Ekspresja genów związanych z opornością na leki w komórkach

&ARM0RZEGL.AUK†
%KSPRESJAGENÌWZWI’ZANYCHZOPORNOuCI’NALEKI
WKOMÌRKACHBIAŒACZKIPROMIELOCYTARNEJ(,†
EKSPONOWANYCHNACISPLATYNÃ
%XPRESSIONOFGENESASSOCIATEDWITHDRUGRESISTANCE
INPROMYELOTICLEUKEMIACELLS(,†EXPOSEDTOCISPLATIN
!DAM7ILCZOK!LICJA:AJDEL*AKUB7ILCZOK-ONIKA0AUL†3AMOJEDNY
+ATEDRAI:AKŒAD"IOFARMACJI7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
!PTEKA`'RANDnW#HORZOWIE
+ATEDRAI:AKŒAD'ENETYKI-EDYCZNEJ7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Efekt terapeutyczny cisplatyny jest wynikiem wytworzenia inter- i intramolekularnych wiązań z DNA i najczęściej prowadzi do śmierci komórki nowotworowej
w drodze apoptozy. Jednocześnie koordynacja cisplatyny
do DNA uaktywnia szereg mechanizmów prowadzących
do powstawania oporności takich jak: zmniejszenie transportu leku do komórki, usuwanie z komórki, sekwestracja z udziałem glutationu i metalotionein, naprawa DNA,
hamowanie apoptozy. Stosując technikę mikromacierzy
oligonukleotydowych (Affymetrix) porównano ekspresję
genów związanych z procesami odpowiedzialnymi za powstawanie oporności na lek w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę oraz
w komórkach kontrolnych. Analizując sygnały fluorescencji 770 sond, wyselekcjonowanych z bazy NetAffx
Analysis Center, reprezentujących ekspresję 412 genów,
wykazano najsilniejszy wzrost ekspresji genów TOP2A,
TOP1, KRAS, BIK, BAX, TFAM, GTSE1, CASP6 oraz
zmniejszenie ekspresji genów SLC7A11, CD70, MTF1,
ABCC3. Poznanie efektów zmienionej ekspresji tych
genów jest istotne zwłaszcza dla projektowania nowych
pochodnych platyny charakteryzujących się zwiększoną
skutecznością, które ponadto nie będą wywoływały narastania oporności na lek.
Abstract
Therapeutic effect of cisplatin results from formation of
inter- and intrastrand DNA crosslinks and usually leads to
death of tumour cells through apoptosis. At the same time
its incorporation and binding to DNA activate mechanisms
which cause resistance to the drug, such as decreased uptake, removal from the cell, sequestration by glutathione
and metallothionein, DNA repair, and inhibition of apoptosis. Using oligonucleotide microarray technique (Affymetrix) the expression of genes involved in development of drug resistance in promyelocytic leukemia HL-60
cells exposed to cisplatin and control cells was compared.
Analysis of the fluorescence signals of 770 probes, which
represented 412 genes selected from the NetAffx Analysis Center database showed highest expression increase of
TOP2A, TOP1, KRAS, BIK, BAX, TFAM, GTSE1, CASP6,
and inhibition of SLC7A11, CD70, MTF1, ABCC3. Elucidation of these genes altered expression effects seems
to be important, particularly in synthesis of new cisplatin
analogs, which besides increased efficiency, overcome
drug resistance.
