Diagnostyka babeszjozy - Diagnostyka Laboratoryjna

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2009 • Volume 45 • Number 2 • 175-177
Praca poglądowa • Review Article
Diagnostyka babeszjozy
Joanna Matowicka-Karna, Joanna Białas
Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
Streszczenie
W pracy przedstawiono epidemiologię, wektory zarażenia, opis gatunków, objawy chorobowe występujące u ludzi i metody
wykrywania zarażenia Babesia spp. (badania laboratoryjne z zakresu hematologii, serologii, immunologii oraz badania molekularne – PCR).
The diagnosis of babesiosis
Summary
This study analyzes epidemiological situation of babesiosis, tick vectors, symptoms in humans and laboratory investigations
(hematology, serology, immunology, molecular diagnostics – PCR methods).
Słowa kluczowe:babesiosis, wykrywanie
Key words:babesiosis, detection
Pierwotniaki, które są zaliczane do rodzaju Babesia stanowią grupę ponad 100 gatunków pasożytów wewnątrzkrwinkowych (szczególnie erytrocytów). Pasożyty te należą do
typu Apicomplexa, rzędu Piroplasmida i charakteryzują się
obecnością kompleksu apikalnego, który ułatwia im wnikanie do komórek żywiciela. Trofozoity mogą przybierać różne
kształty, od gruszkowatego do ameboidalnego i pierścienia
czy pałeczki. Zarażenie określonym gatunkiem Babesia
zależy od jego rozmieszczenia geograficznego, wektorów
i żywicieli pośrednich (tab. I) [6, 15]. Według badań prezentowanych przez Genchi [2] seroprewalencja B. microti i B.
divergens w Europie wynosi 1,5-11,5%.
Cykl życiowy Babesia obejmuje pokolenie bezpłciowe (pasożyt występuje w organizmie kręgowców, m.in. u człowieka) oraz pokolenie płciowe występujące u kleszczy. Rozmnażanie bezpłciowe (schizogonia lub merogonia) zachodzi
w organizmie żywicieli pośrednich, natomiast sporogonia
u kleszczy, czyli żywicieli ostatecznych. Proces powstawania i uwalniania gamet wewnątrz jelita kleszcza jest nazywany gamogonią.
Patogeneza i obraz kliniczny
Kleszcz kłując żywiciela pośredniego, zasysa krew, w której
erytrocytach znajdują się pasożyty. Erytrocyty dostają się do
wnętrza jelita kleszcza i pozostają niezmienione przez kilka
godzin, potem większość z nich zostaje strawiona. Część
pasożytów, które przetrwały (są to tylko gametocyty) ulega
przekształceniu w gamety i wytwarza nowe ogranelle komór-
kowe. Powstaje m.in. kompleks apikalny, który bierze udział
w zlewaniu się gamet. Następnie powstaje zygota, która wnika do komórek nabłonkowych jelita kleszcza. Jest to miejsce
przekształcania się zygot w amebowate kinety, które z komórek nabłonkowych jelit przechodzą do gruczołów ślinowych
kleszcza. Powstające z kinet sporozoity zarażają erytrocyty
żywiciela pośredniego podczas ssania krwi przez kleszcza.
Jeden sporoblast może być źródłem ok. 5-10 tysięcy sporozoitów. Sporozoity Babesia po wniknięciu do erytrocytów
przekształcają się w schizonty. Schizont przekształca się
w merozoity, a uwolnione z rozpadłych erytrocytów merozoity zarażają kolejne krwinki. W erytrocytach odbywa się
schizogonia wywołująca lizę erytrocytów [16].
