloti 1021
Acinetobacter lwoffii F78
Bakterie Gram-dodatnie:
Kwas lipotejchojowy
Enterococcus faecalis 12030
Polisacharyd kapsularny
Enterococcus faecalis typ 2, typ 5, FA2-2
Kwas tejchojowy
Enterococcus faecalis 12030
Enterococcus faecium U0317
Dla wyizolowanych związków przeprowadzono badania biologiczne. Uzyskane wyniki
przyczyniły się do lepszego zrozumienia oddziaływań bakteria patogenna-gospodarz i mogą
być zastosowane w chemotaksonomii i diagnostyce. Ponadto, wyniki badań strukturalnych
i immunologicznych przeprowadzonych dla polisacharydów kapuslarnych i kwasów
lipotejchojowych wyizolowanych z bakterii rodzaju Enterococcus mogą być wykorzystane
do produkcji szczepionek przeciwko tym bakteriom.
26
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych
Pozostałe osiągnięcia naukowo-badawcze można podzielić na następujące grupy
tematyczne:
♦ glikany i glikokoniugaty pochodzenia bakteryjnego – określenie struktury chemicznej
glikolipidów bakterii Tsukamurella pulmonis [U1] oraz OPS’ów wyizolowanych
z bakterii Burkholderia gladioli pv. agaricicola [U2], Salmonella Abortusequi [U3],
Salmonella Anatum [U4] i Salmonella Aberdeen [U5];
♦ chityna i chitozan – rozmieszczenie grup acetylowych w niskocząsteczkowych
chitozanach wykorzystywanych w medycynie [U6], praca przeglądowa opisująca
zastosowanie metod spektroskopowych do analizy strukturalnej chityny i chitozanu
[U7] oraz rozdział w książce dotyczący wpływu struktury chemicznej i właściwości
fizykochemicznych chityny i chitozanu na ich aktywność biomedyczną [U8];
♦ ciecze jonowe – badanie degradacji [U9,U10] oraz mobilności w glebach [U11];
♦ lotne kwasy tłuszczowe – oznaczanie w próbkach wody [U12];
♦ polisacharydy bakterii z rodzaju Enterococcus – opatentowanie części wcześniej
opisanych badań strukturalnych i immunologicznych [P1,P2,P3].
Ponadto przed uzyskaniem tytułu doktora ukazała się jedna publikacja przedstawiająca
badania dotyczące mechanizmu i kinetyki reakcji acetolizy pochodnych mannozy [U13]
oraz dwie publikacje opisujące strukturalne i immunologiczne badania OPS’u wyizolowanego
z bakterii Salmonella Haarlem [U14,U15].
Publikacje uzupełniające
U1. Paściak M., Kaczyński Z., Lindner B., Holst O., Gamian A. Immunochemical studies
of trehalose-containing major glycolipid from Tsukamurella pulmonis. Carbohydr. Res.
2010, 345, 1570-1574. IF2010=1.898
U2. Karapetyan G., Kaczyński Z., Iacobellis N.S., Evidente A., Holst O. The structure of
the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide from Burkholderia gladioli pv.
agaricicola. Carbohydr. Res. 2006, 341, 930-934. IF2006=1.703
U3. Kaczyński Z.,* Gajdus J., Dziadziuszko H., Stepnowski P. Chemical structure of the
somatic antigen isolated from Salmonella Abortusequi (O4). J. Pharm. Biomed. Anal.
2009, 50, 679-682. IF2009=2.453
U4. Gajdus J., Kaczyński Z.*, Czerwicka M., Dziadziuszko H., Szafranek J. Chemical
structure of the Salmonella Anatum (O:3,10) O-antigen. Polish J. Chem. 2008, 82,
1393-1398. IF2008=0.518
27
U5. Szafranek J., Kaczyńska M., Kaczyński Z., Gajdus J., Czerwicka M., Dziadziuszko H.,
Głośnicka R. Structure of the Polysaccharide O-Antigen of Salmonella Aberdeen (O :
11). Polish J. Chem. 2003, 77, 1135-1140. IF2003=0.515
U6. Kumirska J., Weinhold M.X., Sauvageau J.C.M., Thöming J., Kaczyński Z., Stepnowski P.
