produkcja biomasy cz-2

Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014/2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 2.
Charakterystyka melasy
Melasa jest odciekiem pokrystalicznym, produktem ubocznym w procesie produkcji cukru. Przy przerobie buraków ilość melasy
stanowi około 4% ich masy. Melasa buraczana zawiera tę część cukru, która w normalnym procesie technologicznym nie daje się
odzyskać (wykrystalizować) w sposób ekonomiczny. Pod tym względem istotny dla cukrowników jest współczynnik czystości
melasy, który wynosi zwykle około 60. W skład melasy wchodzą cukry i wszystkie substancje niecukrowe nie usunięte wraz z
wysłodkami i szlamem defekacyjnym, podczas produkcji cukru. Jest cieczą ciemnobrunatną, bardzo gęstą (1,35 g/cm3) o swoistym
zapachu (z wyczuwalnym aromatem karmelu), słodką o gorzkim posmaku. Skład chemiczny melasy zależy od gatunku buraków,
warunków gruntowych i klimatycznych ich wegetacji, a także od rodzaju procesu technologicznego produkcji cukru. Średni skład
melasy w porównaniu z wymaganiami stawianymi przez PN podano w TABELI 1.
TABELA 1. Porównanie średniego składu chemicznego melasy z wymaganiami PN-76/R-64772
L.p.
Składnik
Średnia zawartość [%]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Sucha substancja
Sacharoza
Azot ogółem
Substancje redukujące
Kwasy lotne
Sole Mg i Ca
pH
Współczynnik czystości
Kwasy organiczne
Rafinoza
Koloidy
80
47 - 51
1,7 – 2,0
0,2 – 1,0
0,69 – 2,52
0,4 – 2,0
7,5 – 8,5
58 – 63
7,0 – 9,0
0,7 – 2,5
2,5 – 5,5
7,5 – 11,5
12
Popiół
w tym:
K2 O
Na2O
13
Karmel i melanoidy
1,5 – 1,8
Wymagania PN
Klasa I
Nie mniej niż 75 %
Nie mniej niż 46%
Nie mniej niż 1,6%
Nie mniej niż 1,0%
Nie mniej niż 1,4%
Nie mniej niż 1,2%
7,0 – 8,5
Nie mniej niż 65%
Klasa II
73%
44%
2,0%
7,0 – 9,0
-
Nie normuje się
3,0 – 6,0
0,7 – 1,0
Melasa trzcinowa jest produktem ubocznym w cukrowniach, w krajach uprawiających trzcinę cukrową (w Europie tylko w
południowej Hiszpanii). Istnieją 2 typy melasy trzcinowej. Pierwszy typ – przeznaczany m.in. do produkcji spirytusu - charakteryzuje
się bardzo wysoką zawartością cukru (72-79%) oraz niską zawartością popiołu (2-3%) i potasu (0,7-1,4% K2O), melasy drugiego
typu mają 52-65% cukru inwertowanego, 7-11% popiołu i 2,6-5,0% K2O. Melasa trzcinowa charakteryzuje się niską zawartością
ogólną azotu oraz wysoką zawartością biotyny (ok. 3 g na tonę). W Polsce melasa trzcinowa jest czasami stosowana w wytwórniach
drożdży piekarskich jako dodatek (ok. 20%) do melasy buraczanej, ze względu na wyższe wydajności drożdży pod wpływem
biotyny.
Istotny jest współczynnik czystości melasy Q (iloraz zawartości cukru i suchej masy). Zwykle wynosi on Q = ok. 60.
Ciężar właściwy i sucha masa. Ciężar właściwy zmienia się w zależności od temperatury i udziału suchej masy. W temp. 20°C
wynosi przeciętnie 1,4 g/cm3. Zawartość ciał obcych (osadu, szlamu) w melasie zależy od stopnia sklarowania (odfiltrowania) soku
w cukrowni. Przeciętnie wynosi ona 0,3-0,5%, przy czym sucha masa osadu składa się w 30-60% z substancji mineralnych.