Key words: cisplatin, gene expression, drug resistance,
promyelocytic leukemia cells, HL-60
Słowa kluczowe: cisplatyna, ekspresja genów, oporność
na lek, komórki białaczki promielocytarnej, HL-60
Wstęp
Efekt terapeutyczny cisplatyny, powszechnie stosowanego leku przeciwnowotworowego, jest wynikiem wytworzenia inter- i intramolekularnych wiązań z DNA. Mechanizm działania cisplatyny polega przede wszystkim na jej
aktywacji wewnątrz komórki poprzez zastąpienie dwóch
atomów chloru grupami hydroksylowymi, co w konse-
kwencji umożliwia wiązanie do DNA i tworzenie adduktów
[1], które powodują lokalne zaburzenie struktury podwójnej helisy i blokowanie procesów replikacji i transkrypcji,
co w konsekwencji prowadzi do zaburzeń w szlakach sygnałowych kontrolujących wzrost, różnicowanie czy odpowiedź na stres oksydacyjny wywoływany przez ten lek
[2]. Addukty cisplatyny z DNA są rozpoznawane przez
szereg białek komórkowych związanych, np. z szlakami na-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
prawy DNA, co najczęściej prowadzi do śmierci komórki
w drodze apoptozy [3]. Z drugiej strony wiązanie cisplatyny
do DNA uaktywnia cały szereg mechanizmów prowadzących do powstawania oporności i braku wrażliwości na ten
lek. Za oporność na cisplatynę odpowiedzialny jest przede
wszystkim niewystarczający transport do komórki [4]. Istnieją doniesienia o udziale w usuwaniu cisplatyny z komórki zależnych od ATP białek MDR1, MRP1, MRP2, MRP3,
jednakże późniejsze prace przypisują funkcję usuwania tego
leku przede wszystkim białkom związanym z transportem
miedzi, ATP-azom ATP7A oraz ATP7B [5]. Również nadekspresja glutationu oraz niektórych białek zawierających
grupy tiolowe, jak metalotioneina, powoduje oporność na
cisplatynę [6]. Wiązanie glutationu i cisplatyny jest katalizowane przez transferazy S-glutationowe, które zwiększając
właściwości anionowe związku, zwiększają jego usuwanie
z komórki poprzez zależną od ATP pompę S-koniugatów glutationu [7]. Oprócz niewystarczającej akumulacji cisplatyny
wewnątrz komórek, główną przyczyną braku wrażliwości
nowotworu na ten lek są procesy związane z możliwością
naprawy DNA oraz usuwaniem adduktów cisplatyna-DNA
[8]. W odróżnieniu od niewrażliwych komórek wielu guzów
wykazujących wzrost zdolności naprawczych polekowych
uszkodzeń DNA, znaczna wrażliwość komórek, np. raka jądra, wynika z upośledzenia ich zdolności do naprawy DNA.
Podstawowymi mechanizmami usuwającymi spowodowane
przez cisplatynę uszkodzenia DNA są: naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER), naprawa przez wycinanie zasad
(BER), naprawa źle sparowanych zasad (MMR) i naprawa
pęknięć DNA. Zwiększona tolerancja na wywołane przez
cisplatynę uszkodzenia DNA może także wystąpić na skutek utraty funkcji szlaku MMR. Pochodna cisplatyny, Eloxatin nie wywołuje powstawania oporności, gdyż mechanizm jej akumulacji nie zależy w tak znacznym stopniu od
transportera miedzi CTR1 [9]. Ponadto połączenia tego leku
z DNA nie są rozpoznawane przez białka MMR, podczas
gdy addukty cisplatyna - DNA są rozpoznawane przez białka MSH2, MSH3 i MSH6. Gdy komórki podlegają kolejnym
bezskutecznym cyklom naprawy DNA, poziom uszkodzeń
pozostaje wystarczający do uruchomienia mechanizmów
apoptozy. Kolejny z mechanizmów oporności związany jest
z omijaniem podczas replikacji przez polimerazy DNA B
i η miejsc w DNA, do których przyłączona jest cisplatyna
[10]. Tolerancja na cisplatynę może również być wynikiem
zmniejszonej ekspresji, albo utraty szlaków apoptozy, zarówno wewnętrznego jak i zewnętrznego, na skutek zmienionej aktywności białek takich jak P53, anty- i proapoptotycznych białek rodziny BCL2 oraz JNK [11].
W przedstawianej pracy, w celu pełniejszego wyjaśnienia
mechanizmów molekularnych decydujących o wrażliwości
komórek nowotworowych na cisplatynę, poddaliśmy ocenie
zmiany profilu ekspresji genów kodujących białka uczestniczące w transporcie wielolekowym, syntezie glutationu
i metalotionein, naprawie DNA oraz zmniejszaniu aktywacji
i hamowaniu indukcji szlaków apoptozy pod wpływem tego
leku. Do badań wykorzystaliśmy hodowane w warunkach
laboratoryjnych komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60. Do analizy ekspresji genów
zastosowano technikę mikromacierzy oligonukleotydowych
HG-U133A (Affymetrix).
Materiał i metody
Hodowle komórkowe
Materiał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60.