Okres wylęgania choroby trwa od 1 do 6 tygodni, ale może
być wydłużony nawet do 3 miesięcy. Objawy kliniczne związane z zarażeniem Babesia wiążą się z wnikaniem pasożyta do wnętrza erytrocytów i ich niszczeniem. Do objawów,
które temu towarzyszą zaliczamy: hemoglobinurię i hematurię (związane z obecnością wolnej hemoglobiny i hemu
w moczu, na skutek rozpadu erytrocytów), niedokrwistość
hemolityczną (spadek stężenia hemoglobiny, obniżenie hematokrytu), żółtaczkę (wzrost stężenia bilirubiny), wzrost
aktywności enzymów wątrobowych – aminotransferaz oraz
wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej i dehydrogenazy
mleczanowej (hepato- i splenomegalia). Można zaobserwować również trombocytopenię i okazjonalnie leukopenię. Do
objawów niespecyficznych należą: bóle głowy, bóle mięśni,
dreszcze, gorączka (powyżej 40 °C), zlewne poty, nudności,
175
Diagnostyka babeszjozy
Tabela I
Rozmieszczenie geograficzne, wektory zarażenia i żywiciele pośredni Babesia spp. [15].
Gatunek
B. beliceri
Wektor
Hyalomma
Żywiciel pośredni
bydło
Rozmieszczenie geograficzne
Rosja
B. bigemina
Boophilus spp.,
Rhipicephalus spp.
bydło, jeleniowate
Europa, Azja, Australia, Afryka, Ameryka
B. bovis
Boophilus spp.
Rhipicephalus spp.
bydło, jeleniowate
Europa, Azja, Australia, Afryka, Ameryka
B. canis
Rhipicephalus spp.
Haemaphysalis spp.
Dermacentor spp.
psowate
cały świat
B. divergens
Ixodes ricinus
bydło,
jeleniowate,
człowiek
Europa
B. equi
Rhipicephalus spp.
Dermacentor spp.
Hyalomma
koniowate
Europa, Azja, Afryka, Ameryka
B. jakimovi
B. major
B. microti
B. occultans
B. orientalis
B. ovata
B. crassa
B. motasi
B. ovis
Ixodes spp.?
Haemaphysalis spp.
Ixodes spp.
Hyalomma
Rhipicephalus spp.
Haemaphysalis spp.
nieznany
Haemaphysalis spp.
Rhipicephalus spp.
bydło, renifery
bydło
gryzonie, człowiek
bydło
bawoły
bydło
owce, kozy
owce, kozy
owce, kozy
Syberia
Europa
Ameryka Płn., Europa, Azja
Afryka
Azja
Azja
Azja
Afryka, Azja, Europa
Afryka, Azja, Europa
B. caballi
Dermacentor spp.
Hyalomma
konie, muły, osły
Afryka, Azja, Europa, Ameryka
B. perroncitoi
B. trautmanni
B. rossi
B. vogeli
nieznany
Rhipicephalus spp.
Haemaphysalis spp.
Rhipicephalus spp.
świnie
świnie
psowate
psowate
Afryka, Europa
Afryka, Europa
Afryka
Afryka, Azja, Europa, Ameryka, Australia
B. gibsoni
Rhipicephalus spp.,
Haemaphysalis spp.
psowate
Afryka, Azja, Europa, Ameryka,
kotowate
Afryka, Europa
B. felis
nieznany
ogólne wyczerpanie, utrata masy ciała i powikłania narządowe. Po zarażeniu pasożytem (niska parazytemia) następuje aktywacja limfocytów B i zostaje uruchomiona produkcja
przeciwciał. W okresie rozwoju choroby i namnażania się
pasożyta następuje aktywacja komórek NK i makrofagów,
wzrasta produkcja IFN-γ, ΤΝF-α, NO. Wraz ze zmniejszeniem parazytemii i okresem zdrowienia następuje aktywacja
limfocytów T, której towarzyszy podwyższone stężenie IFN-γ
[6].
Diagnostyka babeszjozy
Diagnostyka babeszjozy opiera się na różnorodnych badaniach, a mianowicie wykorzystuje się badanie mikroskopowe, próby biologiczne, badania serologiczne i molekularne.
Do badań mikroskopowych wykorzystuje się rozmaz krwi
obwodowej barwiony metodą Giemsy lub Wrighta. W obrazie mikroskopowym poszukuje się pierścieniowatych,
ameboidalnych, gruszkowatych lub owalnych form pasożyta zlokalizowanych we wnętrzu erytrocytów. Pasożyt tworzy w erytrocycie charakterystyczny „krzyż maltański” [16].
Merozoity B. divergens mają wielkość 1-3 µm, a B. microti
są minimalnie mniejsze i mają wielkość 1,5-2,5 µm. Dużym
176
problemem diagnostycznym rozmazów krwi obwodowej jest
niska parazytemia Babesia i różnicowanie z gatunkami Plasmodium [10, 11].
Kolejną metodą służącą do wykrywania pasożyta jest próba biologiczna na zwierzętach laboratoryjnych (inokulacja
zwierząt krwią pobraną od osób chorych). Wykonywana jest
w przypadkach zbyt niskiej parazytemii, kiedy objawy chorobowe są niespecyficzne. Metoda ta jest pracochłonna, wymaga cierpliwości (10-12 dni trwa oczekiwanie na wystąpienie
objawów klinicznych), ponadto obraz mikroskopowy pasożyta
jest zróżnicowany w zależności od gatunku żywiciela.
Dużą czułość i specyficzność wykazują metody serologiczne stosowane do wykrywania zarażenia Babesia. Wśród
najczęściej stosowanych metod serologicznych znalazła
się metoda immunofluorescencji pośredniej (IFA). W metodzie tej wykorzystywane jest zjawisko wiązania przeciwciał krążących we krwi chorego przez antygen znakowany
fluorochromem. Metoda ta jest wykorzystywana przede
wszystkim w przewlekłych postaciach zarażenia i służy do
monitorowania przebiegu choroby. Przeciwciała utrzymują się
w krążeniu przez okres od 13 miesięcy do 6 lat po zarażeniu.
W metodzie immunofluorescencji pośredniej można ozna-
J. Matowicka-Karna i J. Białas
czać przeciwciała w klasach IgM i IgG [1]. Wyniki fałszywie
ujemne można uzyskać u chorych zakażonych wirusem HIV,
po splenektomii, w przebiegu chorób autoimmunologicznych
[6]. Reakcje krzyżowe przeciwciał były opisywane w przypadku zarażenia Plasmodium spp. lub Toxoplasma [5]. Do
oznaczania przeciwciał skierowanych przeciwko B. microti
można również zastosować metodę ELISA, której czułość
i specyficzność porównywana z IFA wynosiła odpowiednio
95,5% i 94,1% [9]. Jednakże test ELISA nie jest wystarczająco standaryzowany do rutynowej diagnostyki [8].
Badania metodą IFA wykonane w środkowozachodnich
Niemczech w 1999 roku opierały się na wykrywaniu przeciwciał IgM i IgG skierowanych przeciwko B. microti (>1: 64)
i B. divergens (>1: 128). Wykazano, że prewalencja B. microti wynosiła 5,4%, a B. divergens 3,6% [7]. Późniejsze badania IFA wykonane przez Rojko i wsp. [12] wykazały, że w
Słowenii wczesną wiosną miano swoistych przeciwciał IgG
(B. divergens) wynosiło >1: 16 w 17,7% populacji, a późną
jesienią wzrosło i wynosiło odpowiednio >1: 64 w 8,4% populacji, >1: 128 w 5,6% populacji i >1: 256 w 2,8% populacji.
Natomiast badania przeprowadzone na populacji kleszczy
i wykonane metodami biologii molekularnej wykazały występowanie Babesia spp. w 9,6-16,3% populacji [8].
W diagnostyce stosuje się również technikę FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ), która służy do wykrywania
w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji
DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA [13].
W ostatnich latach coraz częściej do diagnostyki wykorzystuje się metody biologii molekularnej, szczególnie wtedy,
gdy w badanym materiale znajduje się zbyt mało patogenów. Dotyczy to między innymi diagnostyki zimnicy. Metodą, która umożliwia szybkie wykrycie pierwotniaków i ich
identyfikację gatunkową jest łańcuchowa reakcja polimerazy
(PCR). Reakcja PCR polega na wielokrotnym namnożeniu
(amplifikacji) swoistego fragmentu DNA badanego pasożyta. Stosowane są odpowiednie markery i komplementarne
startery, które służą do identyfikacji gatunkowej pasożyta.