Normalna melasa powinna zawierać 8-10% popiołu, a w jego skład wchodzą głównie: SiO2 (20-50%) i CaO (20-40%). Krajowe melasy
zwykle zawierają zbyt niskie ilości magnezu.
Zawartość azotu ogólnego w melasie powinna wynosić nie mniej niż 1,6%. Z azotowych substancji organicznych melasa zawiera
głównie betainę oraz kwas asparaginowy i glutaminowy. Dobrze przyswajalny przez drożdże jest azot aminowy, ale jego zawartość
w melasie jest minimalna i wynosi 0,06 – 0,28%. Im więcej azotu przyswajalnego jest w melasie, tym lepsza wydajność produkcji
drożdży. Do brzeczek fermentacyjnych często stosuje się dodatek soli amonowych.
Składniki koloidowe. Melasa zawiera składniki koloidowe zarówno w postaci zawiesin, jak i cząstek rozpuszczonych. Mają one
ładunek ujemny (wytrącają się przy odczynie kwaśnym), jak i dodatni (wytrącanie przy pH alkalicznym). Zawartość składników
koloidowych waha się w granicach 0,2-6%. Wytrącają się głównie substancje barwne, karmelowe, humusowe, melanoidy. Składniki
nie wytrącone z brzeczki są adsorbowane na powierzchni ścian komórek, powodując powstawanie ciemnej barwy drożdży.
Klarowanie melasy umożliwia uzyskanie drożdży o barwie jasnej.
Substancje barwne melasy. Należą tu związki karmelowe (z sacharozy pod wpływem ciepła), żółtawozielone kompleksy
pirokatechinowo-żelazowe (pochodzące z buraka), melanoidy (główne czynniki barwiące melasę, powstające w kondensacji cukru,
zwłaszcza inwertu – z aminokwasami, gł. kwasem asparaginowym) i melaniny (produkt enzymatycznego utleniania polifenoli
buraka). Intensywność zabarwienia zależy melasy zależy od pH i temperatury soku w cukrowni. Barwniki melasy należą częściowo
do składników koloidowych i humin. Barwę melasy określa się kolorymetrycznie, porównując z barwą 0,1N roztworu jodu.
Normalna melasa wykazuje barwę 1-3 cm3 0,1N roztworu jodu/1g.
Składniki mineralne melasy. Ogólna ich ilość wyrażona jako popiół węglanowy waha się w granicach od 7,0 do 11,5%. W skład
jego wchodzą wg ilości malejącej K2CO3, Na2CO3, CaCO3 i in. Główne znaczenie w procesie fermentacyjnym mają fosfor i magnez.
Ilość ich w melasie jest niewystarczająca do prawidłowego prowadzenia procesu, dlatego fosfor dodaje się do brzeczek w postaci
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014/2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 2.
superfosfatu. Melasy krajowe cechują się zwykle zbyt niską zawartością potasu w stosunku do wymagań drożdży. Wpływa to
niekorzystnie na wydajność drożdży. Przy zawartości potasu w przeliczeniu na K 2O niższej od 2,2% osiąga się wydajność poniżej 75
g D27/100 g melasy o zawartości sacharozy 50%, a przy zawartości 4,2% - 85 g D27/100 g M50. Zawartość potasu wyrażonego jako
K2O powinna wynosić co najmniej 3,5%. Istotna dla wzrostu drożdży jest również obecność jonów magnezu. W procesie
klasycznym namnażania drożdży wystarczające uzupełnienie w te jony stanowi dawka wprowadzona z wodą wodociągową, jednak
przy procesach prowadzonych w brzeczkach o wyższym stężeniu – konieczny jest dodatek magnezu.
