Miętkiewski – krew

Miętkiewski, „Kurs fizjologii doświadczalnej”, rozdział 5 – „Krew” (fragmenty)
3 A Oznaczanie liczby krwinek czerwonych i białych za pomocą komory Bürkera
Mieszalniki Potaina słuŜą do rozcieńczania krwi odpowiednim płynem, aby przez to ułatwić liczenie
krwinek, które nie rozcieńczone leŜałyby za gęsto w polu widzenia.
Mieszalnik do krwinek czerwonych jest to grubościenna rurką włosowata z podziałkami 0,5 i 1, rozdęta
w banieczkę, zakończona krótszą rurką, na którą nakłada się węŜyk z ustnikiem. Na tej rurce jest podziałka 101.
W banieczce znajduje się ruchoma szklana perełka. Objętość banieczki jest 100 razy większa od pojemności
kapilary do podziałki 1, a 200 razy większa od objętości kapilary do podziałki 0,5. Mieszalnik Potaina do
białych ciałek jest zbudowany analogicznie, tylko objętość banieczki jest 10-krotną objętością kapilary do
podziałki 1 i 20-krotną tejŜe do podziałki 0,5.
Płyn Hayema składa się z 0,25 g HgCl2 + 0,5 g NaCl + 2,5 g Na2SO4 + H2O od 100 ml słuŜy do
rozcieńczania krwi w celu liczenia krwinek czerwonych. MoŜe go zastąpić wodny roztwór 2 – 3 % NaCl (342,2
– 523,2 mmol/l); chodzi o to, Ŝeby taki płyn nie wywoływał ubytku czerwonych krwinek przez hemolizę, nie
pozwalał na układanie się krwinek w ruloniki i nadawał im wyraźne zarysy.
Płyn Türka składa się z lodowatego kwasu octowego 3,0 ml + 1 % (10 g/l) roztworu filetu goryczki
1,0 ml + wody destylowanej do 100 ml. SłuŜy on do rozcieńczania krwi w celu liczenia krwinek białych. Kwas
octowy hemolizuje erytrocyty, które by przeszkadzały w liczeniu leukocytów oraz powoduje pęcznienie jąder
krwinek białych, przez co komórki te staja się bardziej widoczne. Fiolet goryczki barwi jądra leukocytów na
niebiesko i czyni je wyraźniejszymi w polu widzenia.
Stolik Bürkera jest to prostokątna płytka szklana tak wyszlifowana, Ŝe w środku długości przebiega
przez nią w poprzek wąska płytka, która znów w środku swojej długości bywa przepołowiona rowkiem,
biegnącym równolegle do długiego boku stolika. Bo obu stronach bloczka biegną analogiczne do niego, ale nie
przepołowione i o 0,1 mm wyŜsze płytki. Po nasunięciu szkiełka nakrywkowego na płytki stolik zamienia się w
komorę o wysokości 0,1 mm. Na kaŜdej połówce bloczka, po obu stronach rowka, znajduje się siatka Thoma lub
Bürkera.
Siatka Bürkera składa się z podwójnych linii oddalonych od siebie o 1/20 mm i przecinających się pod
kątem prostym. W miejsc tego przecięcia powstają najmniejsze kwadraty x, o boku 1/20 mm i powierzchni
1/400 mm2. KaŜda para linii jest oddzielona od drugiej pary o 1/5 mm. Między liniami podwójnymi są zawarte
duŜe kwadraty y, o boku 1/5 mm i powierzchni 1/25 mm2. Wreszcie ci pięć duŜych kwadratów podwójne linie są
rozdzielone trzecią. W ten sposób powstają największe kwadraty, ograniczone liniami potrójnymi, a zawierające
po 16 średnich kwadratów y do liczenia krwinek białych i po 9 kwadratów najmniejszych x do liczenia krwinek
czerwonych.
(...)
Do jednego szkiełka zegarkowego nalewa się około 3 ml płynu Hayema lub 2 – 3 % roztworu NaCl, do
drugiego taką samą ilość płynu Türka.
Przed nakłuciem badany powinien umyć ręce w ciepłej wodzie, co przyczyni się nie tylko do ich
odkaŜenia, ale spowoduje czynne przekrwienie, a to z kolei ułatwi obfitszy wypływ krwi z miejsca nakłucia bez
niepoŜądanego wyciskania czy masowania palca. Pierwszą kroplę krwi ścieramy suchą i jałową watą, gdyŜ moŜe
jeszcze zawierać resztki środka uŜytego do odkaŜenia skóry. Do następnej kropli przystawiamy wylot kapilary
mieszalnika, trzymanego poziomo w prawej ręce. Aspirując bardzo ostroŜnie wciągamy krew do podziałki 0,5.
Gdy przewidujemy bardzo małą ilość krwinek czerwonych, wciągamy krew do podziałki 1. Koniec mieszalnika
wyciera się od zewnątrz i sprawdza, czy słupek krwi w kapilarze jest ciągły, czy nie zawiera pęcherzyków
powietrza oraz czy dokładnie sięga podziałki 0,5 lub 1. Gdy nieznacznie przewyŜsza podziałkę, odciągamy
nadmiar krwi przez lekkie dotykanie wylotu kapilary kawałkiem suchej ligniny lub waty. Bardzo ostroŜnie
aspirując przez ustnik, zanurzamy wylot kapilary w płynie Hayema i aspirujemy nieco silniej, aby uzupełnić
wnętrze mieszalnika do podziałki 101, zmieniając powoli jego połoŜenie z ukośnego na pionowe. Mieszalnik
chwytamy następnie tak, Ŝeby kciuk zaciskał przez gumę załamanego węŜyka górny, a palec środowy – dolny
jego wylot. Przez kilka minut naleŜy ostroŜnie potrząsać mieszalnikiem, Ŝeby za pomocą ruchomej perełki
jednolicie wymieszać krew z płynem Hayema. Mieszalnik powinno się trzymać w palcach poziomo, a ruchy
wstrząsające wykonywać w kierunku pionowym.
Podobnie pobieramy krew do liczenia krwinek białych, z tą tylko róŜnicą, Ŝe uŜywamy mieszalnika z
podziałkami 0,5, 1 i 11 i po nabraniu krwi do podziałki 1 dopełniamy go płynem Türka.
Na bardzo czysty stolik Bürkera nasuwamy szkiełko nakrywkowe w ten sposób, aby między nim a
bloczkiem powstał srebrzysty połysk lub pojedynczy barwny pierścień Newtona. Komorę kładziemy na stolik
mikroskopu i w małym powiększeniu oraz wąskiej przesłonie nastawiamy ostry obraz siatki. Po ponownym
wstrząśnięciu mieszalnika wypuszczamy 2 pierwsze krople, nie nadające się do liczenia, a następnie mała kroplę
umieszczamy na bloczku, tuŜ obok krawędzi szkiełka nakrywkowego. Krew wnika do komory siłą
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Created by Neevia Document Converter trial version
włosowatości. Krwinki czerwone rozmieszczają się na siatce przewaŜnie równomiernie. NaleŜy chwilę
zaczekać, aŜ krwinki opadną na no komory i ruch ich ustanie.
Krwinki czerwone liczymy w 80 małych kwadratach. JeŜeli liczba krwinek w poszczególnych
kwadratach jest bardzo róŜna, dalsze obliczanie jest bezcelowe, gdyŜ świadczy o niedokładnym wymieszaniu i
rozmieszczeniu krwi, co moŜe być przyczyną bardzo duŜego błędu. W tym wypadku trzeba doświadczenie
powtórzyć z większą dokładnością. Otrzymaną sumę dzielimy przez liczbę kwadratów, aby znaleźć średnią na
jeden kwadrat. Znaleźliśmy np. 480 krwinek w 80 kwadratach, wówczas w jednym kwadracie mamy średnio 6, a
w 1 ul krwi 4800000 krwinek czerwonych, gdyŜ 6 (średnia na 1 kwadrat) x 4000 (objętość) x 200
(rozcieńczenie) = 4800000 (4,8 T/l).
Aby unikać podwójnego liczenia niektórych krwinek, liczymy tylko te które leŜą wewnątrz kwadratu,
nie dotykając Ŝadnego boku i wszystkie, które dotykają lewego i górnego boku, choćby leŜały poza tym
kwadratem. Nie liczmy natomiast krwinek, które dotykają prawego i dolnego boku, choćby leŜały wewnątrz
kwadratu.
Krwinki białe liczymy tak samo, tylko we właściwych kwadratach, którym odpowiada objętość
1/250 mm3. NaleŜy przeliczyć jak największą liczbę kwadratów, np. 125, a średnią pomnoŜyć 250, gdyŜ
objętość graniastosłupa o podstawie duŜego kwadratu = 1/250 mm3 oraz przez 10 lub 20, jak rozcieńczona była
krew w mieszalniku. Znaleźliśmy np. 375 białych krwinek w 125 duŜych kwadratach, wtedy średnia na jeden
kwadrat wynosi 3. W 1 ul krwi mamy 7500 krwinek białych, gdyŜ 3 (średnia na kwadrat) x 250(objętość) x 10
(rozcieńczenie) = 7500 (7,5 G/l).
(...)
4 Oglądanie i liczenie krwinek płytkowych
Krwinki płytkowe, trombocyty albo płytki krwi Bizzozera, stanowią twory z większością cech Ŝywej
komórki, które jednak nie mają jądra, bardzo łatwo zlepiają się i rozpadają. Są one przeciętnie 2 – 3 razy
mniejsze od krwinek czerwonych, płaskie, róŜnokształtne z wypustkami i silnie załamują światło. W krąŜącej
krwi mają zwykle kształt wrzecionowaty. Według niektórych autorów liczba płytek waha się od 700 do 800
tysięcy w 1 ul krwi. Najczęściej w klinikach stosowana metoda pośrednia obliczania płytek według Fonio daje
jednak wyniki daleko niŜsze (średnio 250 tys.), dopuszczając wahania od 130 do 350 tys. w 1 ul (130 – 350 G/l).
Płytki Bizzozera moŜna oglądać w zabarwionym preparacie krwi oaz nie zabarwione we krwi
wynaczynionej albo w krąŜącej. Płytki krwi licz się bezpośrednio, podobnie jak krwinki białe lub czerwone albo
pośrednio – w zabarwionym preparacie odpowiednio przygotowanego rozmazu krwi.
Do oglądania płytek w nie zabarwionym preparacie krwi wynaczynionej potrzebne są: ostrza do
nakłuwania skory, bardzo dokładnie oczyszczone szkiełko podstawowe i nakrywkowe, bloczek parafinowy,
jałowy roztwór 14 % siarczanu magnezowego (567,9 mmol/l), klosz szklany lub zlewka, środek odkaŜający i
mikroskop.
Po zupełnym wyparowaniu lotnego środka odkaŜającego umieszcza się na opuszce palca kroplę
jałowego roztworu siarczan magnezu i poprzez nią nakłuwa się skorę. Wypływającą ze skaleczeni krew miesza
się z roztworem siarczanu magnezu, który w duŜym stopniu przyczynia się do utrwalenia płytek krwi, chroni je
przed rozpadem i układaniem się w większe skupiska, a osocze przed skrzepnięciem. Nie mając pewności, czy
roztwór siarczanu magnezowego jest jałowy, nie wolno poprzez taką kroplę nakłuwać palca. Kroplę siarczanu
moŜna teŜ w tym wypadku od raz umieścić na bloczku parafinowym, a małą ilość krwi wypływającą z nakłucia
przenieść do tego roztworu i natychmiast dokładnie wymieszać pałeczką szklaną, powleczoną cienką warstewka
parafiny lub silikonu.
Kroplę krwi zmieszanej z siarczanem magnezowym puszczamy na czystą i gładka powierzchnię
bloczka parafinowego. Nakrywamy go odwróconą zlewką, pod którą kładziemy trochę waty moczonej w wodzie
w celu nawilgotnienia komory. Komorę chronioną przed parowaniem pozostawiamy przez 20 min, Ŝeby na
górnej powierzchni zebrało się rozcieńczone osocze, zawierające większą liczbę płytek; cięŜsze bowiem
pozostałe elementy postaciowe krwi szybko opadają ku podstawie.
Wtedy ostroŜnie dotyka się środkiem powierzchni szkiełka podstawowego górnej warstwy kropli.
Zebrany ślad osocz nakrywa się szkiełkiem nakrywkowym i ogląda przez mikroskop, nastawiając ostrość na
nieliczne erytrocyty, ułatwiające orientacje w polu widzenia. Większa liczba krwinek czerwonych jest w tym
preparacie niepoŜądana, gdyŜ zaciemnia pole widzenia utrudnia wyszukanie płytek krwi.
Aby policzyć krwinki płytkowe w sposób pośredni, naleŜy najpierw przygotować rozmaz krwi
spływającej do kropli siarczanu magnezowego i dobrze wysuszyć go w powietrzu. Rozmaz barwi się nastepnie
według Pappenheima barwnikiem May-Grünwalda i Giemsy. Barwienie roztworem Giemsy trzeba jednak
prawie dwukrotnie przedłuŜyć, gdyŜ barwnik ten słabiej działa wobec siarczanu magnezowego.
Po ustaleniu liczby erytrocytów w sposób opisany w poprzednim rozdziale liczy się w zabarwionym
preparacie krwinki czerwone i płytki krwi przypadające na kaŜde pole widzenia, uŜywając okularu z przesłoną o
bardzo małym otworze. Wyniki zapisuje się w oddzielnych kolumnach, az liczba napotkanych erytrocytów
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
będzie wynosiła 1000, a zauwaŜonych równocześnie krwinek płytkowych x. Znając stosunek liczby płytek do
erytrocytów oraz liczbę krwinek czerwonych w 1 ul łatwo juŜ moŜna obliczyć ile krwinek płytkowych przypada
na 1 ul krwi wziętej do badania.
Jeden ze sposobów bezpośredniego liczenia płytek krwi polega na tym, Ŝe w mieszalniku Potaina do
krwinek białych naciąga asie krew do podziałki 0,5 i do podziałki 11 uzupełnia płynem, który barwi płytki krwi,
rozpuszcza znaczną część krwinek czerwonych i zapobiega krzepnięciu, przez co umoŜliwia dalsze
postępowanie, opisane w rozdziale o liczeniu krwinek białych. MoŜe to być np. płyn wersenianowy o składzie:
wersenianu sodowego 1,0, NaCl 0,7 i wody destylowanej – podbarwionej 1 kroplą alkoholowego roztworu
eozyny – do 100 ml.
5 Pomiar względnej objętości krwinek czerwonych hematokrytem Hedina i w heparynowanych rurkach nie
kalibrowanych
Odsetkową objętość zajmowaną we krwi przez erytrocyty moŜna ustalić wirując nie krzepnącą krew w
kalibrowanych rurkach szklanych. CięŜsze krwinki zgromadzą się w dalszym końcu rurki, a lŜejsze osocze
pozostanie bliŜej osi obrotu. Gdy cała rurka podzielona jest na równe 100 części, wystarczy po ukończonym
wirowaniu odczytać podziałkę na granicy między osoczem i krwinkami czerwonymi, aby mieć gotowy wynik
badania. Urządzenia do tego celu są róŜne, a nazywają się hematokrytami.
Hematokryt Hedina składa się z dwu grubościennych włosowatych rurek szklanych, podzielonych na
całej przestrzeni na 100 równych odcinków, które po napełnieniu krwią umieszcza się w oprawie pasującej o
wirówki i uniemoŜliwiającej wyciekanie krwi z rurek.
Na oczyszczonej opuszce palca umieszcza się odrobinę sproszkowanego szczawianu amonowego i
potasowego lub pozwala wyschnąć 1 kropli 4 % roztworu wersenianu sodowego (40 g / l) bądź 1 kropli 10krotnie rozcieńczonej heparyny, z którymi miesza się duŜą kroplę krwi wydobywającą się po nakłuciu. MoŜna
uŜywać heparynowanej krwi Ŝylnej lub krew z miejsca nakłucia wciągać do heparynowanych rurek
hematokrytowych.
Krew nabiera się siłą włosowatości do obu rurek pod podziałkę 100. Rurki osusza się od zewnątrz i
szczelnie umieszcza w oprawie kierując je zerowymi podziałkami na zewnątrz w stosunku do osi obrotu.