W diagnostyce babeszjozy dotyczącej wykrywania DNA
w kleszczach wykorzystywane są różne markery molekularne – gen kodujący małą podjednostkę (18S) rRNA, gen
kodujący białko tubulinowe (β-tubulinę) i gen kodujący białko
szoku termicznego HSP70 [3, 5, 4, 6, 14].
Bardzo istotne jest ciągłe doskonalenie metod stosowanych
w diagnostyce laboratoryjnej wykrywania zarażenia Babesia
spp. Ważne jest, aby badanie było szybko wykonane, wynik
nie budził żadnych wątpliwości (jak identyfikacja pasożyta
w rozmazie krwi obwodowej), a badanie cechowała wysoka
czułość i zarazem wysoka swoistość.
Piśmiennictwo
1. Duh D, Jelovsek M, Avsic-Zupanc T. Evaluation of an indirect
fluorescence immunoassay for the detection od serum antibodies against Babesia divergens in humans. Parasitology 2007;
134: 179-85.
2. Genchi C. Human babesiosis, an emerging zoonosis. Parassitologia 2007; 49 suppl 1: 29-31.
3. Haselbarth K, Tenter AM, Brade V i wsp. First case of human
babesiosis in Germany – clinical presentation and molecular
characterisation of the patogen. Int J Med Microbiol 2007; 297:
197-204.
4. Herwaldt BL, de Bruyn G, Pieniazek NJ i wsp. Babesia divergens-like infection, Washington State. Emerging Infect Dis
2004; 10: 622-629.
5. Hildebrandt A, Tenter AM, Straube E i wsp. Human babesiosis
in Germany: just overlooked or truly new? Int J Microbiol 2007;
doi:10.1016/j.ijmm.2007.11.001
6. Homer MJ, Aguilar-Delfin I, Telford III SR i wsp. Babesiosis. Clin
Microbiol Rev 2000; 13: 451-469.
7. Hunfeld K-P, Lambert A, Kampen H i wsp. Seroprevalence of
Babesia infections in humans expose to ticks in midwestern
Germany. J Clin Microbiol 2002; 40: 2431-2436.
8. Hunfeld K-P, Brade V. Zoonotic Babesia: possibly emerging
pathogens to be considered for tick-infested humans in Central
Europe. Int Med Microbiol 2004; 293 suppl. 37: 93-103.
9. Loa CC, Adelson ME, Mordechai E i wsp. Serological diagnosis
of human babesiosis by IgG enzyme-linked immunosorbent assai. Curr Microbiol 2004; 49: 385-389.
10. Marathe A, Tripathi J, Handa V i wsp. Human babesiosis –
a case reports. Indian J Med. Microbiol 2005; 23: 267-269.
11. Meer-Scherrer L, Adelson M, Mordechai E i wsp. Babesia microti infection in Europe. Current Microbiol 2004; 48: 435-437.
12. Rojko T, Duh D, Avsic-Zupanc T i wsp. Seroprevalence of Babesia divergens infection among forestry workers In Slovenia.
Int J Med Microbiol 2008; doi:10.1016/j.ijmm.2008.03.001
13. Sherr VT. Human babesiosis – an unrecorded reality absence
of formal registry undermines its detection, diagnosis and treatment, suggesting need for immediate mandatory reporting. Med.
Hypotheses 2004; 63: 609-615.
14. Skotarczak B. Babesiosis of human and domestic dog; ethiology, pathogenesis, diagnostics. Wiad Parazytol 2007; 53: 271280.
15. Uilenberg G. Babesia – a historical overview. Veterinary Parasitol 2006; 138: 3-10.
16. Wong WS, Chung JYS, Wong KF. Human babesiosis.
Brit J Haematol 2007; 140: 364.
Adres Autorów:
Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Klinicznej
Uniwersytetu Medycznego
ul. J. Waszyngtona 15A
15-269 Białystok
tel./faks: (085) 746 85 84
[email protected]
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-03-17)
(Praca przekazana do opublikowania: 2009-07-03)
177