Komórki hodowano, zgodnie z zaleceniami ATCC, w standardowych warunkach (w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2), w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (Gibco)
z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS; Sigma),
100 Mg /ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma),
2 mM glutaminy (Sigma), 1 mM pirogronianu sodu (Sigma)
i 4,5 g/l glukozy. Po 48 godzinach inkubacji do hodowli dodawano roztwór cisplatyny (Sigma) rozpuszczonej w DMSO
(Sigma) tak, aby uzyskać stężenie 0,22 Mg/ml, odpowiadające wartości ID30 (Inhibitory Dose 30%). Hodowle kontrolne
prowadzono w identyczny sposób, dodając po 48 godzinach
czysty DMSO, stosowany ze względu na ograniczoną rozpuszczalność cisplatyny. Po sześcio godzinnej inkubacji komórki zbierano i przygotowywano do ekstrakcji RNA.
Ekstrakcja całkowitego RNA
RNA ekstrahowano z użyciem odczynnika TRIZOL
(Invitrogen Life Technologies), zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Ekstrakty
RNA oceniano jakościowo techniką elektroforezy w 1%
żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny oraz ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech).
Analiza aktywności transkrypcyjnej genów techniką
mikromacierzy oligonukleotydowych
Całkowite RNA (8Mg) zostało wykorzystane do syntezy
dwuniciowego cDNA (Gibco BRL SuperScript Choice system), które stanowiło matrycę do syntezy biotynylowanego
cRNA (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego cRNA przeprowadzono hybrydyzację
z mikromacierzą Test3, a następnie po pozytywnej weryfikacji z mikromacierzą HG-U133A (Affymetrix). Znakowanie
produktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo
kompleksem streptawidyna – fikoerytryna, znakowanymi
przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna – fikoerytryna zgodnie
z protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG–U133A w przewodniku Gene
Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). Następnie płytki mikromacierzy odczytywano używając skanera Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies). Otrzymane wyniki intensywności fluorescencji
zapisano i zarchiwizowano w programie Microarray Suite
oraz specjalnie do tego celu przygotowanej bazie danych.
Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono
po normalizacji wyników w programie RMA Express polegającej na przekształceniu logarytmicznym wartości sygnału fluorescencji dla każdego transkryptu (log2) wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.7,0, Gnumeric, oraz
Microsoft Excel. Wyodrębnienia grup genów związanych
&ARM0RZEGL.AUK
z powstawaniem oporności na lek dokonano korzystając
z bazy danych Affymetrix NetAffx™ Analysis Center
(http://www.affymetrix.com/ analysis/index.affx) po wpisaniu kwerend: drug resistance, cisplatin resistance, drug
transport, glutathione, metallothionein, SLC, MDR, DNA
repair oraz anti-apoptosis. Sumaryczny zbiór 770 sond stanowił podstawę do poszukiwania genów różnicujących. Z grupy
22283 sond mRNA, obecnych na mikromacierzy HG-U133A,
wyfiltrowano za pomocą arkusza programu Gnumeric sygnały fluorescencji charakteryzujące ekspresję wybranych transkryptów związanych z powstawaniem oporności na cisplatynę. Porównując sygnały fluorescencji sond zarejestrowane
dla komórek kontrolnych oraz komórek eksponowanych na
cisplatynę, wyznaczono zbiory, tzw. genów różnicujących
o ekspresji różniącej się, co najmniej, ± 2SLR.
Wyniki
Analizę profilu ekspresji genów, kodujących białka
związane powstawaniem w komórkach HL-60 oporności na
cisplatynę, poprzedzono porównaniem raportów wygenerowanych w programie Microarray Suite Affymetrix bezpośrednio po odczycie sygnałów fluorescencji na mikromacierzy. Prawidłowy rozkład znormalizowanych sygnałów fluorescencji (RMA Express) był podstawą do zakwalifikowania mikromacierzy do dalszych analiz. Za pomocą programu
Gnumeric, z grupy 22283 mRNA obecnych na mikromacierzy HGU133A, wyselekcjonowano sygnały fluorescencji
770 transkryptów związanych z powstawaniem oporności.
Wyznaczono parametr SLR (signal log ratio) wskazujący
wielokrotność różnicy sygnału fluorescencji, wyodrębniono
zbiór genów różnicujących transkryptomy komórek HL-60
kontrolnych oraz eksponowanych na cisplatynę.