Kwasy organiczne. Melasy zawierają zarówno nielotne, jak i lotne kwasy organiczne. Głównym kwasem nielotnym jest kwas
mlekowy (ok. 0,5%), ponadto występują kwasy: cytrynowy, szczawiooctowy, szczawiowy, kwasy huminowe i inne. Z punktu
widzenia technologii drożdży ważniejsze są kwasy lotne (0,66-1,50%) jak mrówkowy, octowy, propionowy, masłowy i inne. Hamują
one rozwój drożdży (pączkowanie) i ich zdolność fermentacyjną. Przyjmuje się że brzeczka melasowa nie powinna zawierać więcej
niż 0,1% kwasów lotnych, co odpowiada ok. 0,2% w przeliczeniu na nierozcieńczoną melasę wyjściową. Wynik oznaczenia
zawartości kwasów lotnych w melasie zależy od pH zastosowanego do destylacji, dlatego ustalono normę na pH ok. 3. Zawartość
kwasów lotnych w melasie spada w trakcie jej gotowania, zwłaszcza po silnym zakwaszeniu i przy doprowadzaniu pary do
roztworu.
Biostymulatory. Związki biologicznie czynne (biostymulatory). Część witamin znajdujących się w buraku cukrowym przechodzi
przez wszystkie stadia produkcyjne w cukrowni i znajduje się w melasie – są to biotyna i kwas foliowy (1/3 ilości występującej w
buraku) i witamina B6 (1/4 ilości występującej w buraku), kwas pantotenowy ulega częściowemu zniszczeniu, a witaminy B1 i B2
ulegają całkowitemu zniszczeniu podczas przerobu. Najistotniejszymi związkami dla rozwoju drożdży są: mezoinozyt, kwas
pantotenowy i biotyna. Mezoinozyt występuje w krajowych melasach w ilości od 72 do 340 mg/100 g melasy, co całkowicie
pokrywa zapotrzebowanie drożdży na ten składnik, natomiast zapotrzebowanie na kwas pantotenowy wynoszące 5mg/100 g
melasy jest pokrywane w krajowych melasach najwyżej w 50%. Również zapotrzebowanie na biotynę wynoszące 29 mg/100 g
melasy jest pokryte w ok. 25% gdy melasa jest bogata w ten składnik. Tak więc, aby osiągnąć dobre wydajności drożdży należałoby
uzupełnić zawartość tych dwu składników w brzeczkach hodowlanych.
Cukry. Najcenniejszym z cukrów melasy jest sacharoza ze względu na jej ilość i dobrą przyswajalność przez drożdże. Znajduje się
tu także trójcukier – rafinoza w ilości 2%. Enzymy drożdżowe rozkładają rafinozę na fruktozę i melibiozę (glukoza + galaktoza). Ta
ostatnia nie jest przyswajalna przez drożdże. Oprócz tych dwóch cukrów melasa zawiera niewielkie ilości cukru inwertowanego –
w normalnych warunkach ilość tego składnika nie powinna przekraczać 0,5%. Wysoka zawartość w melasie inwertu świadczy o
postępującym procesie inwersji sacharozy, w wyniku którego mogą powstawać związki szkodliwe dla drożdży.
Jako surowiec melasa wykorzystywana jest do produkcji: drożdży piekarskich, paszowych, alkoholu w gorzelnictwie
przemysłowym, kwasów organicznych — kwas cytrynowy, kwas mlekowy, butanolu, acetonu, innych substancji, np. witamin.
Stan biologiczny melasy. Każda melasa jest w większym lub mniejszym stopniu zakażona przez drobnoustroje szkodliwe. Melasy
zawierające do 100 tys komórek w 1 g zalicza się do klasy I, do 1 mln komórek – klasy II, a do klasy III należą melasy o zakażeniu
do 5 mln komórek w 1g. Melasy klasy II i III wymagają w drożdżowni sterylizacji. Obecność obcych mikroorganizmów zmniejsza
wydajność drożdży również z powodu obecności produktów ich metabolizmu (kwasy lotne, azotyny). Szczególnie szkodliwe są dla
produkcji drożdży piekarskich bakterie tworzące kwasy, wytwarzające śluz (np. Leuconostoc), bakterie sienne (Bacillus subtilis),
drożdże dzikie (zwłaszcza osmofilne, Candida, Mycoderma, Mycotorula, Schizosaccharomyces).