MoŜna uŜyć heparynowanych rurek nie kalibrowanych, np. o wymiarach: długość 90 mm, średnica
zewnętrzna 5 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm. Wtedy z miejsca nakłucia krew wnika do pochylonej rurki na
przestrzeni około 70 mm. Nie napełniony krwią przeciwległy koniec rurki zakleja się szczelnie roztopionym
lakiem. Rurki takie po zabezpieczeniu przed stłuczeniem wiruje się w zwykłym naczyniu wirówkowym, np. w
ciągu 30 min z szybkością 4000 obr. / min. Wynik odczytuje się za pomocą specjalnego wykresu bądź teŜ
zwykła podziałką milimetrową mierzy się długość słupków erytrocytów i osocza, obliczając, jaki procent całej
długości stanowią same erytrocyty.
Wyniki w duŜej mierze zaleŜą od warunków badania i w zasadzie moŜna jest porównywać dokładnie
tylko wówczas, gdy zyskano je jednakową metodą przy równym czasie i szybkości wirowania. Zazwyczaj
wiruje się w ciągu 30 min, z szybkością 4000 obr. / min, z siła 2250 g. Wtedy wskaźnik hematokrytu waha się
od 40 do 48 % (0,4 – 0,48 l / l).
6 Hemoliza i określenie oporności krwinek czerwonych na działanie roztworów hipotonicznych
W prawidłowych warunkach hemoglobina zawarta jest w krwinkach czerwonych. Ich zawiesina w
odpowiednim roztworze jest nieprzezroczysta, a po opadnięciu lub odwirowaniu krwinek roztwór pozostaje
bezbarwny. Czynniki niszczące budowę krwinek czerwonych lub uszkadzające ich półprzepuszczalną błonę,
powodują częściowe lub całkowite przemieszczenie hemoglobiny do roztworu, czyli hemolizę. Czynniki
hemolityczne moŜna podzielić na fizyczne, chemiczne oraz biologiczne.
Krwinki czerwone moŜna porównać z małym osmometrem, gdyŜ najbardziej zewnętrzna ich warstewka
jako błona półprzepuszczalna pozwala na przenikanie wody z otoczenia do krwinek i na odwrót, ale poza
wyjątkami nie przepuszcza ciał rozpuszczonych. Dlatego teŜ jedynie w roztworach izotonicznych krwinki
czerwone nie zmieniają kształtów; w roztworach hipertonicznych natomiast kurczą się i przybierają wygląd
owocu morwy; w roztworach hipotonicznych pęcznieją, wydają się kuliste, większe, aŜ wreszcie pękają,
uwalniając hemoglobinę do roztworu, czyli ulęgają hemolizie.
Izotoniczny z krwią ludzką jest taki roztwór, który wywiera ciśnienie osmotyczne około 6,7 atmosfer i
powoduje obniŜenie punktu zamarzania do –0,56oC (272, 59 K). JednakŜe bywają roztwory izotoniczne, w
których krwinki czerwone pękają podobnie jak w wodzie destylowanej, gdyŜ ciało rozpuszczone moŜe przenikać
do wnętrza krwinki: tu naleŜy przede wszystkim roztwór mocznika, a takŜe, choć w znacznie mniejszym
stopniu, roztwór glukozy.
Wreszcie rozcieranie krwi z piaskiem, podgrzewanie jej do temperatury powodującej topnienie lipidów
otoczki, naprzemienne zamraŜanie i odmraŜania, działanie promieni UV i innych o bardzo krótkiej fali oraz
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
elektryczność – naleŜą do fizycznych czynników hemolitycznych. Krwinki czerwone w roztworze
fizjologicznym o wiele łatwiej podlegają hemolizie niŜ w osoczu lub surowicy. Niewątpliwie działają tu
ochronne koloidy osocza.
Z czynników chemicznych wymienić trzeba rozpuszczalniki ciał tłuszczowych, jak eter, chloroform,
benzyna, które rozpuszczają lipidowe składniki otoczki krwinek i przez to powodują hemolizę. RównieŜ kwasy i
zasady w odpowiednich stęŜeniach i temperaturze oraz kwasy Ŝółciowe, lecytyna, mydła i saponiny wywołują
hemolizę, gdyŜ tak uszkadzają otoczkę, Ŝe hemoglobina moŜe wydostawać się poza jej obręb.
Do czynników biologicznych naleŜą ciała odpornościowe – hemolizyny, które występują we krwi
obcych gatunków jako heterohemolizyny lub nawet jako izohemolizyny we krwi tego samego gatunku.
Podobnie działają toksyny niektórych drobnoustrojów.
Podatność erytrocytów na działanie czynników hemolitycznych zaleŜy od weku krwinek, młode są
bardziej wytrzymałe niŜ starsze. Dlatego teŜ po znacznych krwotokach, kiedy duŜa liczba młodych krwinek
przenika z narządów krwiotwórczych do obiegu krwi, oporność jest większa. W innych stanach patologicznych,
np. w Ŝółtaczce hemolitycznej, krwinki czerwone są bardzo mało oporne.
(...)
A Działanie róŜnych czynników hemolizujących
W statywie umieszcza się 7 suchych probówek, oznaczonych kolejnymi numerami. Za pomocą czystej i
suchej pipety nalewa się do kaŜdej probówki odpowiednie ilości czynników hemolizujących. Po napełnieniu
wstrząsa się kaŜdą próbówką kilkakrotnie, aby dokładnie wymieszać umieszczone w niej czynniki. Najwcześniej
po 15 min od napełnienia probówek naleŜy ponownie zamieszać ich zawartość i zapoznać się z wynikiem,
oceniając go na oko i za pomocą mikroskopu.
Nie zhemolizowana rozcieńczona krew jest roztworem nieprzezroczystym, gdyŜ zawiesina krwinek
czerwonych, wypełnionych hemoglobiną rozprasza światło, nie przepuszczając promieni w przedłuŜeni linii ich
padania. Krew zhemolizowana jest czerwonym roztworem przezroczystym, gdyŜ uwolniona hemoglobina po
rozpadzie lub uszkodzeniu erytrocytów przechodzi do roztworu, a cienie krwinek nie zmieniają kierunku
promieni padających.
Aby stwierdzić zmiany mikroskopowe krwinek w powyŜszym doświadczeniu, przygotowuje się
preparaty zawiesiny erytrocytów w płynie hiper-, izo- i hipotonicznym, tzn. 5, 0, 0,9 i 0,6 % roztworze NaCl
(855,5, 154 i 102,6 mmol/l).
W pierwszym preparacie erytrocyty są mocno skurczone i maja kształt owocu morwy, gdyŜ dla
wyrównania róŜnicy stęŜeń tylko woda moŜe przenikać przez półprzepuszczalną otoczkę z krwinek do roztworu.
Cząsteczki rozpuszczone nie mogą wnikać do wnętrza krwinki.
W drugim preparacie erytrocyty nie zmieniają kształtu ani wielkości, gdyŜ stęŜenie cząsteczek
rozpuszczonych w roztworze i wewnątrz krwinki jest jednakowe.
W trzecim preparacie erytrocyty są napęczniałe, powiększone i kuliste, a nawet częściowo juŜ
zhemolizowane, gdyŜ dla wyrównania stęŜeń woda wnika do wnętrza krwinki, powodując zwiększenie jej
objętości i rozdęcie do formy kulistej. Cząsteczki znajdujące się w większym stęŜeniu w krwince nie mogą
przenikać przez półprzepuszczalną otoczką do roztworu hipotonicznego.
Nr Zawartość probówki
1 5 ml 5 % NaCl (855,5
mmol/l), 3 krople krwi
2 5 ml 0,9 % NaCl (154
mmol/l), 3 krople krwi
3 5 ml 0,6 % NaCl (102,6
mmol/l), 3 krople krwi
Zmiany makro- i mikroskopowe
roztwór nieprzezroczysty, krwinki
mają kształt owocu morwy
roztwór nieprzezroczysty, krwinki
zachowują kształt prawidłowy
roztwór nieprzezroczysty, krwinki
są napęczniałe, kuliste
4
roztwór przezroczysty, widać
najwyŜej cienie krwinek
5
6
5 ml wody
destylowanej,
3 krople krwi
5 ml 0,9 % NaCl (154
mmol/l), 1 ml eteru lub
chloroformu, 3 krople
krwi
5 ml 0,9 % NaCl (154
mmol/l), 3 ml digitoniny
2 % (20 g/l), 3 krople
krwi
roztwór przezroczysty, krwinki
zhemolizowane
roztwór przezroczysty, krwinki
zhemolizowane
Objaśnienia przyczyn i skutków
w roztworze hipertonicznym krwinki oddają
wodę i kurczą się
w roztworze izotonicznym krwinki nie
ulegają zmianom
w roztworze lekko hipotonicznym krwinki
pobierają wodę z otoczenia i pęcznieją, ale
jeszcze nie pękają
w roztworze mocno hipotonicznym krwinki
nabrały tyle wody, Ŝe ich otoczka zupełnie
pękła i uległy zupełnej hemolizie
dodany do izotonicznego roztworu
rozpuszczalnik rozpuścił lipidową cześć
otoczki krwinek i spowodował hemolizę
digitonina (saponina) mimo izotoniczności
roztworu tworzy z cholesterolem otoczki
digitonid i powoduje hemolizę
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
7
5 ml 1,5 % roztworu
mocznika (249 mmol/l)
– izotoniczny, 3 krople
krwi
roztwór przezroczysty, krwinki
zhemolizowane
mocznik łatwo przenika do wnętrza krwinek
i, mimo Ŝe jego roztwór jest izotoniczny,
wywołuje hemolizę jak woda destylowana
B Oznaczanie oporności krwinek czerwonych na działanie roztworów hipotonicznych
W statywie umieszcza się 21 suchych, zaopatrzonych kolejnymi numerami stoŜkowatych probówek
wirówkowych. Do pipety z podziałkami co 0,01 ml nabiera się 1 ml 1 % roztworu soli kuchennej (171, 1
mmol/l). Do pierwszej probówki nalewa się 0,7 ml, a do 21. resztę, tj. 0,3 ml. Następny mililitr tego roztworu
dzieli się tak, Ŝe do probówki 2. wlewa się 0,68 ml, a do probówki 20. resztę, tj. 0,32. Postępując w analogiczny
sposób, nalewa się do kaŜdej kolejnej probówki od początku szeregu o 0,02 ml mniej, a do kaŜdej kolejnej
probówki od końca szeregu o 0,02 ml więcej niŜ do poprzedniej, aŜ do napełnienia wszystkich probówek. Z
kolei kaŜdą probówkę z odmierzoną ilością roztworu NaCl dopełnia się wodą destylowana do objętości 1 ml,
postępując jak poprzednio, tylko w odwrotnej kolejności. W ten sposób przygotowuje się szereg rozcieńczeń soli
kuchennej od 0,7 % do 0,3 % (119 – 5 mmol/l) z przeskokami od próbówki poprzedniej do następnej o 0,02 %
NaCl (3,42 mmol/l).
Do kaŜdej z tak przygotowanych probówek dodaje się 2 – 3 krople świeŜo z Ŝyły pobranej krwi albo
zawiesiny przemytach krwinek czerwonych, zmieszanych stosunku 1 : 5 z fizjologicznym roztworem NaCl.
JuŜ po 15 min od chwili zmieszania krwi z roztworem moŜna odczytać wynik, ale poleca się równieŜ
drugie odczytywanie po 2 godzinach. Przed odczytaniem wyniku powinno się poddać wszystkie próbówki
kilkunastominutowemu wirowaniu.
Odczytanie wyniku polega na znalezieni stęŜenia soli kuchennej w probówce, w której roztwór nad
opadłymi – nie zhemolizowanymi – krwinkami jest jeszcze bezbarwny. To najmniejsze stęŜenie roztworu, w
którym jeszcze nie wystąpiła hemoliza, stanowi minimalna granicę oporności, w warunkach prawidłowych
0,46 % NaCl (78,7 mmol/l), gdyŜ juŜ w roztworze następnej próbówki o 0,02 % mniejszym stęŜeniu zaczyna się
właśnie hemoliza najmniej opornych krwinek.
Wreszcie odszukanie probówki, w której na dnie znajduje się najmniejszy osad krwinek czerwonych nie
zhemolizowanych oznacza granicę maksymalnej oporności, gdyŜ juŜ w następnej probówce o stęŜeniu 0,02 %
mniejszym wszystkie krwinki uległy hemolizie i na dnie probówki nie dostrzega się Ŝadnego osadu. Dokładniej
badanie to wykonuje się za pomocą zbuforowanych roztworów NaCl, gdy stopień hemolizy ocenia się
fotoelektryczne w płynie po odwirowaniu kaŜdej probówki i wyraŜa się w procentach.
(...)
11 Ilościowe oznaczanie hemoglobiny
Ilość hemoglobiny moŜna oznaczyć jedną z następujących metod: chemiczną, kolorymetryczną,
spektrofotometryczną, gazometryczną i refraktometryczną.
Metoda chemiczna polega na tym, Ŝe w odmierzonej objętości krwi określa się zawartość Ŝelaza.
Uwzględniając znany fakt, Ŝe na 100 g Hb przypada 0,336 g Fe, ławo juŜ obliczy się ilość Hb w badanej próbce,
a ostateczny wynik poda w g Hb / 100 ml badanej krwi. Metody tej nie stosuje się praktycznie w celach
klinicznych. Ma ona jednak waŜne znaczenie jako dokładna metoda sporządzania wzorców do łatwiejszych
metod stosowanych praktyce.
Metody kolorymetryczne polegają na porównywaniu intensywności zabarwienia roztworu po
zhemolizowaniu badanej krwi z roztworem wzorcowym o znacznym stęŜeniu hemoglobiny. W tym celu moŜna
porównywać niezmieniony chemicznie barwnik krwi w postaci hemoglobiny, oksyhemoglobiny lub
karboksyhemoglobiny badanej próbki z wzorcowymi roztworami odpowiednich postaci hemoglobiny.
Intensywność i właściwości zabarwienia są jednak wtedy w znacznej mierze zaleŜne od stopnia utlenowania lub
wysycenia tlenkiem węgla.
Dlatego teŜ zwykle porównuje się kolor hematyny, czyli oksyheminy uzyskanej z badanej krwi pod
wpływem kwasu solnego, z z wzorcowym roztworem kwaśnej hematyny, powstałej ze znanej ilości
hemoglobiny. W ten sposób kolorymetria staje się niezaleŜna od stopnia utlenowania krwi uŜytej do badania,
gdyŜ zabarwienie kwaśnej hematyny jest juŜ zaleŜne tylko od ilości hemoglobiny w badanej próbce, a nie od
stopnia jej wysycenia tlenem. Poza tym wzorcowe roztwory kwaśnej hematyny są o wiele bardziej trwałe niŜ
roztwory nie zmienionej hemoglobiny, zawierającej białko i Ŝelazo dwuwartościowe. Ostatnio stosuje się w tym
celu cyjanometemoglobinę.
Metoda gazometryczna polega na tym, Ŝe próbkę krwi całkowicie uprzednio nasyconą tlenem pozbawia
się w próŜni pochłoniętego tlenu, którego objętość dokładnie mierzy się odpowiednimi przyrządami. Biorąc pod
uwagę, Ŝe 1 g Hb wiąŜe – a więc moŜe teŜ uwolnić – 1,34 ml O2, moŜna ze znanej ilości uwolnionego tlenu
obliczyć ilość wiąŜącej go hemoglobiny i określić ją w g / 100 ml badanej krwi.
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Metoda fotometryczna, elektrofotometryczna lub spektrofotometryczna polega na tym, Ŝe światło o
danej długości fali przepuszcza się przez roztwór badanej krwi o znanej grubości warstwy i ustala się, jaka
róŜnica powstała między siła światła padającego a przepuszczonego, czyli ile światła zostało pochłonięte przez
roztwór hemoglobiny lub barwnika z niej powstałego. MoŜna to określić na oko lub bardzo dokładnie zmierzyć
za pomocą odpowiednich fotometrów elektrycznych.
Znając długość fali uŜytego światła, grubość warstwy roztworu badanej krwi, przez którą światło
przechodzi oraz stopień ekstynkcji lub przepuszczalności światła w tym przypadku i stałą ich zaleŜność od
stęŜenia barwnika wzorcowego bardzo dokładnie i łatwo moŜemy juŜ obliczyć, jakie jest stęŜenie Hb w
badanym roztworze, a tym samym – jaka jest jej wartość w 100 ml badanej krwi.
Metoda refraktometryczna polega na pomiarze współczynnika załamywania światła w roztworze
przygotowanym z badanej krwi. Znając zaleŜność między tym współczynnikiem a stęŜeniem hemoglobiny w
roztworze moŜna obliczyć stęŜenie, a przez to ilość hemoglobiny w badanej próbce krwi.
W klinikach wystarczają przewaŜnie prostsze metody kolorymetryczne, dające wprawdzie wynik z
błędem około ± 5 %, ale za to szybkie i łatwe do wykonania. Na tej zasadzie opiera się najczęściej stosowna
metoda Sahliego. Odmierzoną ilość krwi miesza się z kwasem solnym, aby hemoglobiną przemienić w kwaśną
hematynę, którą porównuje się kolorymetrycznie z odpowiednimi wzorcami. Obecnie najczęściej oznacza się
ilość hemoglobiny na podstawie fotoelektrycznego określenia stęŜenia jej pochodnej cyjanowodorowej – metodą
Drabkina.
A Metoda Sahliego
Aparat Sahliego składa się z oprawki, w której przed matową szybką stoją dwa zworce barwne.
Zabarwienie wzorców odpowiada barwie kwaśnej hematyny, tj. chlorohemicy uzyskanej z krwi człowieka o
prawidłowej zawartości hemoglobiny rozcieńczonej 0,1 M kwasem solnym (100 mmol/l) w stosunku 1 : 100.
Sahli uwaŜał za prawidłową krew, która zawiera 17,3 Hb w 100 ml. Między te wzorce wstawia się
wykalibrowaną próbówkę pomiarową.
Pierwotne hematokryty miały rurki pomiarowe z jedną podziałką w stopniach Sahliego. Kontrolne
badania wykazały jednak, Ŝe większość zdrowych ludzi w naszych warunkach geograficznych nie osiąga 100o
Sahliego. Wprowadzono przeto drugą podziałkę, a mianowicie w procentach w stosunki do normy. Norma ta
wynosi dla męŜczyzn 16, a dla kobiet 14,4 g Hb / 100 ml krwi (9,93 i 8,93 mmol/l). Wreszcie bywają rurki
pomiarowe z podziałką bezpośrednio w gramach hemoglobiny / 100 ml krwi.
Z jaką skalą mamy do czynienia, moŜna się zorientować po tym, Ŝe podziałka wyraŜona małymi
liczbami (do 24) oznacza gramy Hb w 100 ml. Spośród dwóch skal wyraŜonych liczbami ponad 100, ta jest
podziałką procentową, która ma większe liczby, a skalą Sahliego jest ta, której liczby są mniejsze i podziałka 80
odpowiada podziałce 100 na poprzedniej skali, zatem 16 g = 100 % = 80o Sahliego (obecnie rzadko stosowane).
Zwykła pipetką nalewa się 0,1 M kwasu solnego (100 mmol/l) do podziałki 10 w środkowej rurce
hemoglobinometru Sahliego. W miarową pipetkę tego aparatu naciąga się 20 ul krwi z nakłutej opuszki palca,
jak opisano przy liczeniu krwinek. Pipetkę wyciera się z ewentualnych śladów krwi na zewnątrz i sprawdza, czy
nieprzerwany słupek krwi w kapilarze sięga dokładnie do podziałki 20. Ewentualny nadmiar krwi w pipetce
obciąga się przez wylotu bibuła filtracyjną lub watą. Wylot pipetki wprowadza się pod powierzchnię kwasu w
próbówce pomiarowej i ostroŜnie wydmuchuje się krew, która opada na dno. Kwasem nie zmieszanym jeszcze z
krwią przemywa się wnętrze pipetki przez dwukrotne naciągnięcie do podziałki 20 i ponowne wydmuchnięcie
do probówki.
Mniej więcej przez minutę potrząsa się probówką wyjęta ze statywu, aŜ krew dobrze zmiesza się z
kwasem, ulegnie hemolizie, a hemoglobina przejdzie w kwaśną hematynę, tzn. aŜ powstanie roztwór
ciemnobrunatny i przejrzysty. JeŜeli krew częściowo skrzepnie i w roztworze widzi się zawiesiną grudek
skrzepu, doświadczenia trzeba powtórzyć, oczyściwszy przedtem przyrządy. Mieszając następnie zawartość
probówki szklana pałeczką, dolewa się kroplami wodę destylowana tak długo, aŜ kolory badanego roztworu i
wzorców dokładnie się zrównają. NaleŜy uwaŜać, aby szklanym pręcikiem do mieszania nie wynieść poza
probówkę ani kropli płynu. W tym celu wskazane jest albo nie wysuwać go całkowicie z rurki albo dokładnie
wycierać o wewnętrzne jej ścianki.
Całe doświadczenie trzeba tak wykonywać, aby wynik był odczytany po upływie 3 minut od momentu
zmieszania krwi z kwasem. Pomiar powinien być wykonany przy świetle dziennym. Cyfry podziałek na
probówce pomiarowej powinny być zwrócone na boki, a więc do roztworów barwnych, aby nie przeszkadzały w
polu widzenia.
Metoda Sahliego jest obciąŜona licznymi błędami. Dlatego teŜ wszystkie laboratoria dysponujące juŜ
fotokolorymetrami stosują jedną z metod elektrofotometrycznych, najczęściej cyjnomethemoglobinową metodę
Drabkina.
B Metoda Drabkina
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Do małej probówki z korkiem, np. fiolki po penicylinie, odmierza się 5 ml odczynnika Drabkina, który
zawiera 0,305 g Ŝelazicyjanku potasowego, 1,0 g kwaśnego węglanu sodowego i 0,05 g cyjanku potasowego w
jednym litrze wody. Do tego dodaje się 0,02 ml krwi, zamyka korkiem, miesza i czeka przynajmniej 5 minut, aŜ
z hemoglobiny wytworzy się cyjanomethemoglobina. Wtedy spektrofotometrycznie mierzy się ekstynkcję przy
długości fali 540 nm, uwzględniając analogiczny pomiar próby zerowej, czyli z odczynnikami bez próbki krwi.
Podstawiając znalezione wartości do wykresu kalibracyjnego lub teŜ do wzoru razem z ekstynkcją wzorcowego
roztworu cyjanomethemoglobiny, znajduje się g % Hb w badanej krwi.
(...)
C Obliczanie wskaźnika barwnego
Ustalenie wskaźnika barwnego krwi – WB – pozwala zorientować się ile hemoglobiny w stosunku do
normy zawierają poszczególne krwinki czerwone. Wskaźnik poucza czy mamy niedokrwistość nadbarwiliwą
czy niedobarwliwą. Prawidłowa krew zawiera prawidłową liczbą krwinek czerwonych i prawidłową ilość
hemoglobiny, czyli kaŜda krwinka zawiera prawidłową ilość hemoglobiny. Wskaźnik takiej krwi, jako stosunek
normy do normy wynosi 1.
WB = 100 % tj. norma Hb ( u męŜczyzny 16 g / 100 ml, czyli 9,93 mmol/l) / 100 % tj. norma krwinek (u
męŜczyzny 5 mln / 1 ul, czyli 5 T / l) albo (100 % Hb = 100) / (2 x 50 = 100) = 1
Wskaźnik ten znajduje się, dzieląc procentową zawartość hemoglobiny w badanej krwi przez liczbą
otrzymaną z podwojenia pierwszych dwóch cyfr liczby oznaczającej ilość krwinek czerwonych w 1 ul tej krwi.
Gdy indeks jest większy od jedności, to poszczególne krwinki czerwone mają za duŜo Hb
(hyperchromia), a gdy jest mniejszy od jedności, to ilość Hb w pojedynczych krwinkach czerwonych jest za
mała (hipochromia). Wartości prawidłowe WB mieszczą się w granicach 0,85 – 1,15.
(...)
12 Oznaczanie czasu krwawienia
Odstęp czasu między sztucznie wywołanym małym skaleczeniem skóry a ustaniem krwawienia z tego
miejsca nazywamy czasem krwawienia. Prawidłowy czas krwawienia waha się od 2 do 6 minut. Czas ten zaleŜy
od krzepliwości krwi, jednak w większym jeszcze stopniu od właściwości naczyń krwionośnych oraz liczby i
cech czynnościowych krwinek płytkowych.
Czas krwawienia przedłuŜa się w następujących przypadkach: niedobór witaminy C, toksyczne lub
zakaźna uszkodzenie ściany naczyń krwionośnych, niedostateczna szybkość krzepnięcia krwi oraz zmniejszona
liczba płytek krwi albo upośledzona ich czynność.
Czas krwawienia moŜna oznaczyć za pomocą bibuły filtracyjnej. OdkaŜoną opuszka palca nakłuwa się
jałowym ostrze na głębokość około 3 mm. Notuje się czas nakłucia. Następnie co 30 s dotyka się bibułą
filtracyjną miejsca krwawiącego. Ślady krwawe na bibule, gdy kaŜde dotknięcie zaznaczone jest w oddzielnym
miejscu, stają się coraz słabsze, aŜ wreszcie bibuła przestaje się barwić. Ten moment oznacza koniec
krwawienia.
13 Oznaczanie czasu krzepnięcia
Czas krzepnięcia, czyli odstęp czasu od chwili wynaczynienia krwi do momentu ej skrzepnięcia, moŜna
oznaczyć wieloma metodami. Podając wynik trzeba dodać, jaką metodą i w jakiej temperaturze został
osiągnięty, gdyŜ róŜne metody dają rozmaite wielkości czasu krzepnięcia. Pełną wartość porównawczą mają
tylko wyniku uzyskane jedną metodą w jednakowych warunkach pomiaru.
A Metoda Vierordta
Oczyszczoną opuszka palca nakłuwa się, notuje czas i wyciera pierwszą kroplę krwi. Do następnej
dostawiamy jeden koniec poziomo trzymanej rurki, do której krew wnika na przestrzeni 0,5 do 2 cm. Przez drugi
koniec rurki wprowadza się włos, który po upływie 3 min zaczyna się przesuwać przez słupek krwi, pociągając
go w jednym kierunku co 15 s zawsze w kilka milimetrów. Obserwujemy, kiedy na włosie dadzą się zauwaŜyć
czerwone plamki, pochodzące od krzepnącej krwi i kiedy znów przestaną się pojawiać. Te momenty oznaczają
początek i koniec krzepnięcia, a czas od chwili pojawienia się krwi na opuszce palca do początku krzepnięcia
oznacza czas krzepnięcia.
B Metoda kroplowa
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
Na środku wklęsłej powierzchni jednego szkiełka zegarkowego daje się duŜą kroplę krwi i przykrywa
się drugim szkiełkiem odwróconym wypukłością ku górze. Obydwa szkiełka trzyma w płaszczyźnie poziomej
między kciukiem a palcem wskazującym. Następnie ostroŜnie przechyla się szkiełka w kierunku płaszczyzny
pionowej i wraca do poziomu. Te ruchy wykonuje się zwykle co 30 s, poczynając od czwartej minuty po
wynaczynieniu krwi. Początkowo nie przyczepiona jeszcze do podstawy kropla krwi ślizga się po szkiełku
podczas pochylania w kierunku działania siły cięŜkości. W pewnej chwili przestaje się ślizgać, gdyŜ wydzielone
pierwsze nitki włóknika przyczepiają krew do podstawy. Jest to początek krzepnięcia. Wreszcie po pewnym
czasie kropla nie tylko nie posuwa się ku dołowi w pionowym ustawieniu szkiełek, ale teŜ nie odkształca się
więcej w postaci zwisającego woreczka. Jest to chwila oznaczająca koniec krzepnięcia.
(...)
15 Oznaczanie szybkości opadania krwinek (odczyn Biernackiego, OB)
Szybkość rozdzielania się nie krzepnącej krwi na górną warstwę osocza i dolną, zawierającą składniki
postaciowe, jest w warunkach prawidłowych stała. Zrozumiałe jest, Ŝe cięŜsze krwinki czerwone (cięŜar
właściwy 1,090) zawieszone w osoczu o znacznie mniejszym cięŜarze właściwym (1,027), pozostające w
spokoju poza organizmem, musza pod działaniem siły cięŜkości opadać i oddzielać się od osocza. Objaśnienia
wymaga jednak fakt, Ŝe krwinki opadają szybciej, niŜby się tego moŜna spodziewać, uwzględniając tylko silę
ciąŜenia działającą na pojedyncze komórki w osoczu. Według takiego rozumowania erytrocyty powinny opadać
z prędkością około 0,2 mm / h. W rzeczywistości opadają jednak szybciej, gdyŜ układają się w róŜnej wielkości
zespoły, co znane jest pod nazwą agregacji. Szybkość opadania krwinek zaleŜy przeto od tego, jak łatwo i w jak
wielkie zespoły układają się erytrocyty. JeŜeli agregacja prowadzi do powstawania zlepów po 10 komórek, to
krwinki opadają z prędkością 1 mm / h. W przypadku powstawania zlepów, z których kaŜdy zawiera około
50 000 erytrocytów, prędkość sedymentacji zwiększa się do 75 mm / h.
Ogólnie mówiąc, przyspieszenie sedymentacji powodują: zwiększenie zdolności agregacyjnej krwinek
czerwonych, zmniejszenie ich liczby oraz zwiększenie frakcji globulinowej w stosunku do albuminowej w
osoczu i wzrost lepkości. Wydaje się, Ŝe najwaŜniejszą przyczyną zmian sedymentacji jest stosunek globulin do
albumin w osoczu. Gdy globuliny zyskują przewagę, zmniejsza się ładunek elektryczny krwinek czerwonych i
zwiększa sie ich zdolność zlepna, a przez to zwiększa się szybkość sedymentacji i na odwrót. Oznaczenie tej
szybkości jest przeto prostą metodą, pozwalającą wnioskować o zmianach, jakie zachodzą w osoczu podczas
wielu stanów patologicznych.
Fizjologiczne przyspieszenie sedymentacji występuje po obfitych posiłkach, po gorących kąpielach, w
czasie miesiączkowania i w ciąŜy; szybkość opadania jest najmniejsza u noworodków; jest ona równieŜ mniejsza
rano niŜ po południu.
W stanach chorobowych przyspieszenie sedymentacji powodują: nowotwory złośliwe, kiła, gościec
stawowy, gruźlica i inne choroby zakaźne oraz procesy zapalne, niedokrwistość złośliwa, przewlekłe zatrucie
morfiną i inne. Zwolnienie sedymentacji wytęp uje w pewnych chorobach wątroby, wskutek naduŜycia chininy i
w niektórych stanach uczulenia.
Ze względu na ilość krwi konieczną do oznaczenia szybkości opadania rozróŜniamy metody makro i
mikro. W pierwszych konieczne jest pobranie krwi przez nakłucie Ŝyły, w drugich wystarcza ilość krwi, jaką
moŜemy uzyskać przez nakłucie opuszki palca u dorosłych lub pięty u małych dzieci.
A Pobierane krwi przez nakłucie Ŝyły
W celu pobrania krwi z Ŝyły przygotowuje się strzykawkę ,kilka igieł do wstrzyknięć doŜylnych i
szczypczyki anatomiczne wyjałowione przez gotowanie co najmniej 15 minut w wodzie destylowanej albo w
autoklawie pod ciśnieniem 2 atm.
ObnaŜone ramię podpiera się tak, aby zgięcie łokciowe zwrócone było ku górze. Przedramię powinno
być wyprostowane, a pięść zaciśnięta. Dookoła ramienia zakłada się opaskę w celu wywarcia ucisku większego
niŜ ciśnienie w Ŝyłach, ale mniejszego niŜ ciśnienie skurczowe w tętnicach. W ten sposób zamyka się odpływ
krwi Ŝylnej, a pozostawia swobodny dopływ krwi tętniczej, wskutek czego Ŝyły nabrzmiewają i łatwo mogą być
nakłute.
Ostrze igły kieruje się w stronę najlepiej widocznej lub wyczuwalnej Ŝyły w przegubie łokciowym.
Miejsce to trzeba przedtem dokładnie oczyścić watą zwilŜoną w eterze lub alkoholu. Gdy wyschnie środek
odkaŜający, igłę wkłuwa się w miejsce gdzie Ŝyła jest najlepiej wypełniona. Po przebiciu skóry tak nachyla się
strzykawkę, aby igła przebiegała równolegle do podłuŜnej osi Ŝyły i jednym ruchem przekłuwa się przednią
ścianę Ŝyły, wsuwając do niej igłę na mała głębokość w kierunku dosercowym. OstroŜnie przekłada się teraz
strzykawkę w lewą rękę, opartą o nakłuwane przedramię, a prawa delikatnie cofa się tłok strzykawki, aby
upewnić się, czy koniec igły tkwi w Ŝyle, co objawia się napływem krwi do strzykawki. W ten sposób moŜna
naciągnąć do strzykawki poŜądaną ilość krwi, zwolnić ucisk na ramieniu, przyłoŜyć jałowy tamponik z gazy lub
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
waty zwilŜonej w alkoholu tuŜ nad miejscem nakłucia i znów jednym ruchem wyciągnąć igłę z Ŝyły. Przez kilka
minut naleŜy lekko przyciskać miejsce nakłucia tamponikiem lub nałoŜyć mały opatrunek z elastycznego
przylepca.
Podobnie wykonuje się wstrzyknięcia doŜylne, z ta tylko róŜnicą, Ŝe przed nakłuciem wypełnia się
strzykawkę i igłę odpowiednim płynem, tak aby nie było w nich powietrza. Po zaaspirowaniu krwi zdejmuje się
opaskę uciskową i powoli wtłacza płyn do Ŝyły.
Na ćwiczeniach z fizjologii studenci powinni najpierw wykonać nakłucie Ŝyły brzeŜnej małŜowiny
usznej u królika lub Ŝyły odpiszczelowej psa i wstrzyknąć doŜylnie fizjologiczny roztwór NaCl. Nakłuwania
Ŝyły u człowieka musi z pełna odpowiedzialnością dopilnować asystent lekarz.
B Metoda Westergrena
Aparat Westergrena składa się ze statywu i rurek pomiarowych. Rurka szklana długości 30 cm i
średnicy wewnętrznej 2,5 mm jest od dołu zaopatrzona w podziałkę milimetrową na przestrzeni 20 cm w ten
sposób, Ŝe ostatnia dolna kreska podziałki = 200, a pierwsza górna = 0.
Rurkę napełnioną od dołu aŜ do podziałki o mieszaniną 4 części krwi i 1 części 3,8 % cytrynianu
sodowego ustawia się pionowo na środku gumowego korka tkwiącego w podstawie statywu. Na górny wylot
rurki nakłada się spręŜynowy zacisk statywu, tak aby rurka ściśle przylegała dolnym wylotem do gumowej
podstawki, co uniemoŜliwi wylewanie się krwi. W badaniach seryjnych 1,6 ml krwi z kaŜdej strzykawki wlewa
się najpierw do oddzielnej próbówki z 0,4 ml roztworu cytrynianu. Po skończeniu pobierania krwi zawartość
kaŜdej probówki ponownie miesza się i naciąga przez aspirację do pipet Westergrena.
Po upływie jednej godziny odczytuje się wartość słupa przezroczystego osocza nad nieprzerwaną
warstwą krwinek. Wielkość ta oznacza szukaną szybkość sedymentacji. Klinicznie waŜny jest takŜe wynik
odczytany po 2 h, jak równieŜ wskaźnik obliczony z wyniku po pierwszej i drugiej godzinie.
C Metody mikro
W przypadku gdy pobranie krwi z Ŝył napotyka trudności, musimy wykonać OB z krwi pobranej przez
nakłucie opuszki palca jedną z metod mikro.
Aparat mikrosedymentacyjny składa się ze statywu, rurek pomiarowych, małych próbówek i ustnika z
węŜykiem. Rurka o średnicy wewnętrznej 1 mm i długości 15 cm jest zaopatrzona na całej długości w
milimetrową podziałkę, a po napełnieniu krwią moŜe być ustawiona pionowo na statywie jak w aparacie
Westergrena.
Do małego naczyńka nalewa się 5 % roztwór cytrynianu sodowego (169 mmol/l). Na górny koniec
rurki sedymentacyjnej nakłada się węŜyk zakończony ustnikiem. Aspirując przez ustnik naciąga się cytrynian w
rurkę do podziałki 3 cm i wdmuchuje go do małej próbówki naleŜącej do aparatu.
Dolny koniec poziomo trzymanej rurki dostawia się do duŜej kropli krwi na opuszce nakłutego palca,
aby naciągnąć krwi do podziałki 12 cm. Dla uniknięcia skrzepu trzeba krew natychmiast wydmuchać do
probówki, w której zmiesza się z cytrynianem w stosunku 1 : 5. Tej mieszanki nabiera się teraz w rurkę do
podziałki 100 i ustawia w statywie. Wynik odczytany po pierwszej i drugiej godzinie zgadza się z wielkościami,
jakie daje powszechnie uŜywana metodę Westergrena, gdy prędkość opadania nie jest większa niŜ 30 mm / h.
UŜywając najczęściej stosowanej metody Westergrena lub innych metod dających zgodnie z niŜ wyniki,
przyjmuje się jako prawidłową wartość sedymentacji następujące wartości: po 1 h u noworodków 1 – 2 mm, u
męŜczyzn 2 – 6 mm, u kobiet 3 – 10 mm. Średnią szybkość opadania znajdziemy, jeśli do wartości odczytanej
po pierwszej godzinie dodamy pół ogólnej wartości po 2 godzinach sumę tę podzielimy przez 2. Ta wielkość
wynosi dla kobiet 2 – 8, a dla męŜczyzn 2 – 4 mm.
(...)
17 Oznaczanie grup krwi
(...)
Istnieją róŜne metody oznaczania grup krwi. Najczęściej stosuje się metodę, w której uŜywa się surowic
wzorcowych. Jedna z nich zawiera tylko aglutyniny alfa, czyli anty-A, druga natomiast beta, czyli anty-B.
Do osobnych kropli surowic wzorcowych dodaje się badanych krwinek w postaci 5 % zawiesiny
(50 ml / l) uzyskanej przez 20-krotne rozcieńczenie izotonicznym roztworem cytrynianu sodowego i obserwuje
się, w której z wzorcowych badane krwinki uległy aglutynacji, aby na tej podstawie ocenić, do jakiej musiały
naleŜeć grupy.
JeŜeli aglutynacja nie wystąpi w surowicy beta, czyli anty-B, ani w surowicy alfa, czyli anty-A, tzn. Ŝe
badane krwinki nie zawierają antygenu A ani antygenu B, badana krew naleŜy więc do grupy 0.
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
JeŜeli aglutynacja wystąpi tylko w surowicy alfa, czyli anty-A, badane krwinki zawierają jedynie
antygen A, a więc badana krew naleŜy do grupy A.
JeŜeli aglutynacja nastąpi tylko w surowicy zawierającej aglutyninę beta, czyli anty-B, to badane
krwinki mają jedynie antygen B, a więc krew tak naleŜy do grupy B.
JeŜeli aglutynacja nastąpi zarówno w surowicy anty-B, jak i w surowicy anty-A, tzn. Ŝe badane krwinki
musiały zawierać antygen A i B, a więc krew taka naleŜ do grupy AB.
Dla kontroli moŜna uŜywać surowicy grupy 0 zawierającej aglutyninę alfa i beta.
Surowice do oznaczania grup krwi kupuje się zazwyczaj gotowe, chociaŜ moŜna je sporządzić samemu
z krwi osób z znanej grupie. Powinny one być świeŜe, zawarte w jałowych i hermetycznie zamkniętych
naczyniach, a miano ich nie powinno być mniejsze niŜ 1 : 32, tzn. Ŝe rozcieńczone nawet 32 razy powinny
jeszcze aglutynować 5 % zawiesinę krwinek odpowiedniej grupy (50 ml / l). Surowice te przechowuje się w
pomieszczeniach ciemnych i w temperaturze ok. + 5oC.
A Oznaczanie grup krwi za pomocą surowic wzorcowych na szkiełku podstawowym
Szkiełko podstawowe umieszcza się na białym podkładzie. Na środek szkiełka wlewa się kroplę
surowicy wzorcowej 0 (alfa + beta), bliŜej jednego końca umieszcza się kroplę wzorcowej surowicy beta, a
bliŜej drugiego końca kroplę surowicy wzorcowej alfa. Do szkiełka zegarkowego nalewa się roztworu
cytrynianu sodowego. Nakłuwa się opuszkę palca, aby w mieszalnik Potaina nabrać badanej krwi do podziałki
0,5 i uzupełnić cytrynianem do podziałki 11. Po wymieszaniu usuwa się 2 pierwsze krople z mieszalnika.
Następnie do kaŜdej z 3 kropel surowic wzorcowych daje się po kropli zawiesiny badanej krwi z mieszalnika.
Pałeczką szklaną lub naroŜnikiem szkiełka podstawowego mieszamy zawiesinę krwi z kroplą surowicy,
rozpościerając ją na przestrzeni o średnicy około 15 mm. Szkiełko podstawowe chwyta się za długie krawędzie i
kołysząc nim obserwuje się aglutynację, która powinna wystąpić przed upływem 5 minut. Dla kontroli ogląda się
kaŜdą kroplę przez szkło powiększające lub mikroskop i według powyŜszego opisu znajduje się, do jakiej grupy
naleŜała badana krew.
Aglutynacja prawdziwa, czyli zachodząca pod wpływem aglutynin, polaga na bezładnym zlepianiu się
krwinek w róŜnej wielkości grudki i odznacza się duŜą trwałością.
Czasami po liku minutach od chwili zmieszania badanej krwi z surowicą wzorcową wystepuje pseudo
aglutynacja, czyli aglutynacja pozorna, zwana równieŜ agregacją, czyli odbywa się bez udziału aglutynin, a
polega na układaniu się krwinek czerwonych w ruloniki. Makroskopowo dostrzega się w badanej krwi
równomierną i drobną ziarnistość agregacji, widoczną przez warstwę przejrzystej cieczy. Ziarnistość tego typu
jest nietrwała, gdyŜ wymieszanie przez wstrząśnięcie szkiełkiem, szczególnie po dodaniu fizjologicznego
roztworu soli, prowadzi do ponownego pojawienia się równomiernej i nieprzejrzystej zawiesiny.
W odróŜnieni od agregacji gruba ziarnistość prawdziwej aglutynacji utrzymuje się pomimo prób
mieszania lub rozcieńczania fizjologicznym roztworem soli.
Opisany sposób oznaczania grup krwi za pomocą surowic wzorcowych moŜna teŜ wykonać bez uŜycia
mieszalnika Potaina i cytrynianu sodowego do rozcieńczania krwi. NaroŜnik szkiełka podstawowego zanurza się
w kropli krwi wypływającej z ranki na opuszce palca. Przyczepioną do szkiełka małą ilość krwi przenosi się do
kropli jednej z surowic wzorcowych, umieszczonych jak poprzednio na szkiełku podstawowym. Mieszając
naroŜnikiem szkiełka podstawowego, otrzymuje się równomierną zawiesinę badanej krwi w surowicy
wzorcowej. W ten sposób przenosi się drugim naroŜnikiem szkiełka podstawowego badaną krew do drugiej
kropli surowicy wzorcowej i obserwuje się, gdzie wystąpi aglutynacja.
NaleŜ koniecznie przestrzegać, aby w tych wszystkich czynnościach nie przenieść nawet śladów
kurwicy z jednej kropli do drugiej, a więc przede wszystkim nie mieszać tym samym przedmiotem najpierw
jednej, a potem drugiej kropli i bardzo czysto myć szkło laboratoryjne.
Dokładniejsze wyniki oznaczania grup krwi za pomocą surowic wzorcowych uzyskuje się wykonując
badania nie w jednej kropli na szkiełku podstawowym, ale w nieco większej ilości surowic w małych
probówkach. W miarę potrzeby próby kontrolne prowadzi się w cieplarce o temperaturze 37oC.
B Próba zgodności krwi biorcy i dawcy bez posługiwania się izoaglutyninami wzorcowymi
Kiedy nie ma surowic wzorcowych zawierających znane izoaglutyniny i nie moŜna przygotować ich we
własnym zakresie, moŜna w inny sposób zorientować się, czy krew proponowanego dawcy będzie dobrze
znoszona przez biorcę, czy teŜ przetoczenie wykonać nie wolno, dopóki nie znajdzie się odpowiedniego dawcy.
W tym celu na środek szkiełka podstawowego z wyszlifowanym zagłębieniem opuszcza się kroplę
wody destylowanej, z która miesza się dokładnie krople biorcy. Gdy nastąpi hemoliza, dodaje się kroplę
cytrynianu sodowego. W ten sposób otrzymuje się płyn zawierający izohemaglutyniny biorcy. NaroŜnikiem
szkiełka podstawowego przenosi się do tego płynu kroplę krwi proponowanego dawcy. Po dokładnym
wymieszaniu obserwuje się, czy wystąpi aglutynacja krwinek dawcy pod wpływem aglutynin krwi biorcy. Na
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com
drugim szkiełku wykonuje się tę samą próbę w odwrotnym porządku, tzn. do zhemolizowanej kropli krwi
proponowanego dawcy dodaje się kroplę krwi biorcy. Jest to bardzo uproszczona próba krzyŜowa; gdy jej wynik
jes pozytywny, nie wolno przetaczać krwi od tego dawcy, lecz dobrać innego, z którego krwią próba krzyŜowa
wypadnie negatywnie.
Właściwą próbę krzyŜową wykonuje się dokładniej. Nie uŜywa się krwi zhemolizowanej i krwi pełnej,
lecz w obu częściach próby stosuje się osocze krwi dawcy lub biorcy, z którym miesza się 5 % zawiesinę
krwinek dawcy lub biorcy (50 ml / l), sporządzoną w 0,9 % roztworze NaCl (154 mmol/l) lub w odpowiednim
roztworze koloidalnym, a wynik odczytuje się po 30 min inkubacji w temperaturze 37oC.
Błędne oznaczanie grup krwi moŜe wynikać nie tylko z pomylenia aglutynacji prawdziwej z pozorną i
na odwrót, ale równieŜ z powodu pojawienia się nieswoistej aglutynacji i autoaglutynacji.
Aglutynacja nieswoista zachodzi wtedy, gdy badana krew jes dano pobrana zanieczyszczona
drobnoustrojami, które mają właściwość takiego zmieninia antygenów w krwinkach Ŝe aglutynują z kaŜdą
surowicą (zjawisko Thomsena).
Autoaglutynacja występuje w temperaturze od 0 do + 5oC i jest wywołana autoprzeciwciałami, które nie
mogą działać, gdy badania wykonuje się w temperaturze pokojowej.
W oznaczaniu grup krwi nie naleŜy posługiwać się hemolizynami, gdyŜ hemoliza w temperaturze
pokojowej jest mniej wyraźna i wymaga oprócz hemolizyn takŜe dopełniacza hemolitycznego. Surowice
wzorcowe do oznaczanie grup krwi pozbawia się dopełniacza przez podgrzewanie ich w ciągu 30 min do
temperatury + 55oC. W Ŝywym organizmie natomiast w przypadku przetoczenia krwi nieodpowiedniej grupy
występuje przede wszystkim hemoliza obok aglutynacji.
C Znaczenie czynnika Rh
(...)
Oprócz zgodności grupowej dawcy z biorcą w zakresie układu AB0 trzeba równieŜ zapewnić zgodność
pod względem antygenu Rh.
PoniewaŜ nie mamy surowicy anty-Rh jako izoprzeciwciał normalnych, musimy posiłkować się
surowicami odpornościowymi. Samo badanie odbywa się juŜ zasadniczo w sposób podobny jak w oznaczeniu
grup układu AB0.
Ze względu jednak na to, Ŝe przeciwciała anty-Rh naleŜą do tzw. przeciwciał niekompletnych, badanie
naleŜy prowadzić za pomocą wzorcowych surowic z dodatkiem odpowiedniego enzymu proteolitycznego, np.
papainy aktywowanej cysteiną. Przeciwciała niekompletne nie mają bezpośredniego dostępu do antygenów w
nie przygotowanej specjalnie otoczce krwinek czerwonych. Z tego powodu wzorcową surowicę anty-Rh miesza
się najpierw z równą objętością papainy aktywowanej cysteiną, a dalsze postępowanie jest juŜ podobne do
opisanego przy oznaczaniu grup AB0.
Created by Neevia Document Converter trial version http://www.neevia.com