Wykonane analizy pozwoliły na stwierdzenie, że w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę w porównaniu do komórek kontrolnych w największym stopniu stymulowana jest ekspresja genów TOP2A, TOP1, KRAS, BIK,
BAX, TFAM, GTSE1, CASP6, AP1S1 i BNIP3L. Genami,
których ekspresja została najbardziej zahamowana, okazały się SLC7A11, CD70, MTF1, ABCC3, FAS oraz SLC2A3.
Szczegółowe dane uwzględniające nazwy sond, symbole
genów, nazwy kodowanych białek, oraz wartości SLR dla
transkryptów różnicujących zestawiono w tabeli I. Geny
te pełnią bardzo istotne funkcje w procesach powstawania
oporności na lek.
Dyskusja
Zjawisko wytwarzania przez komórki nowotworowe
różnych mechanizmów obronnych stanowi jeden z głównych problemów we współczesnej terapii przeciwnowotworowej. Oporność nowotworów niewrażliwych na cisplatynę wynika najczęściej z niewystarczającej akumulacji
tego leku w komórce [12, 13]. Cisplatyna jest związkiem
o znacznej polarności, co powoduje, że przenika do komórek znacznie wolniej niż większość niskocząsteczkowych
leków przeciwnowotworowych. Wchłanianie cisplatyny
zależy od stężenia jonów sodu i potasu, pH oraz obecności
czynników redukujących. Oprócz dyfuzji biernej, transport
cisplatyny do wnętrza komórki zachodzi z udziałem białek
transportujących, kanałów jonowych oraz przezbłonowego
transportera miedzi CTR1. Zarówno miedź jak i cisplatyna, w zakresie stężeń występujących fizjologicznie w organizmie oraz podczas terapii, powodują obniżenie poziomu
CTR1 poprzez makropinocytozę i degradację z udziałem
proteasomów [5]. Kolejną przyczyną powstawania oporności komórek nowotworowych jest zmieniony transport
leków przeciwnowotworowych przez MDR-1, nadrodzinę
białek transportujących zależnych od ATP, oraz inne białka
oporności wielolekowej [12]. W przedstawianej pracy zaobserwowano obniżony poziom ekspresji ABCC3. Gen ten
koduje białko ABCC3 - kanalikularne białko 2 związane
z opornością wielolekową (canalicular multispecific organic
anion transporter 2; MRP3) należące do nadrodziny błonowych białek transportowych zależnych od ATP. Białka te
charakteryzują się znacznym polimorfizmem i powszechnie
występują w komórkach nowotworowych [14]. Innym genem, którego ekspresja w komórkach HL-60 pod wpływem
cisplatyny uległa obniżeniu, jest SLC2A3 kodujący błonowe
białka rodziny SLC2A, które są odpowiedzialne za transport
związków polarnych [15]. Chociaż udział tego przenośnika
w transporcie cisplatyny do komórek nie został dotychczas
opisany, nie można wykluczyć, że zaobserwowana w naszych eksperymentach zmniejszona ekspresja tego genu jest
wynikiem odpowiedzi komórki mającej na celu obniżenie
stężenia cisplatyny w cytoplazmie.
Przyczyną oporności na cisplatynę jest również podwyższone stężenie w cytoplazmie związków zawierających
grupę tiolową, takich jak glutation czy metalotioneiny, które
unieczynniają cisplatynę na skutek wiązania platyny i siarki
[6, 13]. Zwiększone stężenie metalotionein w komórkach
mysich powoduje 4-krotne, a w ludzkich komórkach raka
jajnika 7-krotne zwiększenie oporności na cisplatynę. Komórki raka jajnika wykazują ujemną korelację poziomu
glutationu oraz wrażliwości na cisplatynę. Badania dwóch
linii komórek raka jajnika, wywodzących się od tego samego pacjenta, wyizolowanych przed terapią i po zastosowaniu
cisplatyny wykazały 2,9 –krotny wzrost aktywności transferaz glutationowych, które katalizują sprzęganie glutationu
z cisplatyną [16]. Ponadto, udowodniono, że wytworzone
addukty cisplatyna-glutation są usuwane z komórki poprzez zależną od ATP pompę S-koniugatów glutationu. Już
w 1994 roku Ishikawa i wsp. wykazali, że oporności białaczki promielocytarnej HL-60 towarzyszy zwiększona
ekspresja zależnej od ATP pompy S-koniugatów glutationu
(MRP1 lub MRP2) [7]. W cytoplazmie, glutation przyłącza
się do cisplatyny, a w jądrze do adduktów cisplatyny z DNA,
uniemożliwiając w ten sposób utworzenie potencjalnie cytotoksycznych wiązań krzyżowych w DNA [17]. Rezultaty
naszych eksperymentów pokazują, że w komórkach HL-60
eksponowanych na cisplatynę ulega obniżeniu ekspresja
genu SLC7A11, kodującego specyficzne białko transportowe
cystyna/glutaminian uczestniczące w transporcie anionowej
formy cystyny do komórek. Ponieważ bardzo niska ekspresja tego białka na powierzchni niektórych komórek (m.in.