Melasa rozcieńczona wodą nazywa się w gorzelnictwie brzeczką. Fermentacja melasy nierozcieńczonej nie jest możliwa, ponieważ
w melasie jest zbyt dużą zawartość cukrów, soli mineralnych, jak również wysokie ciśnienie osmotyczne. Melasa odznacza się także
dużą zawartością substancji niecukrowych, które są inhibitorami wzrostu drożdży; utrudniają one ich rozmnażanie i hamują
procesy fermentacyjne. Z tych też powodów fermentację przy produkcji spirytusu prowadzi się w rozcieńczonych roztworach
melasy. Najlepsze warunki dla rozmnażania drożdży występują wtedy, gdy melasa jest rozcieńczona dziesięciokrotnie, a nawet
trzydziestokrotnie, do gęstości 2 – 4 oBlg. Przez odpowiednią adaptację niektórych szczepów drożdży otrzymano rasy rozmnażające
się również w trudnych warunkach, tj. w brzeczkach melasowych o gęstości nawet 25 oBlg (osmofile). Jednym z czynników
hamujących wzrost drożdży przy niższych stężeniach jest alkohol etylowy, który już w stężeniu 0,7% może mieć ujemny wpływ na
rozmnażanie komórek. Przy fermentacji alkoholowej ujemny wpływ wywiera na drożdże zwiększona zawartość w surowcu kwasów
lotnych (ponad 2%).
Melasę magazynuje się w cukrowniach oraz przetwórniach użytkowych przez okres 5 – 8 miesięcy. Podczas długotrwałego
przechowywania jego skład chemiczny i mikrobiologiczny częściowo się zmienia, w wyniku czego traci on sacharozę, następuje
zakażenie drobnoustrojami i taki melas uznaje się za wadliwy, ponieważ staje się on wtedy głównym źródłem infekcji bakteryjnej
w przemyśle fermentacyjnym.
Rodzaje areometrów
Areometry służą do pomiaru gęstości cieczy lub stężenia ciekłego roztworu i działają na zasadzie prawa Archimedesa i prawa
ciążenia. Jest to szklany, pionowy pływak, składający się z części rozszerzonej, obciążonej rtęcią lub ołowiem oraz z tzw. trzpienia,
na którym naniesiona jest skala. Podziałka wyskalowana jest w jednostkach gęstości (densymetr) lub w procentach stężenia danej
substancji (alkoholomierz, sacharymetr, solomierz itp.). Areometr został wynaleziony prawdopodobnie już w starożytności.
Nowożytnym wynalazcą areometru był Baumé, który 1786 roku zbudował areometr do pomiaru gęstości i wprowadził umowną
skalę, tzw. skalę Baumégo. Zastosowanie areometru do pomiaru stężenia roztworu jest główną zasługą Gay-Lussaca, który
zbudował alkoholomierz.
Areometr Ballinga (°Blg) i Brixa (°Brix)
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014/2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 2.
Areometry te nazywane są cukromierzami i ich wskazania odnoszą się do wodnego roztworu sacharozy. W środowiskach wodnych
zawierających obok sacharozy i inne cukry lub związki, np. kwasy organiczne, sole mineralne, garbniki — wskazania cukromierza są
obarczone błędem. Błąd pomiaru będzie tym większy, im więcej różni się ciężar właściwy substancji towarzyszącej sacharozie od
ciężaru właściwego sacharozy. W świeżych zacierach, moszczach, brzeczce piwnej i melasie, wskazania areometru Ballinga
niewiele się różnią od rzeczywistej zawartości suchej masy w badanym środowisku. Wynika to z tego, że ciężary właściwe różnych
cukrów prostych i złożonych nieznacznie różnią się od ciężaru właściwego sacharozy.