Determination of the pattern of acetylation of low molecular weight chitosan used in
biomedical applications. J. Pharm. Biomed. Anal. 2009, 50, 587-590. IF2009=2.453
U7. Kumirska J., Czerwicka M., Kaczyński Z., Bychowska A., Brzozowski K., Thöming J.,
Stepnowski P. Application of Spectroscopic Methods for Structural Analysis of Chitin
and Chitosan. Mar. Drugs 2010, 8, 1567-1636. IF2010=3.471
U8. Kumirska J., Weinhold M.X., Czerwicka M., Kaczyński Z., Bychowska A.,
Brzozowski K., Thöming J., Stepnowski P. Influence of the chemical structure and
physicochemical properties of chitin- and chitosan-based materials on their biomedical
activity. W książce "Biomedical Engineering, Trends, Researches and Technologies",
ISBN 978-953-307-513-6, 2011.
U9. Siedlecka E.M., Gołębiowski M., Kaczyński Z., Czupryniak J., Ossowski T., Stepnowski P.
Degradation of ionic liquids by fenton reaction; the effect of anions as counter and
background ions, Applied Catalysis B, Environmental 2009, 91, 573-579. IF2009=5.252
U10. Siedlecka E.M., Mrozik W., Kaczyński Z., Stepnowski P. Degradation of 1-butyl-3methylimidazolium chloride ionic liquid in a Fenton-like system. J. Hazard. Mater.
2008, 154, 893-900. IF2008=2.975
U11. Mrozik W., Jungnickel C., Ciborowski T., Pitner W.R., Kumirska J., Kaczyński Z.,
Stepnowski P. Predicting mobility of alkylimidazolium ionic liquids in soils. J. Soil
Sediment. 2009, 9, 237-245. IF2009=2.613
U12. Siedlecka E.M., Kumirska J., Ossowski T., Glamowski P., Gołębiowski M., Gajdus J.,
Kaczyński Z., Stepnowski P. Determination of Volatile Fatty Acids in Environmental
Aqueous Samples. Polish J. of Environ. Stud. 2008, 17, 351-356. IF2008=0.963
U13. Kaczmarek J., Kaczyński Z., Trumpakaj Z., Szafranek J., Bogalecka M., Lonnberg H.
Sulfuric acid-catalyzed acetolysis of anomeric methyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-Dmannopyranosides: kinetics and mechanism. Carbohydr. Res. 2000, 325, 16-29.
IF2000=1.606
U14. Szafranek J., Gajdus J., Kaczyński Z., Dziadziuszko H., Kunikowska D., Głośnicka R.,
Yoshida T., Vihanto J., Pihlaja K. Immunological and chemical studies of Salmonella
Haarlem somatic antigen epitopes. I. Structural studies of O-antigen. FEMS Immunol
Med Microbiol. 1998, 21, 243-252. IF1998=1.075
U15. Dziadziuszko H., Kunikowska D., Głośnicka R., Gajdus J., Kaczyński Z., Szafranek J.
Immunological and chemical studies of Salmonella Haarlem somatic antigen epitopes.
II. Serological investigations. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998, 21, 253-259.
IF1998=1.075
28
Patenty
P1.
P2.
P3.
Huebner J., Holst O., Theilacker C., Kaczyński Z., Enterococcus faecalis and/or
enterococcus faecium antigen, WO/2008/058706.
Huebner J., Holst O., Theilacker C., Kaczyński Z., Novel Cell Wall Components of
Enterococci and Uses Thereof, WO/2011/088843.
Huebner J., Theilacker C., Kaczyński Z., Holst O., Rhamno-polysaccharide from
Enterococcus faecium clonal complex 17 and uses thereof. Number 11004387.4-2406
(zgłoszenie patentowe)
Literatura
1. Holst O., Moran A., Brennan P. Overview of the glycosylated components of the bacterial
cell envelope. Moran A.P., Holst O., Brennan P.J., von Itzstein M. Microbial glycobiology.
Structures, relevance and applications. Elsevier, Amsterdam, 2009, 3-13.
2. Beveridge T.J. Structures of Gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.
J. Bacteriol. 1999, 181, 4725-4733.
3. Weidel W., Pelzer H. Bag-shaped macromolecules-a new outlook on bacterial cell walls.
Adv. Enzymol. 1964, 26, 193-232.
4. Koch A.L., Woeste S.W. The elasticity of the sacculus of Escherichia coli. J. Bacteriol.
1992, 174, 4811-4819.
5. Vollmer W., Blanot D., De Pedro M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS
Microbiol. Rev. 2008, 32, 149–167.
6. Vollmer W., Seligman S.J. Architecture of peptidoglycan: more data and more models.
Trends in Microbiol. 2010, 18, 59-66.
7. Moran A.P. Lipopolysaccharide in bacterial chronic infection: insights from Helicobacter
pylori lipopolysaccharide and lipid A. Int. J. Med. Microbiol. 2007, 297, 307-319.
8. Rietschel E.T., Kirikae T., Schade F.U., Mamat U., Schmidt G., Loppnow H., Ulmer A.J.,
Zahringer U., Seydel U., Di Padova F., Schreier M., Brade H. Bacterial endotoxin:
molecular relationship of structure to activity and function. FASEB J. 1994, 8, 217-225.
9. Alexander C., Zähringer U. Chemical structure of lipid A - the primary immunomodulatory
center of bacterial lipopolysaccharides. Trends Glycosci. Glyc. 2002, 14, 69–86.
10. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell 2006,
124, 783-801.
11. Holst O. Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides – an update. Trends
Glycosci. Glyc. 2002, 14, 87-103.
29
12. Holst O. The structures of core regions from enterobacterial lipopolysaccharides – an
update. FEMS Microbiol. Lett. 2007, 271, 3–11.
13. Holst O. Structure of the lipopolysaccharide core region. Knirel Y.A., Valvano M.A.,
Bacterial Lipopolysaccharides: Structure, Chemical Synthesis, Biogenesis and Interaction
with Host Cells. Springer-Verlag, Wien, 2011, 21-39.
14. Holst O., Molinaro A. Core region and lipid A components of lipopolysaccharides. Moran
A.P., Holst O., Brennan P.J., von Itzstein M. Microbial glycobiology. Structures, relevance
and applications. Elsevier, Amsterdam, 2009, 29–55
15. Knirel Y.A. Kotchetkov N.K. The structure of lipopolisaccharides of Gram-negative bacteria,
III. The stucture of O-antigens: a review. Biochemistry (Moscow) 1994, 59, 1325-1383.
16. Knirel Y.A. O-Specific polysaccharides of Gram-negative bacteria. Moran A.P., Holst O.,
Brennan P.J., von Itzstein M. Microbial glycobiology. Structures, relevance and
applications. Elsevier, Amsterdam, 2009, 57-73.
17. Cescutti P. Bacterial capsular polysaccharides and exopolysaccharides. Moran A.P., Holst
O., Brennan P.J., von Itzstein M. Microbial glycobiology. Structures, relevance and
18. Jennings H.J., Pon R.A. Bacterial polysaccharide vaccines: Glycoconjugates and peptidemimetics. Moran A.P., Holst O., Brennan P.J., von Itzstein M. Microbial glycobiology.
Structures, relevance and applications. Elsevier, Amsterdam, 2009, 933-956.
19. Erbs G., Molinaro A., Dow J.M., Newman M.A. Lipopolysaccharides and Plant Innate
Immunity. Wang X., Quinn P.J. Endotoxins: Structure, Function and Recognition.
Springer, Dordrecht, 2010, 387-403.
20. Liu H., Coulthurst S.J., Pritchard L., Hedley P.E., Ravensdale M., Humphris S., Burr T.,
Takle G., Brurberg M.B., Birch P.R.J., Salmond G.P.C., Toth I.K. Quorum Sensing
Coordinates Brute Force and Stealth Modes of Infection in the Plant Pathogen
Pectobacterium atrosepticum. PLoS Pathog. 2008, 4, e1000093.
21. Meyer A., Pühler A., Niehaus K. The lipopolysaccharides of the phytopathogen
Xanthomonas campestris pv. campestris induce an oxidative burst reaction in cell cultures
of Nicotiana tabacum. Planta 2001, 213, 214–222.
22. Garegg P.J., Lindberg B., Onn T., Sutherland I.W. Structural Studies on the M-Antigen
from Two Mucoid Mutants of Salmonella typhimurium. Acta Chem. Scand. 1971, 25,
2103–2108.
30
23. Cescutti P., Toffanin R., Pollesello P., Sutherland I.W. Structural determination of the
acidic exopolysaccharide produced by a Pseudomonas sp. strain 1.15. Carbohydr. Res.
1999, 315, 159 –168.
24. Skurnik M., Venho R., Bengoechea J.A., Moriyón I. The lipopolysaccharide outer core of
Yersinia enterocolitica serotype O:3 is required for virulence and plays a role in outer
membrane integrity. Mol. Microbiol. 1999, 31, 1443-1462.
25. Radziejewska-Lebrecht J., Skurnik M., Shashkov A.S., Brade L., Rozalski, A,.
Bartodziejska B., Mayer H. Immunochemical studies on R mutants of Yersinia
enterocolitica O:3. Acta Biochim. Pol. 1998, 45, 1011-1019.
26. Reuhs B.L., Carlson R.W., Kim J.S. Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3deoxy-D-manno-2-octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally
analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J.
Bacteriol. 1993, 175, 3570-3580.
27. Bergogne-Berezin E., Towner K. J., Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens:
microbiological, clinical, and epidemiological features Clin. Microbiol. Rev. 1996, 9, 148-165.
28. Dijkshoorn L., Nemec A., Seifert H. An increasing threat in the hospital: multidrug
resistant Acinetobacter baumannii. Nat. Rev. Microbiol. 2007, 5, 939-951.
29. Kohler T., Xia G., Kulauzovic E., Peschel A. Teichoic Acids, Lipoteichoic Acids and
Related Cell Wall Glycopolymers of Gram-Positive Bacteria. Moran A.P., Holst O.,
Brennan P.J., von Itzstein M. Microbial glycobiology. Structures, relevance and
30. European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS). EARSS annual
report 2010. http://www.rivm.nl/earss/result/Monitoring_reports.
31. Wang Y., Huebner J., Tzianabos A.O., Martirosian G., Kasper D.L., Pier G.B. Structure
of an antigenic teichoic acid shared by clinical isolates of Enterococcus faecalis and
vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Carbohydr. Res. 1999, 316, 155-160.
32. Pazur J.H., Cepure A., Kane J.A., Hellerquist C.G. Glycans from streptococcal cell walls.
The molecular structure of an antigenic diheteroglycan of glucose and galactose from
Streptococcus faecalis. J. Biol. Chem. 1973, 248, 279–284.
33. Pazur J.H., Anderson J.S., Karakawa W.W. Glycans from streptococcal cell walls.
Immunological and chemical properties of a new diheteroglycan from Streptococcus
faecalis. J. Biol. Chem. 1971, 246, 1793–1798.
34. Hufnagel, M., Hancock, L.E., Koch, S., Theilacker, C., Gilmore, M.S., Huebner, J.
Serological and genetic diversity of capsular polysaccharides in Enterococcus faecalis.
J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 2548-57.
35. Wicken A. J., Baddiley J. Structure of intracellular teichoic acids from group D
streptococci. Biochem. J. 1963, 87, 54–62.
31

Autoreferat

Transkrypt

Podobne dokumenty

Budowa komórki bakterii oraz grzybów. Zasady mikroskopowania.

gruźlica fagocytoza

Mechanizm niszczenia bakterii przy udziale nano

Pytania do egzaminu licencjackiego 2012 1. Adaptacje związane z