limfocytów) przy obniżonej dostępności cysteiny skutkuje
spowolnieniem syntezy glutationu, można się spodziewać,
że obniżenie ekspresji SLC7A11, świadczy o braku pierwotnej oporności związanej z nadmierną syntezą glutationu
w badanych komórkach [18]. Udział metalotionein w de-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
endocytozy oraz w aparacie Golgiego. Zwiększona ekspresja tego genu
jest zapewne związana
z dążeniem komórki do
sekwestracji cisplatyny, do
struktur pęcherzykowych,
nie mających bezpośredSymbol
Wartość
Nazwa sondy
Nazwa kodowanego białka
genu
SLR
niego kontaktu z DNA,
topoizomeraza (DNA) II alfa
a następnie jej wydalenia.
201291_s_at
TOP2A
2,05 ↑
(topoisomerase (DNA) II alpha)
Białko to pełni także funktopoizomeraza (DNA) I
208900_s_at
TOP1
1,9 ↑
cję czynnika transkrypcyj(topoisomerase (DNA) I)
nego [19].
214352_s_at
KRAS
(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)
1,89 ↑
Powszechnie znanym
BIK
205780_at
BIK
1,72 ↑
jest
fakt, że indukcja apop(BCL2-interacting killer)
tozy
jest wynikiem przebiałko związane z BCL2
211833_s_at
BAX
1,66 ↑
(BCL2-associated X protein)
kroczenia w komórce pewmitochondrialny czynnik transkrypcyjny A
nego poziomu uszkodzeń.
203176_s_at
TFAM
1,62 ↑
(transcription factor A, mitochondrial)
Gdy dochodzi do modyfibiałko 1 ulegające ekspresji w fazach G2 i S
kacji DNA, które nie mogą
204315_s_at
GTSE1
1,39 ↑
(G2 and S-phase expressed 1 protein)
być usunięte przez system
kaspaza 6
209790_s_at
CASP6
1,34 ↑
naprawy DNA, następuje
(caspase 6, apoptosis-related cysteine peptidase)
indukcja apoptozy, która
białko związane z BCL2
208478_s_at
BAX
1,31 ↑
jest wynikiem obniże(BCL2-associated X protein)
nia ekspresji genu BCL-2
205195_at
AP1S1
adaptor-related protein complex 1, sigma 1 subunit
1,19 ↑
kodującego białko antymitochondrialny czynnik transkrypcyjny A
1,17 ↑
208541_x_at
TFAM
(transcription factor A, mitochondrial)
apoptotyczne oraz stymu221479_s_at
BNIP3L
BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like 1,05 ↑
lacji ekspresji genu BAX
transporter wielolekowy SLC2
oraz białek BAK, BIK,
202499_s_at
SLC2A3
-1,01 ↓
(solute carrier family 2)
P53, przy czym w tym
204780_s_at
FAS
Fas (TNF receptor superfamily, member 6)
-1,05 ↓
samym czasie uaktywnio208161_s_at
ABCC3
ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 3
-1,08 ↓
ne zostają mechanizmy
205323_s_at
MTF1
metal-regulatory transcription factor 1
-1,22 ↓
antyapoptotyczne. Zabutransporter wielolekowy SLC7
217678_at
SLC7A11
-1,48 ↓
rzenia mechanizmów pro(solute carrier family 7)
wadzące do hamowania
206508_at
CD70
(CD70 molecule)
-1,54 ↓
procesu apoptozy są jedtransporter wielolekowy SLC7
SLC7A11
-2,28 ↓
209921_at
(solute carrier family 7)
ną z głównych przyczyn
powstawania
oporności
[9]. Wyniki wykonanych
toksykacji cisplatyny udokumentowany został już w latach
90-tych poprzedniego stulecia. Komórki narażone na dzia- przez nas pomiarów pokazują wzrost ekspresji BAX, oraz
łanie metali ciężkich natychmiast po ekspozycji rozpoczy- innych genów kodujących białka z rodziny BCL-2 takich