Obecność w roztworze alkoholu etylowego lub innych związków lotnych, których ciężar właściwy jest znacznie mniejszy od ciężaru
właściwego sacharozy, zmniejsza istotnie wynik pomiaru. Gęstość alkoholu etylowego jest w przybliżeniu dwa razy mniejsza niż
gęstość cukru.
Zakres pomiaru przy pomocy areometru Ballinga wynosi 1–1,4 g/cm3, a skala ma podziałkę od 00 do 800. Głębokość zanurzenia się
areometru w wodzie destylowanej o temp. 200C oznaczono kreską „0”, a głębokość zanurzenia w 10 % wodnym roztworze
sacharozy o temp. 200C, oznaczono kreską „10”. Odległość między kreskami dzielimy na 10 części, z których każda kreska oznacza
1 % sacharozy albo 10 Blg albo 10Brix
Areometr Trallesa i Richtera (alkoholomierz)
Podaje w czystych roztworach wodnych stężenie alkoholu etylowego w procentach objętościowych. 10 Trallesa (1 0 T.A.)
odpowiada stężeniu 1 % obj. etanolu. Zakres pomiaru areometru Trallesa wynosi od 1 do 0,729 g/cm 3.
Mogą być także stosowane alkoholomierze Richtera, które podają stężenie alkoholu w procentach wagowych. Głębokość
zanurzenia się areometru w wodzie destylowanej o temp. 200C oznaczono kreską „0”, a głębokość zanurzenia się w czystym
alkoholu (temp. 200C), oznaczono kreską „100”. Ponieważ ciężar właściwy alkoholu jest mniejszy od jedności, wobec tego kreska
„0” znajduje się w dolnej części trzpienia, a kreska „100” w górnej części. Odległość między kreską „0”, a kreską 100 ustalamy
praktycznie, gdyż zmiany gęstości nie są proporcjonalne do zmian zawartości alkoholu.
Wykonanie ćwiczenia
1. Charakterystyka fizyczna i chemiczna melasy jako surowca
1.1. Przygotowanie roztworu podstawowego melasy 1: 2
Do suchej zlewki odważyć 10g wymieszanej melasy. Dolewać powoli ok. 20ml ciepłej wody destylowanej (w razie potrzeby roztwór
delikatnie podgrzać, aż do całkowitego rozpuszczenia kryształków cukru, a następnie schłodzić w zimnej wodzie do temperatury
ok. 200C).
Uzupełnić naczynie wodą destylowaną do łącznej masy roztworu 30g i starannie wymieszać.
1.2. Oznaczanie zawartości sacharozy w melasie
Odważyć 25g roztworu podstawowego melasy 1:2 w kolbce miarowej o pojemności 50cm3, dodać kolejno po 5ml płynów: Herlesa
I (340 g Pb(NO3)2/1000 ml wody) i Herlesa II (32 g NaOH/1000 ml wody), mieszając próbę po każdej dawce, zawartość kolby
dopełnić do kreski wodą destylowaną.
Wymieszać starannie otrzymany roztwór i sączyć przez suchy sączek z bibuły filtracyjnej.
W przesączu oznaczyć stężenie sacharozy refraktometrem lunetowym MASTER-TA z automatyczną kompensacją temperatury.
W tym celu należy podnieść osłonę pryzmatu, pipetą nanieść ok. 1 ml roztworu sacharozy tak, aby zamykając osłonę ciecz
równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat. Następnie patrząc przez lunetkę odczytać wynik (skala po lewej
stronie w 0Brix, 1 oBrix = 1% sacharozy.) Po wykonaniu pomiaru refraktometr dokładnie opłukać pod bieżącą wodą i wytrzeć
delikatnie do sucha papierowym ręcznikiem.
