ProSpecT C. difficile Toxin A/B Microplate Assay [PL]
Transkrypt
ProSpecT C. difficile Toxin A/B Microplate Assay [PL]
jest niedostateczne stężenie toksyny do wiązania koniugatu enzymu i nie pojawia się żaden produkt reakcji kolorymetrycznej. Test mikropłytkowy ProSpecTTM C. difficile Toxin A/B 4 DEFINICJE SYMBOLI Numer katalogowy R244596 .....................96 testów 1 Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro PL Zawiera ilość materiału wystarczającą do <n> badań PRZEZNACZENIE Sprawdzić w instrukcji stosowania (IFU) Test mikropłytkowy ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B jest immunoenzymatycznym testem jakościowym (EIA) przeznaczonym do wykrywania obecności toksyn A i B C. difficile w próbkach stolca pacjentów, u których podejrzewa się zakażenie Clostridium difficile. Test jest przeznaczony do stosowania jako pomoc w rozpoznawaniu chorób związanych z Clostridium difficile (CDAD). 2 Temperatury graniczne (temperatury przechowywania) Kod serii (numer serii) Stosować do (data ważności) Producent OMÓWIENIE Rozcieńczona próbka Clostridium difficile, gram-dodatnia beztlenowa bakteria tworząca formy przetrwalnikowe, jest najczęstszą przyczyną chorób biegunkowych związanych z kuracją antybiotykową1,2. Choroba występuje, gdy leczenie antybiotykami o szerokim spektrum działania wpływa na florę bakteryjną żołądka i jelit i umożliwia oportunistyczny wzrost szczepów toksynotwórczych Clostridium difficile. Toksyny produkowane przez Clostridium difficile, oznaczone jako toksyna A i toksyna B, powodują silne działanie enterotoksyczne i cytotoksyczne. Zakażenie może obejmować objawy od zwykłej biegunki po rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy (pseudomembranous colitis, PMC), objawiające się nudnościami, bólem brzucha, wodnistą biegunką, odwodnieniem, niewielką gorączką i pojawieniem się podwyższonych żółtych płytek na śluzówce jelita grubego. Nie leczone piorunujące zapalenie jelita grubego może prowadzić do zgonu pacjenta. Mogą wystąpić wybuchy chorób przewodu pokarmowego w warunkach szpitalnych powodowane przez Clostridium difficile oraz nawroty choroby11. Antybiotykoterapia zakażenia Clostridium difficile może pomóc w walce z chorobą. Rozpoznanie następuje zwykle po wykryciu obecności jednej lub obydwu toksyn Clostridium difficile3,12. Test cytotoksyczny oparty na kulturze komórkowej jest uznawany za metodę referencyjną, ale jest względnie czasochłonny. Testy immunologiczne wykrywające tylko toksynę A lub obie toksyny A i B stały się uznanymi narzędziami rozpoznawania zakażenia Clostridium difficile4,5 . Istnienie nie-toksynotwórczych wariantów Clostridium difficile jest kolejnym argumentem przemawiającym za korzystaniem z testów opartych na wykrywaniu toksyn dla rozstrzygającego rozpoznania. Doświadczalnie stosowano testy z sondami kwasów nukleinowych, ale mogą być skomplikowane ze względu na fakt, że organizmy mogą być obecne bezobjawowo u około 50% niemowląt, 20-30% hospitalizowanych pacjentów i 2-3% zdrowych dorosłych6,7 . Znaczenie kliniczne wykrycia obydwu toksyn A i B nie jest jeszcze w pełni poznane. Chociaż większość szczepów powodujących choroby produkuje obydwie toksyny, które mogą działać synergicznie, udokumentowane przypadki chorób powodowanych przez szczepy Clostridium difficile wytwarzające tylko toksynę B wskazują, że z klinicznego punktu widzenia ważne jest wykrywanie przez test obecności zarówno toksyny A jak i B 8,9,10. 3 5 ZAWARTOŚĆ ZESTAWU, PRZYGOTOWANIE DO STOSOWANIA I PRZECHOWYWANIE Test mikropłytkowy ProSpecT C. difficile Toxin A/B zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 96 testów. Patrz także Środki ostrożności, punkt 6. Data ważności każdego zestawu jest podana na etykiecie opakowania. Wszystkie komponenty przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przed użyciem umożliwić wszystkim odczynnikom osiągnięcie temperatury pokojowej (20-25 °C) i delikatnie wymieszać. Po użyciu niezużyte odczynniki umieścić w lodówce. Wszystkie odczynniki, za wyjątkiem buforu płuczącego, są dostarczane w stężeniu gotowym do użycia. Odczynniki można rozdzielać bezpośrednio z butelek z zakraplaczem lub przelewać do użycia za pomocą pipet wielokanałowych. Jeśli przelano więcej odczynnika niż potrzeba, taką pozostałą ilość należy wylać. Nie wolno przelewać pozostałej ilości odczynnika ponownie do butelki. Instrukcja użytkowania Pipety do przenoszenia Uchwyt pasków mikropłytek i pokrywa Karta procedury Mikropłytka* (8 studzienek / pasek) 12 pasków opłaszczonych przeciwciałami mysimi przeciwko toksynie A i króliczymi przeciwko toksynie B. Niezużyte paski mikropłytek przechowywać w worku foliowym ze środkiem osuszającym w celu wyeliminowania wilgoci. Koniugat enzymu* Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca 25 ml koziego monoklonalnego przeciwciała przeciwko toksynie A i króliczego przeciwciała przeciwko toksynie B, znakowanych peroksydazą chrzanową, ze środkami przeciwbakteryjnymi. ZASADA DZIAŁANIA TESTU Test mikropłytkowy ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B jest immunologicznym testem fazy stałej do wykrywania toksyn A i B w klinicznych próbkach stolca przy wykorzystaniu swoistych przeciwciał. Próbka stolca może być rozcieńczona w rozcieńczalniku do próbek lub użyta bezpośrednio, jeżeli była wcześniej rozcieńczona w zmodyfikowanej pożywce transportowej Cary Blair. Próbki stolca są dodawane do odłamywanych studzienek mikropłytek, na których związane są mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko toksynie A i królicze przeciwciała przeciwko toksynie B. Jeżeli toksyny są obecne, są one przechwytywane przez związane przeciwciało. Studzienki są poddawane inkubacji a następnie przemywane w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Dodawany jest koniugat enzymu (kozie przeciwciało przeciwko toksynie A i królicze przeciwciało przeciwko toksynie B znakowane enzymem peroksydazy chrzanowej). Studzienki są poddawane inkubacji a następnie przemywane w celu usunięcia niezwiązanego koniugatu enzymu. W reakcji dodatniej związana toksyna wiąże koniugat enzymu do studzienki. Dodawany jest substrat dla enzymu, 3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna (TMB). W reakcji dodatniej enzym związany ze studzienką zamienia substrat na produkt reakcji kolorymetrycznej. Wybarwienie można obserwować wzrokowo lub spektrofotometrycznie. W reakcji ujemnej nie ma toksyny lub obecne Kontrola dodatnia Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca 4 ml supernatantu hodowli toksyny A i toksyny B C. difficile i środki przeciwbakteryjne. Kontrola ujemna Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca 4 ml zbuforowanego roztworu z czerwonym barwnikiem i 0,1% azydku sodu. Rozcieńczalnik do próbek Jedna butelka zawierająca 120 ml zbuforowanego roztworu z czerwonym barwnikiem i 0,1% azydku sodu. Bufor płuczący Jedna butelka zawierająca 120 ml (x10) skoncentrowanego roztworu buforu ze środkami przeciwbakteryjnymi. 1 10-krotny koncentrat buforu płuczącego (x10) należy rozcieńczać dodając (x1) 1 część koncentratu do 9 części wody destylowanej lub dejonizowanej. Rozcieńczony bufor płuczący zachowuje stabilność przez 1 miesiąc, jeśli jest przechowywany w temperaturze 2 - 8 °C. 6.9 Substrat zabarwienia Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca 25 ml 3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyny (TMB) w buforze. Substrat zabarwienia należy przechowywać i pobierać z butelki chroniącej przed dostępem światła, w której jest dostarczony. Jeśli z dowolnego powodu pobrano porcję substratu z oryginalnej butelki, nie wolno ponownie dodawać niezużytej objętości substratu zabarwienia do oryginalnej butelki. 6.11 6.10 6.12 6.13 6.14 Roztwór zatrzymujący reakcję Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca 12 ml 0,46 mol/l kwasu siarkowego. *Uwaga: Nie zamieniać odczynników pomiędzy zestawami o różnych numerach serii. 6 6.15 6.16 ŚRODKI OSTROŻNOŚCI 6.17 Odczynniki są przeznaczone do stosowania wyłącznie w diagnostyce in vitro. Wyłącznie do profesjonalnego stosowania. Informacje na temat ewentualnych szkodliwych składników znajdują się w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa Materiału (MSDS) i na etykietach produktu. 6.18 INFORMACJE DOTYCZĄCE BHP 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 Odczynniki są przygotowywane z materiałów biologicznych i należy je traktować jako materiał potencjalnie zakaźny. Usuwać stosując procedury odpowiednie dla materiałów stanowiących zagrożenie biologiczne. Nie pipetować ustami. Podczas postępowania z próbkami i wykonywania analizy należy nosić jednorazowe rękawiczki i okulary ochronne. Po zakończeniu procedury dokładnie umyć ręce. Próbki mogą zawierać czynniki potencjalnie zakaźne i należy je traktować jako Poziom biozagrożenia 2 zgodnie z zaleceniem w podręczniku Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorób/Krajowego Instytutu Zdrowia (CDC/NIH) pt. „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories” (Bezpieczeństwo biologiczne w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych), wyd. 5. Bufor płuczący zawiera substancje działające potencjalnie uczulająco na skórę (< 1% v/v). Unikać kontaktu ze skórą. Nosić jednorazowe rękawiczki winylowe lub nitrylowe. Bufor płuczący usuwać w odpowiednich pojemnikach dla materiałów stanowiących zagrożenie biologiczne. Rozcieńczalnik do próbek i zestaw kontroli ujemnej zawierają 0,1% azydku sodu, który został zaklasyfikowany przez odpowiednie dyrektywy Europejskiej Wspólnoty Gospodarczej (EEC) jako szkodliwy (Xn). Poniżej podano odpowiednie oznaczenie niebezpieczeństwa (R). Xn R22 Substancja szkodliwa w przypadku połknięcia 6.19 7 Nie wolno stosować odczynników po upływie podanego terminu ważności. Termin ważności jest wydrukowany na każdej etykiecie odczynnika. Stosowanie odczynnika po terminie ważności może wpłynąć na dokładność wyników. Poniższe wspólne odczynniki mogą być używane w serii produktów ProSpecT: bufor płuczący, substrat zabarwienia i roztwór zatrzymujący reakcję. Zanieczyszczenie mikrobiologiczne odczynników może zmniejszyć dokładność testu. Unikać zanieczyszczenia mikrobiologicznego odczynników stosując sterylne jednorazowe pipety podczas pobierania części odczynnika z butelek. Przed użyciem wszystkie odczynniki i próbki należy pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej (20-25 °C). Paski mikropłytek należy przechowywać w zamykanych torebkach foliowych ze środkiem pochłaniającym wilgoć w celu ochrony studzienek mikropłytek przed wilgocią. Próbki stolca należy dokładnie wymieszać przed przygotowaniem próbek w celu zapewnienia jednolitej zawartości próbki. NIE WYKONYWAĆ KONCENTRATU PRÓBKI PRZED BADANIEM. Substrat zabarwienia jest wrażliwy na światło. Jeśli odczynnik zostanie wystawiony na działanie światła i pojawi się zabarwienie, odczynnik należy wyrzucić. Osoby nie rozpoznające kolorów lub z uszkodzeniem wzroku mnoga nie być w stanie odczytać wizualnie testu i powinny stosować odczyt spektrofotometryczny w celu zinterpretowania wyników. Podczas całej procedury odczynniki dodawać do studzienek testu w takiej samej kolejności. Aby uniknąć skażenia, nie wolno dotykać płynu w studzienkach końcówkami butelek. Dokładnie mierzyć czas każdej inkubacji. Rozpocząć pomiar czasu po dodaniu odczynnika do ostatniej studzienki na każdej badanej mikropłytce. W celu zapewnienia dokładnego pomiaru czasu jednorazowo badać nie więcej niż trzy płytki z 96 studzienkami. Odchylenie od ustalonej procedury może zmienić wynik badania. Ważne jest utrzymywanie butelek z zakraplaczami w pozycji pionowej, aby kropla tworzyła się na zakończeniu dyszy. Jeśli dysza stanie się wilgotna, zamiast na końcówce, wokół zakończenia dyszy powstanie kropla o nieodpowiedniej objętości; Jeśli to nastąpi, należy osuszyć dyszę przed kontynuowaniem zakraplania. POBIERANIE PRÓBEK STOLCA Odpowiednie są standardowe procedury pobierania i przechowywania próbek stolca w każdym laboratorium. ŚWIEŻE Niezakonserwowane próbki można przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C i badać w ciągu 48 godzin. Świeże próbki rozcieńczone w rozcieńczalniku do próbek, znajdującym się w zestawie, mogą być do czasu badania przechowywane w temperaturze pokojowej do 8 godzin lub w lodówce do 72 godzin. ZAMROŻONE Jeśli świeżych próbek nie można zbadać w ciągu 48 godzin, należy je zamrozić w temperaturze -20 °C lub poniżej i zbadać w ciągu 2 miesięcy. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ mogą spowodować rozkład toksyn. CARY BLAIR Próbki zakonserwowane w zmodyfikowanej pożywce transportowej Cary Blair ze wskaźnikiem (lub odpowiednikiem) można przechowywać w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C) do 5 dni przed badaniem. Do wykorzystania w teście nie nadają się próbki stolca stężone lub pobierane do 10% formaliny lub utrwalaczy SAF i PVA. 8 SPOSÓB WYKONANIA TESTU WYMAGANE MATERIAŁY DOSTARCZONE Azydki mogą reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z miedzi i ołowiu tworząc wybuchowe sole. Ilości zawarte w tym zestawie są niewielkie, niemniej podczas usuwania materiałów zawierających azydek należy je spłukać dużą ilością wody. Patrz Zawartość zestawu, rozdział 5 MATERIAŁY NIEZBĘDNE, LECZ NIE DOSTARCZONE Pojemniki do pobierania próbek stolca Jednorazowe probówki, plastikowe lub szklane Stoper do pomiaru minut Butelka na bufor płuczący Woda destylowana lub dejonizowana ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY 6.7 6.8 Dokładnie przeczytać i postępować zgodnie z niniejszą „Instrukcją użycia”. Z wyjątkiem koncentratu buforu płuczącego odczynniki dostarczono w wymaganym stężeniu roboczym. Nie rozcieńczać odczynników, z wyjątkiem, jeśli tak polecono. 2 MATERIAŁY OPCJONALNE, NIE DOSTARCZANE 8.8 Czytnik mikropłytek odpowiedni do odczytu przy długości fali od 450/620 do 650 nm Aplikatory z końcówkami bawełnianymi lub wiskozowymi Mikropipeta do dostarczania objętości do 200 µl Wytrząsarka typu Vortex z adapterem do płytek lub wytrząsacz Zmodyfikowana pożywka transportowa Cary Blair 8.9 8.10 8.11 PROCEDURA 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.12 Przygotowanie próbek: Należy skorzystać z jednej z trzech podanych poniżej metod przygotowania próbek. A Uformowany stolec 1. Oznaczyć jedną probówkę dla każdej próbki. 2. Dodać 0,8 ml rozcieńczalnika do próbek (SD) do każdej probówki. 3. Przy użyciu drewnianego aplikatora dodać 0,2 g (kawałek wielkości małego ziarnka grochu) próbki. 4. Energicznie wymieszać próbkę w rozcieńczalniku do próbek. 5. Umieścić pipetę do przenoszenia w probówce i wymieszać, podnosząc i opuszczając jeden raz. 6. Pozostawić pipety do przenoszenia w probówkach. 7. PRZEJŚĆ DO KROKU 8.2 B Płynne i półpłynne próbki stolca 9 Przykryć mikropłytkę i inkubować w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C) przez 30 minut. Wytrząsnąć lub odessać i przepłukać każdą studzienkę 5 razy jak w kroku 8.6. Dodać 4 krople (200 µl) substratu barwiącego do każdej studzienki. Przykryć mikropłytkę i inkubować w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C) przez 10 minut. Dodać 1 kroplę (50 µl) roztworu zatrzymującego reakcję do każdej studzienki. Delikatnie postukać lub wytrząsać studzienki aż do jednorodnego zabarwienia na żółto. Odczytać reakcje w ciągu 10 minut po dodaniu roztworu zatrzymania reakcji. Odczytywać wzrokowo lub spektrofotometrycznie przy długości fali 450/620 do 650 nm (podwójna długość fali). KONTROLA JAKOŚCI Podczas przeprowadzania każdego testu należy uwzględnić kontrolę dodatnią i ujemną. Kontrole ujemna i dodatnia służą jako odczynniki i kontrole procedury. Kontrole są przeznaczone do monitorowania istotnych nieprawidłowych zachowań odczynników. Kontrola dodatnia nie zapewnia precyzji dla wartości granicznej testu. Gęstość optyczna (O.D.) kontroli ujemnej powinna wynosić < 0,080 przy 450/620 do 650 nm i powinna być bezbarwna (< intensywność 1+) podczas odczytu wzrokowego. Jeśli w kontroli ujemnej obecne jest żółte zabarwienie odpowiadające oznaczeniu 1+ lub większemu na Karcie procedury, test należy powtórzyć zwracając szczególną uwagę na procedurę płukania. Gęstość optyczna kontroli dodatniej powinna być ≥ 0,500 przy 450/620 to 650 nm i powinna być równa lub większa niż reakcja 2+ podczas odczytu wzrokowego. Jeśli w kontroli dodatniej żółte zabarwienie jest mniejsze niż 2+ na Karcie procedury należy zwrócić się o pomoc techniczną. 1. Oznaczyć jedną probówkę dla każdej próbki. 2. Dodać 0,8 ml rozcieńczalnika do próbek do każdej probówki. 3. Wymieszać próbki wstrząsając pojemnikami do pobierania próbek. 4. Za pomocą pipet do przenoszenia pobrać do 0,2 ml (drugie oznaczenie od końca pipety). 10 5. Opróżnić próbkę do rozcieńczalnika do próbek. W interpretacji zabarwienia należy posłużyć się załączoną Kartą procedury. 6. Mieszać pobierając do góry i opuszczając jeden raz. 7. Pozostawić pipety do przenoszenia w probówkach. 8. PRZEJŚĆ DO KROKU 8.2 C Próbki w pożywce Cary-Blair 1. Odwrócić fiolkę transportową kilka razy w celu dokładnego wymieszania próbki. 2. Nie ma potrzeby dalszego rozcieńczania próbki. 3. PRZEJŚĆ DO KROKU 8.2 WYNIKI ODCZYT WIZUALNY 10.1 10.2 Otworzyć torebkę foliową, wyjąć wymaganą liczbę pasków mikropłytek i umieścić je w uchwycie pasków mikropłytek. Należy wykorzystać jedną studzienkę na kontrolę ujemną i jedną studzienkę na kontrolę dodatnią. W przypadku użycia mniej niż 8 studzienek, należy odłamać wymaganą liczbę studzienek od paska i umieścić nie wykorzystane studzienki z powrotem w torebce foliowej z pochłaniaczem wilgoci. SZCZELNIE ZAMKNĄĆ TOREBKĘ, ABY ZABEZPIECZYĆ PRZED WILGOCIĄ I UMIEŚCIĆ Z POWROTEM W LODÓWCE. Dodać 4 krople (200 µl) kontroli ujemnej do studzienki A1. Dodać 4 krople (200 µl) kontroli dodatniej do studzienki B1. Za pomocą pipet do przenoszenia dodać 0,2 ml (drugie oznaczenie od końca pipety) każdej próbki do studzienki. Uwaga: Umieścić otwór pipet do przenoszenia tuż wewnątrz studzienek, aby uniknąć rozpryskiwania do sąsiednich studzienek. Przykryć mikropłytkę i inkubować w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C) przez 60 minut. Po dodaniu ostatniej próbki rozpocząć pomiar czasu. Wytrząsnąć lub odessać zawartość studzienek. Przepłukać napełniając całkowicie każdą studzienkę rozcieńczonym buforem płuczącym (~350-400 µl /na każdą studzienkę). Wytrząsnąć lub odessać cały płyn ze studzienek po każdym płukaniu. Przepłukać łącznie 3 razy. Po ostatnim płukaniu usunąć zawartość i wystukać płytkę na czystych ręcznikach papierowych lub odessać. Usunąć jak najwięcej buforu płuczącego nie pozwalając przez cały czas na wyschnięcie studzienek. Dodać 4 krople (200 µl) koniugatu enzymu do każdej studzienki. Odczytać wyniki testu porównując z zabarwieniem reakcji na Karcie procedury. Dodatni: żółte zabarwienie o intensywności przynajmniej 1+ Ujemny: bezbarwne Interpretacja wyników wizualnych: Dodatni: Jeśli w badanej studzience pojawi się żółte zabarwienie o intensywności równej co najmniej 1+, wówczas próbka zawiera toksynę A lub B lub obie, a wynik testu jest dodatni. Uwaga: Testy o jasno żółtym zabarwieniu (poniżej 1+) należy powtórzyć. Ujemny: Reakcja bezbarwna oznacza wynik ujemny i wskazuje na brak toksyn A i B lub niewykrywalne stężenie toksyn w badanej próbce. ODCZYT SPEKTROFOTOMETRYCZNY 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7 3 Odczytać wyniki przy podwójnej (450/620 do 650 nm) długości fali. Odczytać gęstość optyczną (O.D.) kontroli ujemnej. Gęstość optyczna Powinna wynosić < 0,080 dla 450/620 do 650 nm. Jeśli odczyt gęstości optycznej jest większy niż 0,080, wyniki są nieważne i test należy powtórzyć zwracając szczególną uwagę na procedurę płukania. Gęstość optyczna kontroli dodatniej powinna wynosić ≥ 0,500 przy długości fali 450/620 do 650 nm. Odczytać wyniki testu: Dodatni: Odczyt gęstości optycznej ≥ 0,080 Ujemny: Odczyt gęstości optycznej < 0,080 Interpretacja wyników spektrofotometrycznych: Dodatni: Dodatni w kierunku obecności toksyn A i/lub B C. difficile. Dodatni wynik nie określa obecności choroby. W celu ustalenia rozpoznania wyniki należy interpretować wraz z innymi informacjami klinicznymi dotyczącymi pacjenta. Ujemny: Ujemny w kierunku obecności toksyn A i/lub B C. difficile. Nie można wykluczyć zakażenia, ponieważ toksyny mogą być obecne w próbce w stężeniu poniżej progu wykrywanego przez test. *Uwaga: Wszystkie próbki, które są wzrokowo bezbarwne, ale dają odczyt gęstości optycznej niespójny z interpretacją wzrokową należy uznać za odczyt rozbieżny i sprawdzić, czy w studzienkach obecne są pęcherzyki powietrza, małe cząstki, lub czy na spodzie studzienki znajduje się nieprzezroczysta warstwa. W celu usunięcia warstwy przetrzeć spód studzienek i odczytać gęstość optyczną ponownie. Jeśli nadal występuje rozbieżność pomiędzy odczytem wzrokowym i odczytem gęstości optycznej, powtórzyć test. 11 Wyniki CTA + - - OGRANICZENIA ZWIĄZANE Z PROCEDURĄ 165 599 Swoistość # % # % ProSpecT 33/40 82,5 263/268 98,1 Wyrób odniesienia 1 33/40 82,5 260/268 97,0 ProSpecT 115/124 92,7 302/320 94,4 Wyrób odniesienia 2 98/124 79,0 309/320 96,6 ODTWARZALNOŚĆ Badania odtwarzalności prowadzono w trzech ośrodkach podczas trzech oddzielnych dni wykorzystując cztery utajnione próbki. Każdy ośrodek badał każdą próbkę w ośmiu powtórzeniach w studzienkach w każdym dniu badania (n=288). Próbki obejmowały jedną próbkę ujemną i trzy dodatnie o różnym poziomie reaktywności. Średni współczynnik zmienności pomiędzy testami (CV) dla średniej próbki wynosił 18,9%. Średni CV podczas jednego testu dla średniej próbki wynosił 7,7%. REAKTYWNOŚĆ KRZYŻOWA Wraz z testem mikropłytkowym ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/ B badano czterdzieści innych drobnoustrojów. Izolaty bakterii i drożdży były badane w ilości ≥ 108 CFU (jednostki tworzące kolonie)/ ml. Izolaty wirusów badano w stężeniach 10 4 TCID 50/ml (dawka zakażająca hodowlę tkankową/ml). Nie obserwowano reakcji krzyżowych. Nie występowały reakcje krzyżowe wobec badanego szczepu Clostridium sordellii (ATCC ® 9714). Niemniej jednak w publikacjach wskazuje się, że określone szczepy C. sordellii mogą produkować toksyny, które mogą reagować krzyżowo z przeciwciałami przeciwko toksynom A i B C. difficile. Testem mikropłytkowym ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/ B badano następujące drobnoustroje. Adenovirus Type 40 Adenovirus Type 41 Aeromonas hydrophilia Bacillus cereus Bacillus subtilis Bacteroides fragilis Campylobacter coli Campylobacter jejuni Candida albicans Clostridium beijerinckii Clostridium difficile (non-toxigenic) Clostridium haemolyticum Clostridium histolyticum Clostridium novyi (toxin A) Clostridium perfringens (type A) Clostridium septicum Clostridium sordellii Clostridium sporogenes Clostridium tetani Enterobacter aerogenes Wyniki CTA Łącznie Czułość Test mikropłytkowy ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B wykrywa toksynę A w stężeniach ≥ 0,20 ng/ml a toksynę B w stężeniach ≥ 0,61 ng/ml. Badania przeprowadzono w trzech laboratoriach klinicznych w Ameryce Północnej. Dla wszystkich badanych próbek łączna czułość testu mikropłytkowego ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B w porównaniu do testu cytotoksycznego na kulturach hodowli tkankowych (CTA) wyniosła 90,3% (149/165), a łączna swoistość w porównaniu do CTA wyniosła 96,2% (576/599). 23 576 464 486 CZUŁOŚĆ ANALITYCZNA W PORÓWNANIU DO TESTÓW CYTOTOKSYCZNYCH NA KULTURACH HODOWLI TKANKOWYCH + - 15 100 Wyniki w porównaniu do CTA EIA CHARAKTERYSTYKA TESTU + 149 16 22 Test mikropłytkowy ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B porówmnano z dwoma dostępnymi na rynku testami immunoenzymatycznymi (wyroby odniesienia). Wyniki testu mikropłytkowego ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B i wyrobów odniesienia w porównaniu do CTA (stosując te same próbki) są następujące: WARTOŚCI OCZEKIWANE ŁączniE ProSpecT Wyniki EIA 85 PORÓWNANIE WYNIKÓW TESTU Z WYROBEM ODNIESIENIA Zapalenie jelita grubego spowodowane przez C. difficile występuje znacznie częściej u pacjentów hospitalizowanych i jest czwartą w kolejności najczęstszą chorobą szpitalną zgłaszaną do Centrów Kontroli i Zapobiegania Chorób. C. difficile jest powoduje 20-30% przypadków biegunek związanych z antybiotykami i za ponad 90% przypadków rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy. Odsetek częstości szpitalnych przypadków CDAD może się różnić u pacjentów w szpitalach i podlega obecności czynników predysponujących, takich jak zaawansowany wiek pacjenta, rodzaj i czas trwania leczenia przeciwbakteryjnego, nasilenie objawów choroby (lub chorób) zasadniczej oraz czas pobytu w szpitalu. Bakteria C. difficile występuje u 3-5% zdrowych dorosłych i do 50% dzieci i młodzieży jest bezobjawowymi nosicielami zarówno bakterii jak i produkowanych przez nie toksyn13. 13 + Wyniki odczytu wzrokowego EIA Łącznie 85,0% Czułość (85/100); 95% CI = 76,5% - 91,4% 95,5% Swoistość (464/486); 95% CI = 93,2% - 97,1% Poprawność wyników testu mikropłytkowego ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B zależy od wykonania reakcji kontrolnych zgodnie z oczekiwaniami. Patrz „Kontrola jakości”, punkt 9. Dodatni wynik nie określa obecności choroby. Test wykrywa obecność toksyny A i/lub B w próbkach stolca. W celu ustalenia rozpoznania wyniki należy interpretować wraz z innymi informacjami klinicznymi dotyczącymi pacjenta. Ujemny wynik testu nie wyklucza możliwości obecności toksyny A lub B C. difficile i może wystąpić, jeżeli stężenie toksyn jest poniżej progu wykrywalności testu. Nie wykazano związku pomiędzy stężeniem toksyn a obecnością lub nasileniem objawów choroby. Tak jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych IN VITRO, lekarz powinien interpretować wyniki testu w połączeniu z objawami klinicznymi lub innymi wynikami laboratoryjnymi. Prawidłowe pobieranie i przygotowanie próbek ma istotne znaczenie dla uzyskania optymalnych wyników testu. Optymalne wyniki testu są uzyskiwane z próbek badanych 48 godzin po pobraniu. Patrz „Pobieranie próbek stolca”, punkt 7. Nie oceniano charakterystyki działania niniejszego testu u dzieci. 12 ProSpecT 90,3% Czułość (149/165); 95% CI = 84,7% - 94,4% 96,2% Swoistość (576/599); 95% CI = 94,3% - 97,5% INTERPRETACJA WZROKOWA TESTU Dane odczytu wzrokowego pobrano w dwóch z trzech laboratoriów łącznie dla 586 próbek. Łączna czułość w porównaniu do CTA wynosiła 85,0% a łączna swoistość wynosiła 95,5%. Wyniki odczytów wzrokowych były w 99,0% (580/586) zgodne z wynikami spektrofotometrycznymi uzyskanymi dla każdej próbki. 4 Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Peptostreptococcus anaerobius Porphyromonas asaccharolytica Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Rotavirus Salmonella choleraesuis Serratia liquefaciens Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella sonnei Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (Cowan) Staphylococcus epidermidis Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica INTERFERING SUBSTANCES Testem mikropłytkowym ProSpecT Clostridium difficile Toxin A/B badano następujące substancje: wankomycyna (12,5 mg/ml), metronidazol (12,5 mg/ml), krew, śluz, tłuszcz stolca i następujące produkty przeciwbiegunkowe dostępne bez recepty: Pepto-Bismol®, Imodium ® AD, Kaopectate ® (substancje czynne: podsalicylan bizmutu, chlorowodorek loperamidu i atapulgit). Nie obserwowano żadnych zakłóceń przez próbki dodatnie lub ujemne. 14 PIŚMIENNICTWO 1. Bartlett, J.G., 2002. N. Engl. J. Med. 346(5): 334-339. 2. Kelly, C.P. and J.T. LaMont, 1988. Ann. Rev. Med. 49: 375-390. 3. Wilkins, T. and D.M. Lyerly, 2003. J. Clin. Microbiol. 41: 531-534. 4. O’Connor, D., P. Hynes, M. Cormican, E. Collins, G. Corbette-Feeney and M. Cassidy, 2001. J. Clin. Microbiol. 39: 2846-2849. 5. Turgeon, D.K., T.J. Novicki, J. Quick, L. Carlson, P. Miller, B. Ulness, A. Cent, R. Ashley, A. Larson, M. Coyle, A.P. Limaye, B.T. Cookson and T.R. Fritsche, 2003. J. Clin. Microbiol. 41: 667-670. 6. Gumerlock, P.H., Y.J. Tang, J.B. Weiss and J. Silva Jr., 1993. J. Clin. Microbiol. 31: 507-511. Belanger, S.D., M. Boissinot, N. Clairoux, F.J. Picard and M.G. Bergeron, 2003. J. Clin. Microbiol. 41: 730-734. 7. 8. Limaye, A.P., D.K. Turgeon, B.T. Cookson and T.R. Fritsche, 2000. J. Clin. Microbiol. 38: 1696-1697. 9. Alfa, M.J., A. Kabani, D. Lyerly, S. Moncrief, L.M. Neville, A. Al-Barrak, G.K.H. Harding, B. Dyck, K. Olekson and J.M. Embil, 2000. J. Clin. Microbiol. 38: 2706-2714. Barbut, F., V. Lalande, B. Burghoffer, H.V. Thien, E. Grimprel and J. Petit, 2002. J. Clin. Microbiol. 40: 2079-2083. 10. 11. Lyerly, D.M., L.M. Neville, D.T. Evans, J. Fill, S. Allen, W. Greene, R. Sautter, P. Hnatuck, D.J. Torpey, and R. Schwalbe. 1998. J. Clin. Microbiol. 36:184-190. 12. Nicholson, G., and M. Jones. 1999. Br. J. Biomed. Sci. 56:204-208. Mandell, G.L., J.E. Bennett, and R. Dolin. 2000. Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practices of Infectious Diseases. 5th ed. Churchill Livingstone. New York, NY. 13. ProSpecTTM jest zastrzeżonym znakiem towarowym ATCC® jest zastrzeżonym znakiem towarowym American Type Culture Collection Pepto-Bismol®, Imodium® i Kaopectate® są zastrzeżonymi znakami towarowymi odpowiednio firmy Procter & Gamble, McNeil Consumer & Specialty Pharmaceuticals i Pharmacia & Upjohn Company Oxoid Ltd Wade Road Basingstoke Hants, RG24 8PW Wielka Brytania W celu uzyskania pomocy technicznej należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielem. IFU X7593, zmiana 30 października 2008 r. Wydrukowano w Wielkiej Brytanii 5