nają syntetyzować metalotioneiny. Wzrost ekspresji MTF1 jak BIK i BNIP3L w badanych komórkach HL-60 ekspopoprzedza syntezę metalotionein. MTF1 (metal regulatory nowanych na ciplatynę. W badaniach wykonanych przez
transcription factor 1) koduje czynnik transkrypcyjny, który Floros i wsp. [20] dotyczących apoptozy indukowanej
indukuje ekspresję genów metalotionein oraz innych genów przez cisplatynę w komórkach HL-60, stwierdzono wzrost
uczestniczących w homeostazie metali takich jak kadm, ilości komórek ulegających apoptozie korelujący z czasem
cynk, miedź i srebro. MTF1 jest transportującym białkiem ekspozycji na ten lek. W pierwszych godzinach ekspozycji
jądrowo-cytoplazmatycznym, które gromadzi się w jądrze (3 i 6 godzin) następował wzrost ekspresji BCL-2L12, a po
na skutek ekspozycji na metale ciężkie i wiąże się do promo- 12 godzinach ciągłego traktowania komórek tym lekiem
torów zawierających element odpowiedzi na metale (MRE) zaobserwowano zmniejszenie ekspresji tego genu. Obser[12,13]. W przedstawianej pracy zaobserwowano obniżony wacje te wskazują na obronną, antyapoptotyczną reakcję
poziom ekspresji MTF1 w komórkach HL-60 po ekspozy- komórek w pierwszych godzinach ekspozycji i potwierdzacji na cisplatynę. Obniżonemu poziomowi ekspresji MTF1 ją mechanizm śmierci komórek HL-60 eksponowanych na
towarzyszył wzrost ekspresji szeregu genów odpowiedzial- cisplatynę w drodze apoptozy [20]. Alternatywną drogą innych za syntezę metalotionein, jednak niewystarczający, dukowania apoptozy przez białka z rodziny BCL-2 jest ich
aby zaklasyfikować te geny jako różnicujące. Ekspozycja interakcja z czynnikiem Apaf−1 (apoptic protease activating
komórek HL-60 na cisplatynę spowodowała wzrost ekspre- factor−1) oraz z cytochromem C i kaspazą 9, co prowadzi
sji genu AP1S1 kodującego białko - podjednostkę komplek- do aktywacji innych kaspaz. Również interakcja białek BID
su sigma 1A, stanowiące część kompleksu płaszcza klatry- i BIK z białkami BCL-2 i BCL-XL prowadzi do kaskadowej
ny okrywającego pęcherzyki transportujące, np. w procesie aktywacji kaspaz i apoptozy [21]. Wzrost aktywności genu
Tab. I. Ekspresja genów różnicujących związanych z regulacją i powstawaniem oporności na lek w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę względem prób odniesienia (komórki eksponowane na DMSO), (SLR – ang. signal
log ratio – stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu
w porównywanych próbach, strzałka ↑ - nadekspresja, strzałka ↓ - spadek ekspresji genu
w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę)
&ARM0RZEGL.AUK
kaspazy 6 (CASP6) zaobserwowano w komórkach HL-60
eksponowanych na cisplatynę. Ponadto, wykazano wzrost
ekspresji genu GTSE1, który uczestniczy w syntezie G2 i S
enzymatycznego białka 1, ulegającego ekspresji w fazach
S oraz G2 cyklu komórkowego. Białko to, w odpowiedzi
na uszkodzenie DNA gromadzi się w jądrze i wiąże białko P53, powodując jego przemieszczenie z jądra i hamując
jego zdolność do indukowania apoptozy. Nagromadzenie
się białka GTSE1, głównie w pobliżu mikrotubuli, powoduje opóźnienie przejścia komórki z fazy G2 do M [22].
Przyczyną wytwarzania oporności komórek nowotworowych na lek są mechanizmy związane z naprawą polekowych
uszkodzeń DNA. Naprawa DNA prowadzi do usunięcia adduktów z cisplatyną. Spośród wielu mechanizmów naprawy
DNA tylko naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER)
odgrywa znaczącą rolę w powstawaniu oporności na cisplatynę. Chociaż w procesie tym bierze udział ponad 30 rodzajów cząsteczek, jest on limitowany przez białka ERCC1
oraz XP [9]. Rezultaty przeprowadzonych eksperymentów
pokazują wzrost ekspresji genów TOP2A (DNA topoizomeraza II alfa) i TOP1 (DNA topoizomeraza I) w komórkach
HL-60 na skutek działania cisplatyny. TOP2A koduje zlokalizowany w jądrze enzym topoizomerazę DNA, który dodając superskręty do cząsteczki DNA, kontroluje i zmienia
stany topologiczne DNA podczas transkrypcji. Zmiany aktywności tego genu pod wpływem różnych związków przeciwnowotworowych obserwowane są w komórkach wielu
nowotworów, w tym również białaczki promielocytarnej
HL-60, a jego amplifikacja bądź delecja może być czynnikiem predykcyjnym w terapii przeciwnowotworowej. TOP1
koduje białko uczestniczące w procesie transkrypcji odpowiadające za usuwanie (relaksację) superskrętów z cząsteczki DNA [23]. W opisywanym eksperymencie zaobserwowano wzrost ekspresji genu TFAM (mitochondrialny czynnik
transkrypcyjny A), który pełni, podobnie tak jak histony
w jądrowym DNA, rolę ochronną względem mtDNA. Replikacja w mitochondriach przebiega niezależnie i częściej od
podziałów komórkowych, co sprawia, że mtDNA jest dużo
bardziej narażony na czynniki uszkadzające i mutagenne,
np. reaktywne formy tlenu (RFT), niż DNA jądrowy [24].
Dotychczasowe badania na komórkach różnych linii nowotworowych w znacznym stopniu wyjaśniają molekularne mechanizmy powstawania oporności na chemioterapię i
mogą przyczynić się do opracowywania skutecznego postępowania klinicznego. Ponadto, rezultaty tych badań mogą
być wykorzystywane przez laboratoria badawcze podczas
tworzenia nowych pochodnych platyny o zwiększonej skuteczności i obniżonej toksyczności, które ponadto nie będą
wywoływały narastania oporności. W przedstawionej pracy
opisano wyniki badań wczesnych zmian w ekspresji genów
spowodowanych przez cisplatynę dodaną do hodowli komórek HL-60 w fazie eksponencjalnego wzrostu. Oczywistym
jest fakt, że efekt działania substancji wykazującej cytotoksyczność zależy zarówno od stężenia jak i czasu ekspozycji.
Gdy komórki białaczki promielocytarnej HL-60 hodowane
są w kolejnych pasażach w obecności cisplatyny w odpowiednio dobranych, często wzrastających stężeniach, dochodzi w nich do powstania utrwalonej oporności na ten lek.
Sytuacja ta w pewnym stopniu nawiązuje do powstawania
oporności u pacjentów poddawanych chemioterapii w kolej-
nych jej cyklach. Przedstawione przez nas wyniki sugerują,
że zmienione sygnały ekspresji analizowanych genów, już
po pierwszej ekspozycji komórek nowotworowych na lek,
mogą być brane pod uwagę w przewidywaniu powstawania
oporności.
Wnioski
1. Cisplatyna powoduje w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 zmiany w ekspresji genów związanych
z opornością na lek.
2. Powstawanie oporności na cisplatynę w komórkach
białaczki promielocytarnej HL-60 zależy od poziomu
ekspresji genów związanych z transportem i usuwaniem
leku oraz naprawą DNA.
3. Poznanie mechanizmów molekularmych powstawania
oporności komórek nowotworowych na cisplatynę może
być podstawą opracowywania skutecznego postępowania klinicznego.
Piśmiennictwo
1. Siddik ZH. Cisplatin: mode of cytotoxic action and
molecular basis of resistance. Oncogene 2003; 22:
7265–79.
2. Mandic A i wsp. Cisplatin induces endoplasmic reticulum stress and nucleus-independent apoptotic signaling.
J Biol Chem 2003; 278: 9100-6.
3. Chaney SG i wsp. Protein interactions with platinum–
DNA adducts: from structure to function. J Inorg Biochem 2004; 98: 1551–9.
4. Perez RP. Cellular and molecular determinants of cisplatin resistance. Eur J Cancer 1998; 34: 1535-44.
5. Holzer AK, Manorek GH, Howell SB. Contribution of
the major copper influx transporter CTR1 to the cellular
accumulation of cisplatin, carboplatin and oxaliplatin.
Molec Pharmacol 2006; 70: 1390–4.
6. Fokkema E i wsp. JM216-, JM118-, and cisplatininduced cytotoxicity in relation to platinum-DNA adduct
formation, glutathione levels and p53 status in human
tumor cell lines with different sensitivities to cisplatin.
Biochem Pharmacol 2002; 63: 1989-96.
7. Ishikawa T, Wright CD, Ishizuka H. GS-X pump is functionally overexpressed in cis-diamminedichloroplatinum
(II)-resistant human leukemia HL-60 cells and down-regulated by cell differentiation. J Biol Chem1994; 269:
29085-93.
8. Rosell R i wsp. DNA repair and cisplatin resistance
in non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2002; 38:
217-27.
9. Torigoe T. i wsp. Cisplatin resistance and transcription
factors. Curr Med Chem Anti-Cancer Agents 2005; 5:
15-27.
10. Albertella MR i wsp. A role for polymerase η in the cellular tolerance to cisplatin-induced damage. Cancer Res
2005; 65: 9799–806.
11. Gadducci A i wsp. Molecular mechanisms of apoptosis
and chemosensitivity to platinum and paclitaxel in ovarian cancer: biological data and clinical implications.
Eur J Gynaecol Oncol 2002; 23: 390–6.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
12. Borst P i wsp. A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins. J Natl Cancer Inst
2000; 92: 1295-302.
13. Choi CH i wsp. Molecular mechanisms of heptaplatin
effective against cisplatin-resistant cancer cell lines:
less involvement of metallothionein. Cancer Cell Int
2004 4: 6.
14. Muller PJ i wsp. Polymorphisms in ABCG2, ABCC3
and CNT1 genes and their possible impact on chemotherapy outcome of lung cancer patients. Int J Cancer 2009;
124: 1669–74.
15. Uldry M, Thorens B. The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters. Pflugers Arch 2004; 447:
480–9.
16. Holford J i wsp. Mechanisms of drug resistance to the
platinum complex ZD0473 in ovarian cancer cell lines.
Eur J Cancer 2000; 36: 1984–90.
17. Zhang K i wsp. Modulation of cisplatin cytotoxicity and
cisplatin-induced DNA cross-links in HepG2 cells by
regulation of glutathione related mechanisms. Mol Pharmacol 2001; 59: 837-43.
18. Wang H i wsp. Expression of the activity of cystine/glutamate exchange transporter, system x(c)(-), by xCT and
rBAT. Biochem Biophys Res Commun 2003; 305: 611-8.
19. Guay D i wsp. The strand separation and nuclease activities associated with YB-1 are dispensable for cisplatin resistance but overexpression of YB-1 in MCF7 and
MDA-MB-231 breast tumor cells generates several chemoresistance signatures. Int J Biochem Cell Biol 2008;
40: 2492-507.
20. Floros KV i wsp. Cisplatin-induced apoptosis in hl60 human promyelocytic leukemia cells differential
expression of BCL2 and novel apoptosis-related gene
BCL2L12. Ann NY Acad Sci 2003; 1010: 153–8.
21. Zou H. Apaf−1, a human protein homologous to C elegans CED−4 participates in cytochrome−C dependent
acti−vation of caspase−3. Cell 1997; 90: 405–8.
22. Monte M i wsp. The cell cycle-regulated protein human
GTSE-1 controls DNA damage-induced apoptosis by affecting p53 function. J Biol Chem 2003; 278: 30356-64.
23. Chen A i wsp. Microarray and biochemical analysis of
bufalin-induced apoptosis of HL-60 cells. Biotechnol
Lett 2009; 31: 487–94.
24. Larsen NB, Rasmussen M, Rasmussen LJ. Nuclear and
mitochondrial DNA repair: similar pathways? Mitochondrion 2005; 5: 89-108.
Adres do korespondencji:
dr hab. n. farm. Adam Wilczok
Katedra i Zakład Biofarmacji SUM
ul. Narcyzów 1
41-200 Sosnowiec
tel. +48 32 364 10 63
e-mail: [email protected]