2. Przygotowanie hodowli tlenowej i beztlenowej drożdży
2. 1. Przygotowanie gęstwy drożdżowej.
Z kostki drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae pobrać łyżeczką 15g sprasowanych drożdży i przenieść ilościowo do kolby
stożkowej 50 cm3 – zalewając 25ml jałowej wody destylowanej. Całość dokładnie wymieszać.
2.2. Nastaw fermentacji.
Przygotować pożywkę w kolbie stożkowej o pojemności 250/300 cm3 zawierającą 170 ml podłoża hodowlanego o składzie:
 sok owocowy (klarowny) o 20% zawartości sacharozy (zawartość sacharozy w soku owocowym oznaczyć refraktometrem lub
areometrem Ballinga i w razie potrzeby sok dosłodzić odpowiednią ilością cukru),
Oznaczanie stężenia sacharozy refraktometrem lunetowym MASTER-TA – należy podnieść osłonę pryzmatu, pipetą nanieść
ok. 1 ml badanego roztworu tak, aby zamykając osłonę ciecz równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat.
Następnie patrząc przez lunetkę odczytać wynik (skala po lewej stronie w 0Brix, 1 oBrix = 1% sacharozy.).) Po wykonaniu
pomiaru refraktometr dokładnie opłukać pod bieżącą wodą i wytrzeć delikatnie do sucha papierowym ręcznikiem
 0,85g (NH4)2SO4 i 0,12g (NH4)2HPO4 na każde 100ml podłoża,
W tak przygotowanym podłożu doprowadzić pH do wartości ok. 5,0 za pomocą 5N NaOH lub 10N H2SO4 (kwas lub zasadę dodawać
bardzo powoli – kroplami cały czas kontrolując pH).
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014/2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 2.
.
Hodowlę zaszczepić drożdżami Saccharomyces cerevisiae (5ml gęstwy).
Kolbę zważyć, oznaczyć poziom cieczy, zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkę fermentacyjną wypełnioną wodą
wapienną i inkubować w temperaturze 25-300C przez 2 tygodnie.
2.3. Nastaw hodowli tlenowej drożdży
Przygotować jałową kolbę stożkową o pojemności 250/300 cm3, zawierającą 100ml podłoża hodowlanego o składzie:
 melasa rozcieńczona do zawartości sacharozy 10% jałową wodą destylowaną
(aby odpowiednio rozcieńczyć melasę trzeba oznaczyć w niej stężenie sacharozy!!! – patrz pkt. 1.2 )
 0,85g (NH4)2SO4 i 0,12g (NH4)2HPO4 na każde 100ml podłoża.
W tak przygotowanym podłożu doprowadzić pH do wartości ok. 5,0 za pomocą 5N NaOH lub 10N H2SO4 (kwas lub zasadę dodawać
bardzo powoli – kroplami cały czas kontrolując pH).
Hodowlę zaszczepić drożdżami Saccharomyces cerevisiae (5ml gęstwy).
Kolbę zatkać korkiem z waty, zważyć, oznaczyć poziom cieczy i inkubować w temperaturze ok. 300C przez tydzień.
3. Opracowanie wyników
Opis wykonanych doświadczeń oraz uzyskane wyniki należy zamieścić w sprawozdaniu.
Można skorzystać z tabeli:
Parametr
Wynik
Analiza melasy
Zawartość sacharozy w melasie
Analiza hodowli tlenowej i beztlenowej
tlenowa
1 dzień
7 dzień
Waga kolbek [g]
Zawartość sacharozy [%]
Stężenie białka [µg/ml]
Zawartość alkoholu [%]
-
-
beztlenowa
1 dzień
14 dzień
-
-
4. Materiały do ćwiczeń, które zapewnia student !!!!
 drożdże piekarskie prasowane, świeże (drożdże w kostce)
 klarowny sok owocowy (200ml), jabłkowy, winogronowy
5.



Literatura
Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998.
Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba