COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus Test, version 2.0

Transkrypt

COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus Test,
version 2.0
HCV
DO BADAŃ DIAGNOSTYCZNYCH IN VITRO.
Informacje
dotyczące zamówienia
AMPLICOR® HCV
Specimen Preparation Kit,
version 2.0
HCV PREP
96 Tests
P/N: 21111086 123
ART: 11 1108 6
US: 83126
AMPLICOR® HCV
Controls Kit, version 2.0
HCV CTL
8 Sets
P/N: 21111175 123
ART: 11 1117 5
US: 83131
AMPLICOR® HCV
Amplification Kit, version 2.0
HCV AMP
96 Tests
P/N: 21111094 123
ART: 11 1109 4
US: 83127
HCV DK
100 Tests
P/N: 21111132 123
ART: 11 1113 2
US: 83130
COBAS® AMPLICOR®
Detection Reagents Kit
DK
100 Tests
P/N: 20757470 122
ART: 07 5747 0
US: 83276
COBAS® AMPLICOR®
Conjugate Detection Reagent
CN4
200 Tests
P/N: 20764213 123
ART: 07 6421 3
US: 83305
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
WB
500 Tests
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
COBAS® AMPLICOR®
HCV Detection Kit,
version 2.0
Poniższy zestaw służy wykrywaniu HCV Internal Control amplifikowanej przy
użyciu AMPLICOR® HCV Amplification Kit, version 2.0. Detekcja HCV Internal
Control jest opcją zalecaną dla użytkownika.
IC
100 Tests
P/N: 20757608 122
ART: 07 5760 8
US: 83281
P/N: 04498313 190
COBAS® AMPLICOR®
Internal Control Detection Kit
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
11/2009, Revision 10.0
COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus Test, v2.0
1/42
Przeznaczenie
COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus (HCV) Test, version 2.0 (v2.0) jest
testem jakościowym in vitro do wykrywania wirusa RNA zapalenia wątroby typu
C w próbkach klinicznych przy użyciu analizatora COBAS® AMPLICOR®
Analyzer. Obecność HCV RNA świadczy o aktualnym zakażeniu HCV u chorych
wykazujących kliniczne i/lub biochemiczne cechy choroby wątroby. Niniejszy
test do wykrywania HCV RNA w ludzkiej surowicy lub osoczu używa odwrotnej
transkrypcji badanego RNA do wytworzenia komplementarnego DNA (cDNA),
amplifikacji badanego cDNA przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR,
Polymerase Chain Reaction) oraz hybrydyzacji kwasów nukleinowych.
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 nie jest przeznaczony do badań
przesiewowych krwi ani produktów krwiopochodnych na obecność wirusa
zapalenia wątroby typu C.
Podsumowanie i objaśnienie testu
Wirus zapalenia wątroby typu C uważany jest za główny czynnik etiologiczny
odpowiedzialny za 90–95% przypadków wirusowego zapalenia wątroby nie-A
i nie-B po przetoczeniach1,2. HCV jest jednoniciowym wirusem RNA
zawierającym nić sensowną z genomem liczącym około 10 000 nukleotydów
kodujących 3000 aminokwasów1. Jako wirus występujący we krwi, HCV może
być przenoszony przez krew i produkty krwiopochodne. Zakażenie HCV
występuje z dużą częstością u chorych po przeszczepach narządowych,
przetoczeniach krwi lub dostępnych w handlu czynników krzepnięcia, jak również
u chorych nadużywających leków podawanych dożylnie i narażonych na
przezskórną drogę zakażenia, oraz u chorych dializowanych. Częstość
występowania zakażenia HCV oceniana w oparciu o badania immunoserologiczne
waha się od 0,6% w Kanadzie do 1,8% w Stanach Zjednoczonych3.
Obecność przeciwciał anty-HCV u chorych zakażonych HCV doprowadziła od
opracowania swoistych dla nich testów immunoserologicznych4,5. Wprowadzenie
tego typu testów zmniejszyło na całym świecie częstość występowania
poprzetoczeniowego zapalenia wątroby. Dodatkowe oznaczenia uzupełniające
w celu dokładniejszej oceny próbek, które wielokrotnie wykazywały pozytywny
wynik w teście przesiewowym dla przeciwciał, wykonywano przy użyciu testu
typu RIBA (recombinant immunoblot assay). W przeprowadzonych niedawno
badaniach stwierdzono, że interpretacja takiego testu uzupełniającego uzależniona jest od
stopnia zagrożenia danego chorego. Na przykład w obarczonej niskim ryzykiem
populacji dawców krwi, test HCV RNA daje dodatni wynik jedynie w 50% próbek
z dodatnim wynikiem testu RIBA6,7,8. Tak więc dodatni wynik testu RIBA nie stanowi
rzeczywistego wskaźnika aktywnej infekcji HCV RNA ponieważ chorzy po przebytym
wirusowym zapaleniu wątroby typu C mogą przez wiele lat wykazywać dodatni wynik
testu anty-HCV 5. Ponadto niejednoznaczne wyniki testu uzupełniającego obserwowano
zarówno u niedawno zakażonych osób w trakcie serokonwersji, jak i u osób przewlekle
zakażonych HCV9,10.
Badanie immunoserologiczne świadczy o aktualnej i/lub wcześniejszej
ekspozycji na zakażenie HCV, ale nie jest w stanie rozróżnić tych dwóch
przypadków. Co więcej, w przypadkach ostrego zakażenia HCV, chorzy mogą nie
wytworzyć przeciwciał skierowanych przeciwko HCV11, co uniemożliwia
rozpoznanie aktualnego zakażenia HCV przy użyciu technik
immunoserologicznych. Ewentualnie, wykrycie HCV RNA przy użyciu testów
oznaczających kwas nukleinowy może dostarczyć dowodów aktualnie
trwającego zakażenia. Używając testów oznaczających kwas nukleinowy
możliwe staje się wykrycie wiremii HCV przed serokonwersją
immunologiczną12,13. Ponieważ testy oznaczające kwas nukleinowy umożliwiają
bezpośrednie wykrycie HCV RNA, tj. niezależnie od stanu immunologicznego
chorego, tego typu test ma dużą wartość w wykrywaniu HCV RNA u chorych
z obniżoną odpornością 8.
2/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Zasady procedury
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 oparty jest na z pięciu głównych
procesach: przygotowanie próbki; odwrotna transkrypcja badanego RNA w celu
wytworzenia komplementarnego DNA (cDNA)14; amplifikacja PCR14 badanego
cDNA przy użyciu swoistych odcinków startowych (primerów)
komplementarnych dla HCV; hybrydyzacja amplifikowanych produktów
z oligonukleotydowymi sondami swoistymi dla badanego materiału; oraz
wykrywanie amplifikowanych produktów związanych z sondami przy użyciu
pomiarów kolorymetrycznych.
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 umożliwia równoczesną odwrotną
transkrypcję i amplifikację PCR badanego HCV oraz docelowego RNA z HCV
Internal Control. Odczynnik Master Mix zawiera parę primerów swoistych
zarówno dla HCV RNA jak i RNA z HCV Internal Control. Amplifikowany DNA
oznacza się przy użyciu oligonukleotydowych sond swoistych dla badanego
materiału, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu zarówno HCV
jak i HCV Internal Control.
Wewnętrzna kontrola
W procesach amplifikacji opartych na metodach enzymatycznych, takich jak
PCR, inhibitory, które mogą być obecne w próbce klinicznej, mogą zmniejszać
wydajność amplifikacji. COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 uzupełniono
o kontrolę wewnętrzną HCV Internal Control aby umożliwić identyfikację
poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać
amplifikację PCR. HCV Internal Control jest transkryptem RNA zawierającym
obszar wiązania primerów identyczny z badaną sekwencją HCV, losową
wewnętrzną sekwencję o długości i składzie zasad podobnej do badanej
sekwencji HCV, oraz unikalny obszar wiązania primerów, który odróżnia HCV
Internal Control od badanego amplikonu. Powyższe cechy wybrano, aby
zapewnić równoważną amplifikację HCV Internal Control i badanego RNA HCV.
Przygotowanie próbki
HCV RNA izoluje się z surowicy lub osocza poprzez lizę cząsteczek wirusa przy
użyciu czynnika chaotropowego, a następnie strącenie RNA alkoholem. RNA jest
ponownie zawieszany w rozcieńczalniku do próbki. RNA z HCV Internal
Control, wprowadzany do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym służy
jako kontrola ekstrakcji, amplifikacji i detekcji dla każdej indywidualnie
przygotowywanej próbki.
Odwrotna transkrypcja
i amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
Wybór docelowej sekwencji RNA dla HCV uzależniony jest od identyfikacji
regionów w obrębie genomu HCV wykazujących maksymalny konserwatyzm
spośród różnych genotypów HCV15,16,17. W związku z tym odpowiednia selekcja
primerów i sondy jest kluczowym elementem decydującym o zdolności testu do
wykrycia wszystkich genotypów (Zobacz punkt Ocena skuteczności w badania
nieklinicznych, badanie reprezentatywności genotypu HCV). Region 5' nie
ulegający translacji (UTR, 5'-untranslated region) genomu HCV zidentyfikowano
jako najbardziej konserwatywną sekwencję RNA spośród znanych genotypów
HCV18,19. Do określenia sekwencji 244 nukleotydów w obrębie wysoce
konserwatywnego obszaru 5'-UTR genomu HCV, COBAS® AMPLICOR® HCV
Test, v2.0 używa primerów KY78 i KY8013. Sekwencje sondy wychwytującej
i rimerów znajdują się w najbardziej konserwatywnych domenach w obrębie
5'-UTR18.
Odwrotna transkrypcja
Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji wykonywane są przy użyciu
termostabilnego, rekombinowanego enzymu polimerazy DNA Thermus
thermophilus (rTth pol). W obecności manganu (Mn2+) i w odpowiednich
warunkach układu buforowego, rTth pol wykazuje aktywność zarówno odwrotnej
transkryptazy, jak i polimerazy DNA14. Umożliwia to prowadzenie odwrotnej
transkrypcji i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej. Poddane obróbce
próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji
(A-tubes), gdzie zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak i amplifikacja PCR.
11/2009, Revision 10.0
3/42
Primer inicjujący transkrypcję nici sensownej, określany jako primer
antysensowny (KY78) jest biotynylowany na końcu 5'; primer inicjujący
transkrypcję nici antysensownej, określany jako primer sensowny (KY80) nie jest
biotynylowany. Mieszaninę reakcyjną podgrzewa się, aby umożliwić primerowi
antysenswnemu swoiste związanie się z docelowym RNA HCV oraz docelowym
RNA HCV Internal Control. W obecności Mn2+ i nadmiarze trójfosforanów
dezoksyrybonukleotydów (dNTP, deoxynucleoside triphosphates), włączając
trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny
i dezoksyurydyny (zamiast tymidyny), rTth pol wydłuża primer związany z nicią
RNA tworząc nić DNA (cDNA) komplementarną do badanego RNA.
Amplifikacja badanego DNA
Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji badanego HCV i RNA HCV Internal
Control, mieszania reakcyjna jest podgrzewana aby umożliwić denaturację
hybrydy RNA:cDNA i odsłonić sekwencje docelowe primerów. Po ochłodzeniu
mieszaniny i swoistym związaniu primera sensownego (KY80) z nicią cDNA,
rTth pol wydłuża primer syntetyzując drugą nić DNA. Proces ten kończy
pierwszy cykl PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA badanego regionu
HCV i RNA HCV Internal Control. Mieszanina reakcyjna podgrzewana jest po
raz kolejny w celu rozdzielenia powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia
sekwencji docelowych primerów. Po ochłodzeniu mieszaniny, primery KY78
i KY80 wiążą się z badanym DNA. W obecności Mn2+ i nadmiaru dNTPs, rTth
pol wydłuża primery związane z nićmi DNA zgodnie z badanym wzorcem
wytwarzając cząsteczkę dwuniciowego DNA długości 244 par zasad nazywaną
amplikonem. Analizator COBAS® AMPLICOR® Analyzer automatycznie
powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich
podwajając rzeczywistą ilość DNA amplikonu. Wymagana liczba cykli
w analizatorze COBAS® AMPLICOR® jest wstępnie zaprogramowana.
Amplifikacja zachodzi jedynie w obszarze genomu HCV między primerami;
całość genomu nie ulega amplifikacji.
Amplifikacja wybiórcza
Selektywną amplifikację badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej
w teście COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 uzyskuje się dzięki zastosowaniu
enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozydaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny
(dUTP). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje rozkład nici DNA zawierających
dezoksyurydynę20, nie wpływając na DNA zawierający dezoksytymidynę.
Dezoksyurydyny nie stwierdza się w występującym w naturze DNA, natomiast jest
ona zawsze obecna w amplikonie z uwagi na stosowanie trójfosforanu
dezoksyurydyny zamiast trójfosforanu tymidyny jako jednego spośród dNTPs
w odczynniku Master Mix; dlatego też jedynie amplikon zawiera dezoksyurydynę.
Dezoksyurydyna sprawia, że przed amplifikacją docelowego DNA amplikon
zanieczyszczający próbkę staje się podatny na rozkład przez enzym AmpErase.
Enzym AmpErase zawarty w odczynniku Master Mix katalizuje rozkład DNA
zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez
otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Z chwilą podgrzania w czasie
pierwszego etapu cyklu termicznego w alkalicznym pH odczynnika Master Mix,
łańcuch DNA amplikonu ulega rozerwaniu w pozycji dezoksyurydyny, przez co
uniemożliwia amplifikację DNA. Enzym AmpErase ulega inaktywacji
w temperaturach przekraczających 55°C, tj. w trakcie kolejnych etapów cyklu
termicznego, i dlatego nie niszczy badanego amplikonu. Pozostały enzym jest po
amplifikacji denaturowany przez dodanie roztworu denaturującego (Denaturation
Solution), zapobiegając degradacji docelowych amplikonów. W przypadku
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 wykazano, że enzym AmpErase
inaktywuje co najmniej 103 kopii amplikonu HCV zawierającego
dezoksyurydynę w przeliczeniu na jedną reakcję PCR.
4/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Reakcja hybrydyzacji
Po amplifikacji PCR, Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie dodaje
roztwór denaturujący (Denaturation Solution) do probówek typu A-tubes w celu
chemicznej denaturacji amplikonu HCV oraz amplikonu HCV Internal Control
i uzyskania jednoniciowego DNA. Próbki zdenaturowanego amplikonu przenosi
się następnie do kubeczków używanych do oznaczeń (D-cups). Do
poszczególnych pojemników typu D-cups dodaje się zawiesiny magnetycznych
cząsteczek pokrytych sondą oligonukleotydową swoistą dla HCV (KY150) lub
HCV Internal Control (SK535). Znakowane biotyną amplikony HCV i HCV
Internal Control ulegają hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału
sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi.
Hybrydyzacja amplikonów ze swoistą dla badanego materiału sondą zwiększa
ogólną swoistość testu.
Reakcja detekcji
Po reakcji hybrydyzacji Analizator COBAS® AMPLICOR® przemywa cząsteczki
magnetyczne w pojemnikach typu D-cup w celu usunięcia niezwiązanego
materiału, a następnie dodaje koniugat peroksydazy chrzanowej z awidyną.
Koniugat peroksydazy chrzanowej z awidyną wiąże się ze znakowanymi biotyną
amplikonami, które uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału
(HCV lub Internal Control) sondami oligonukleotydowymi związanymi
z cząsteczkami magnetycznymi. Analizator COBAS® AMPLICOR® usuwa
niezwiązany kompleks płucząc cząsteczki magnetyczne, a następnie do każdego
pojemnika typu D-cup dodaje roztwór substratów zawierający nadtlenek wodoru
oraz 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB). W obecności nadtlenku wodoru
peroksydaza chrzanowa związana z cząsteczkami katalizuje utlenianie TMB,
tworząc barwny kompleks, którego absorbancja mierzona jest przez analizator
COBAS® AMPLICOR® przy długości fali 660 nm.
Odczynniki
HCV PREP 96 testów
AMPLICOR® HCV
P/N: 21111086 123
Specimen Preparation Kit, version 2.0
ART: 11 1108 6
US: 83126
Zestaw do przygotowania próbki AMPLICOR® HCV, wersja 2.0
HCV LYS, v2.0
(Odczynnik lizujący HCV, wersja 2.0)
8 x 6,9 ml
Bufor Tris-HCl
68% tiocyjanian guanidyny
3% ditiotreitol
< 1% glikogen
68% (udział wagowy) tiocyjanian guanidyny
+
Xn
Produkt szkodliwy
HCV DIL, v2.0
(Rozcieńczalnik próbki HCV, wersja 2.0)
8 x 4,8 ml
Bufor Tris-HCl
< 0,005% Poly rA RNA (syntetyczny)
EDTA
0,05% azydek sodu
11/2009, Revision 10.0
5/42
8 x 0,1 ml
HCV IC, v2.0
(Kontrola wewnętrzna HCV, wersja 2.0)
< 0,001% niezakaźny, transkrybowany in vitro RNA
(pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje wiążące
primery HCV oraz unikalny obszar wiążący sondę
EDTA
0,05% azydek sodu
8 zestawów P/N: 21111175 123
AMPLICOR® HCV
HCV CTL
ART: 11 1117 5
Zestaw kontroli AMPLICOR® HCV, wersja 2.0
US: 83131
8 x 0,6 ml
NHP
[Osocze ujemne (ludzkie)]
Ludzkie osocze, wykazujące ujemny wynik testów
licencjonowanych przez US FDA w kierunku przeciwciał
przeciw HCV, HIV-1/2, antygenowi HIV p24 oraz HBsAg;
brak obecności HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA przy
użyciu metod PCR
0,1% Substancja konserwująca ProClin® 300
8 x 0,1 ml
HCV (–) C, v2.0
[Kontrola HCV (–), wersja 2.0]
EDTA
0,05% azydek sodu
8 x 0,1 ml
HCV (+) C, v2.0
[Kontrola HCV (+), wersja 2.0]
< 0,001% niezakaźny, transkrybowany in vitro RNA
(pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje HCV
EDTA
0,05% azydek sodu
HCV AMP
96 testów
AMPLICOR® HCV
Zestaw do amplifikacji AMPLICOR® HCV, wersja 2.0
HCV MMX, v2.0
(Główny rozcieńczalnik HCV, wersja 2.0)
P/N: 21111094 123
ART: 11 1109 4
US: 83127
8 x 0,7 ml
Bufor Bicine
16% DMSO
Glicerol
< 0,01% rTth polimeraza DNA (rTth pol, bakteryjna)
Octan potasu
< 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,005% primery KY78 i KY80 (jeden z nich biotynylowany)
< 0,01% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozydaza) (bakteryjny)
0,05% azydek sodu
6/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
HCV Mn2+, v2.0
(Roztwór manganu HCV, wersja 2.0)
8 x 0,1 ml
< 2% mangan
Kwas octowy
Barwnik amarantowy
0,05% azydek sodu
HCV DK
100 testów
COBAS® AMPLICOR®
HCV Detection Kit, version 2.0
Zestaw do detekcji COBAS® AMPLICOR®, wersja 2.0
P/N: 21111132 123
ART: 11 1113 2
US: 83130
CX PS1, v2.0
(Zawiesina sondy 1 HCV, wersja 2.0)
1 x 100 testów
Bufor MES
< 0,4% zawiesina Dynabeads® (cząsteczki paramagnetyczne)
pokrytych oligonukleotydową sondą wychwytującą, swoistą
dla HCV (KY150)
0,09% azydek sodu
CX4, v2.0
1 x 100 testów
Bufor fosforanu sodu
< 0,2% środek zwiększający rozpuszczalność
42,2% tiocyjanian sodu
42,2% (udział wagowy) tiocyjanian sodu
+
Xn
Produkt szkodliwy
DK
100 testów P/N: 20757470 122
COBAS® AMPLICOR®
ART: 07 5747 0
US: 83276
Zestaw odczynników do wykrywania COBAS® AMPLICOR®
DN4
(Roztwór denaturujący)
1 x 100 testów
1,6% wodorotlenek sodu
EDTA
Błękit tymolowy
1,6% (udział wagowy) wodorotlenek sodu
+
Xi
Produkt drażniący
CN4
(Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej)
1 x 100 testów
Bufor Tris-HCl
< 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej
Albumina surowicy wołowej (ssacza)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% fenol
1% Substancja konserwująca ProClin® 150
11/2009, Revision 10.0
7/42
5 x 75 testów
SB3
(Substrat A)
Roztwór kwasu cytrynowego
0,01% nadtlenek wodoru
5 x 5 ml
SB
(Substrat B)
0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)
40% dimetyloformamid (DMF)
T
40% (udział wagowy) dimetyloformamid (DMF)
Produkt toksyczny
R: 61-20/21-36
Może działać szkodliwie na dziecko w łonie
matki. Działa szkodliwie przez drogi
oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa
drażniąco na oczy.
S: 53-45
Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać
się z instrukcją. W przypadku awarii lub
jeżeli źle się poczujesz, niezwłocznie
zasięgnij porady lekarza - jeżeli to możliwe,
pokaż etykietę.
CN4
200 testów P/N: 20764213 123
COBAS® AMPLICOR®
ART: 07 6421 3
US: 83305
Odczynnik do wykrywania koniugatu COBAS® AMPLICOR®
2 x 100 testów
CN4
Bufor Tris-HCl
< 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej
Albumina surowicy wołowej (ssacza)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% fenol
1% Substancja konserwująca ProClin® 150
WB
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
Bufor płuczący COBAS® AMPLICOR®
500 testów P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X–koncentrat płuczący)
2 x 250 testów
< 2% bufor fosforanowy
< 9% chlorek sodu
EDTA
< 2% detergent
8/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Do badań diagnostycznych in vitro.
Niniejszy test przeznaczony jest do użycia z surowicą lub osoczem pobranym od
ludzi wyłącznie przy użyciu środków przeciwkrzepliwych EDTA lub ACD.
Wykazano, że heparyna hamuje PCR i dlatego nie może być stosowana
w niniejszej procedurze.
Nie pipetować ustami.
W obszarach, gdzie prowadzone są prace laboratoryjne nie wolno spożywać
posiłków, pić napojów ani palić papierosów. W czasie posługiwania się próbkami
i odczynnikami z zestawów należy ubrać jednorazowe rękawiczki ochronne,
fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne. Po użyciu próbek i odczynników
z zestawów należy dokładnie umyć ręce.
Pobierając próbki z butelek zawierających odczynniki należy unikać ich
zanieczyszczenia bakteriami i rybonukleazą. Zaleca się stosowanie sterylnych
pipet jednorazowych i końcówek do pipet pozbawionych RNazy.
Nie należy mieszać odczynników z różnych serii produkcyjnych lub różnych
butelek tej samej serii.
Niewykorzystane odczynniki i odpady należy usuwać zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi i lokalnymi.
Nie należy używać zestawu po upływie daty jego ważności.
Karty charakterystyki bezpieczeństwa materiału (MSDS, Material Safety Data
Sheets) dostępne są na żądanie w lokalnym przedstawicielstwie firmy Roche.
Praca w laboratorium musi zachodzić w sposób jednokierunkowy, z początkiem
w obszarze „przedamplifikacyjnym” i z jednokierunkowym ruchem w stronę
obszaru „poamplifikacyjnego” (amplifikacji/detekcji). Czynności przed procesem
amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie zaś
przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone
wyłącznie od określonej czynności przed procesem amplifikacji i nie wolno
używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym
z obszarów konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed
opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenia i materiałów użytych do
przygotowania odczynników nie wolno używać w czynnościach związanych
z przygotowaniem próbki, pipetowaniem, obróbką amplifikowanego DNA ani
innych źródeł badanego DNA. Materiały i wyposażenie związane z etapem po
amplifikacji muszą przez cały okres czasu pozostawać w obszarze
„poamplifikacyjnym”.
Próbki należy traktować jako potencjalnie zakaźne, stosując laboratoryjne
procedury bezpieczeństwa podobne do wymienionych w dokumencie Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories21 oraz dokumencie M29-A3
CLSI22. Należy dokładnie czyścić i dezynfekować wszystkie powierzchnie
robocze przy użyciu świeżo sporządzonego 0,5% roztworu podchlorynu sodu
w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
Uwaga
11/2009, Revision 10.0
Dostępne na rynku typowe płyny wybielające do zastosowania
w gospodarstwach domowych zawierają podchloryn sodu o stężeniu 5,25%.
Rozcieńczenie wybielacza przeznaczonego do gospodarstw domowych
w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
9/42
PRZESTROGA: Niniejszy zestaw zawiera składnik (NHP) otrzymany z ludzkiej
krwi. Materiał źródłowy zbadano przy użyciu testów zaaprobowanych przez US
FDA, nie stwierdzając odczynów w kierunku obecności przeciwciał przeciwko
HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 ani antygenu
powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg, Hepatitis B Surface
Antigen). Badania ujemnego osocza ludzkiego przy użyciu metod PCR nie
wykryły obecności HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA. Żadna ze znanych
metod badania nie może zaoferować całkowitej pewności, że produkty otrzymane
z ludzkiej krwi nie będą przenosić czynników zakaźnych. Dlatego też każdy
materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. NHP
należy traktować jako potencjalnie zakaźne, stosując laboratoryjne procedury
bezpieczeństwa podobne do przedstawionych w dokumencie Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories21 oraz dokumencie M29-A3
CLSI22. Należy dokładnie czyścić i dezynfekować wszystkie powierzchnie
robocze przy użyciu świeżo sporządzonego 0,5% roztworu podchlorynu sodu
w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
HCV IC, v2.0; HCV DIL, v2.0; HCV MMX, v2.0; HCV Mn2+, v2.0;
HCV (–) C, v2.0; HCV (+) C, v2.0 i CX PS1, v2.0 zawierają azydek sodu.
Azydek sodu może wchodzić w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi
wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali.
Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy
spłukać rury dużą objętością wody aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
Używając HCV LYS, v2.0; HCV MMX, v2.0; CX4, v2.0, DN4, CN4, SB3, SB
oraz substratu roboczego (mieszanina odczynnika SB3 i SB) należy założyć
okulary ochronne, fartuchy laboratoryjne i rękawiczki jednorazowe. Należy
unikać kontaktu powyższych materiałów ze skórą, oczami oraz błonami
śluzowymi. W razie kontaktu należy natychmiast przemyć narażone miejsce dużą
ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do
oparzeń. W razie rozlania powyższych odczynników, przed wytarciem plam
należy rozcieńczyć je wodą.
Należy unikać kontaktu SB i substratu roboczego ze skórą i błonami śluzowymi.
W razie kontaktu ze skórą należy natychmiast przemyć narażone miejsce dużą
ilością wody.
Dimetyloformamid zawarty w SB i substrat roboczy może wywierać szkodliwe
działanie na płód, a także opisywano działania toksyczne po przyjęciu wysokich
dawek doustnych. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania dymu i doustnego
spożycia dimetyloformamidu. W razie kontaktu ze skórą, miejsce narażone
należy dokładnie umyć mydłem i wodą oraz niezwłocznie zasięgnąć porady
lekarza.
Nie wolno dopuścić do kontaktu HCV LYS, v2.0, zawierającego tiocyjanian
guanidyny ani CX4, v2.0 zawierającego tiocyjanian sodu z roztworem podchlorynu
sodu (wybielacz). Tego typu mieszanina może powodować powstanie silnie
toksycznego gazu.
Do próbek i preparatu kontrolnego należy używać zakręcanych probówek, aby
zapobiec rozlewaniu się i potencjalnej kontaminacji między próbkami. Nie należy
stosować probówek z zatrzaskowym zamknięciem.
10/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Wymagania dotyczące przechowywania i obchodzenia się
Odczynników nie wolno zamrażać.
HCV LYS, v2.0, HCV DIL, v2.0 i HCV IC, v2.0 przechowywać w temperaturze
2–8°C. Wspomniane odczynniki przechowywane w zamkniętym opakowaniu są
trwałe do czasu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania, pozostałe
po badaniu odczynniki należy wyrzucić.
Przechowywanie HCV LYS, v2.0 w temperaturze 2–8°C prowadzi do powstania
osadu. Aby rozpuścić osad, zestaw przed użyciem należy ogrzać w temperaturze
25-37°C i dokładnie wymieszać. HCV LYS, v2.0 należy ogrzewać przez okres
maksymalnie 30 minut, a następnie dokładnie wymieszać do czasu rozpuszczenia
kryształów. Każdą butelkę HCV LYS, v2.0 należy przed użyciem ocenić na
białym tle czy nie wystąpuje żółty kolor lub cechy nieszczelności. W razie żółtego
zabarwienia zawartości butelki lub cech jej nieszczelności, nie należy używać
butelki do badań. Należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem
firmy Roche w celu wymiany zestawu. Po otwarciu opakowania, pozostałe
po badaniu odczynniki należy wyrzucić. Roboczy czynnik lizujacy
(przygotowany przez dodanie HCV IC, v2.0 do HCV LYS, v2.0) należy
przechowywać w temperaturze pokojowej i użyć w ciągu 8 godzin od chwili
przygotowania.
HCV MMX, v2.0 i HCV Mn2+, v2.0 należy przechowywać w temperaturze
2–8°C. Wspomniane odczynniki są trwałe do czasu podanej daty ważności.
Po otwarciu opakowania, pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić.
Główna mieszanina robocza (przygotowana przez dodanie HCV Mn2+, v2.0 do
HCV MMX, v2.0) należy przechowywać w temperaturze 2–8°C i użyć w ciągu
4 godzin od chwili przygotowania.
NHP, HCV (–) C, v2.0 i HCV (+) C, v2.0 należy przechowywać w temperaturze
2–8°C. Wspomniane odczynniki są trwałe do czasu podanej daty ważności.
Po otwarciu opakowania, pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić.
CX PS1, v2.0 i CX4, v2.0 należy przechowywać w temperaturze 2–8°C.
Wspomniane odczynniki są trwałe do czasu podanej daty ważności.
Po wymieszaniu CX PS1, v2.0 i CX4, v2.0, odczynnik roboczy zachowuje
trwałość przez 30 dni w temperaturze 2–8°C. Odczynnik roboczy stosować
można w ciągu maksymalnie 6 cykli pracy urządzenia (12 godzin/cykl), a między
poszczególnymi cyklami należy go przechowywać w temperaturze 2–8°C.
DN4 należy przechowywać w temperaturze 2–25°C. DN4 jest trwały do czasu
podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania, DN4 jest trwały przez 30 dni
w temperaturze 2–8°C lub do upływu daty ważności. DN4 stosować można
w ciągu maksymalnie sześciu cykli pracy urządzenia (12 godzin/cykl), a między
CN4 należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. CN4 jest trwały do czasu
podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania, CN4 jest trwały przez 30 dni
w temperaturze 2–8°C lub do upływu daty ważności. CN4 stosować można
w ciągu sześciu maksymalnie cykli pracy urządzenia (12 godzin/cykl), a między
SB3 i SB należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Wspomniane odczynniki
przechowywane w zamkniętym opakowaniu są trwałe do czasu podanej daty
ważności. Substrat roboczy musi być przygotowywany codziennie poprzez
zmieszanie SB3 z SB. W analizatorze COBAS® AMPLICOR®, substrat roboczy
jest trwały przez 16 godzin. SB3, SB ani substratu roboczego nie należy
poddawać działaniu metali, środków utleniających lub bezpośredniego światła.
11/2009, Revision 10.0
11/42
WB należy przechowywać w temperaturze 2–30°C. WB jest trwały do czasu
podanej daty ważności. WB należy ocenić przed rozcieńczeniem i w razie
konieczności ogrzać w temperaturze 30–37°C celem rozpuszczenia ewentualnego
osadu. Roboczy bufor płuczacy (1X), przygotowany przez rozcieńczenie WB
wodą destylowaną lub dejonizowaną w stosunku 1:10 należy przechowywać
w temperaturze 2–25°C w zbiorniku na bufor płuczący COBAS® AMPLICOR®.
Bufor ten jest trwały przez okres 2 tygodni od daty przygotowania.
Między cyklami pracy urządzenia, częściowo zużyte odczynniki do badania
należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Przed wprowadzeniem do
analizatora COBAS® AMPLICOR® odczynników z otwartych opakowań lub
odczynników roboczych, należy sprawdzić ich datę ważności.
Dostarczane materiały
HCV PREP
AMPLICOR® HCV
Specimen Preparation Kit, version 2.0
Zestaw do przygotowania próbki
AMPLICOR® HCV,wersja 2.0
P/N: 21111086 123
ART: 11 1108 6
US: 83126
HCV LYS, v2.0
(Odczynnik lizujacy HCV, wersja 2.0)
HCV DIL, v2.0
(Rozcieńczalnik próbki HCV, wersja 2.0)
HCV IC, v2.0
(Kontrola wewnętrzna HCV, wersja 2.0)
AMPLICOR® HCV
HCV CTL
Zestaw kontroli AMPLICOR® HCV, wersja 2.0
P/N: 21111175 123
ART: 11 1117 5
US: 83131
NHP
[Osocze ujemne (ludzkie)]
HCV (–) C, v2.0
[Kontrola HCV (–), wersja 2.0]
HCV (+) C, v2.0
[Kontrola HCV (+), wersja 2.0]
AMPLICOR® HCV
HCV AMP
Zestaw do amplifikacji AMPLICOR® HCV, wersja 2.0
P/N: 21111094 123
ART: 11 1109 4
US: 83127
HCV MMX, v2.0
(Główny rozcieńczalnik HCV, wersja 2.0)
HCV Mn2+, v2.0
(Roztwór manganu HCV, wersja 2.0)
COBAS® AMPLICOR®
HCV DK
HCV Detection Kit, version 2.0
Zestaw do detekcji COBAS® AMPLICOR® HCV, wersja 2.0
P/N: 21111132 123
ART: 11 1113 2
US: 83130
CX PS1, v2.0
CX4, v2.0
12/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
COBAS® AMPLICOR®
Zestaw odczynników do wykrywania
COBAS® AMPLICOR®
DK
P/N: 20757470 122
ART: 07 5747 0
US: 83276
DN4
(Roztwór denaturujący)
CN4
SB3
(Substrat A)
SB
(Substrat B)
COBAS® AMPLICOR®
Odczynnik do wykrywania koniugatu
COBAS® AMPLICOR®
CN4
P/N: 20764213 123
ART: 07 6421 3
US: 83305
CN4
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
Bufor płuczacy COBAS® AMPLICOR®
WB
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X – koncentrat płuczący)
Materiały wymagane, lecz niedostarczane
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania odczynników
– Pierścień (A-ring) przeznaczony do aparatu COBAS® AMPLICOR®
z wbudowanymi 12 probówkami (A-tube)
– Statyw pierścienia (A-ring) przeznaczony do aparatu COBAS® AMPLICOR®
– Plastikowy worek do wielokrotnego zamykania
– Pipeta Eppendorf Multipette® z pojemnikiem 1,25 ml Combitip® (sterylny,
indywidualnie pakowany)
– Pipetory (o pojemności 50 µl i 100 µl)* z barierą aerozolową lub końcówkami
dodatniego wypierania wolnymi od RNazy
– Rękawice jednorazowe bezpudrowe
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania próbek i kontroli
– Polipropylenowe probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml, sterylne, nie
silikonowane, stożkowe (Sarstedt 72.692.005 lub równoważne)**
– Stojaki do próbówek (Sarstedt 93.1428 lub równoważne)
– 95% etanol, o klasie czystości odczynnika do zastosowań w mikrobiologii lub
histologii (świeżo rozcieńczony do 70% przy użyciu wody destylowanej lub
dejonizowanej)
– Alkohol izopropylowy, o stopniu czystości odczynnika chemicznego
– Jałowe pipety transferowe o cienkiej końcówce, wolne od RNazy
11/2009, Revision 10.0
13/42
– Sterylne, jednorazowe, polistyrenowe pipety serologiczne (5 ml, 10 ml
i 25 ml)
– Pipetory (pojemność 20 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 600 µl i 1000 µl)*
z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnymi od
RNazy
– Mikrowirówka (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf
5415C, HERMLE Z230M lub równorzędna
– Mieszadło wibracyjne
– 60°C ± 2°C suchy blok grzejny
– Rękawice jednorazowe bezpudrowe
Po amplifikacji – obszar amplifikacji/detekcji
– Analizator COBAS® AMPLICOR® z drukarką
– Instrukcja obsługi analizatora COBAS® AMPLICOR®
• Opcjonalnie: oprogramowanie AMPLILINK obejmujące:
• Opcjonalnie: stację danych z oprogramowaniem AMPLILINK, wyposażoną
w drukarkę
• Opcjonalnie: podręcznik obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series do
użytku z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®,
analizatorem COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®
(współpracujący z programem AMPLILINK w wersji 3.2 Series) lub podręcznik
obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series do użytku z aparatem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® oraz aparatem cobas p 630
(współpracujący z programem AMPLILINK w wersji 3.3 Series).
Instrukcja użytkowania COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus Test, v2.0
Stojaki na pojemniki typu D-cup
Woda destylowana lub dejonizowana
Pipety serologiczne o pojemności 5 ml
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
Dokładność pipetorów musi wahać się w zakresie 3% podanej objętości.
Końcówki z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem wolne od RNazy
muszą być zastosowane zgodnie z przeznaczeniem, aby uniknąć skażenia
krzyżowego próbki i amplikonu.
** Do przygotowywania próbek badanych i kontrolnych konieczne jest
stosowanie zakręcanych probówek, aby zapobiec rozchlapaniu i potencjalnej
kontaminacji między próbkami badanymi i kontrolnymi. Nie należy stosować
probówek z zatrzaskowym zamknięciem.
–
–
–
–
–
*
Pobieranie próbek, transport i przechowywanie
Uwaga
Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem zdolnym do
przenoszenia czynników zakaźnych.
Pobieranie próbek
COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus Test, v2.0 stosuje się wyłącznie do
próbek surowicy lub osocza. Krew należy pobierać do probówek typu SST®
(Serum Separation Tubes) lub sterylnych probówek stosując jako koagulant
EDTA (lawendowa nakrętka) lub ACD (żółta nakrętka). Próbki, w których użyto
heparyny jako czynnika przeciwkrzepliwego, nie nadają się do niniejszego testu.
Pełną krew należy przechowywać w temperaturze 2–25°C nie dłużej niż
6 godzin.
Surowicę lub osocze należy oddzielić od krwi pełnej w ciągu 6 godzin od
pobrania, odwirowując przy 1500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Surowicę lub osocze należy przenieść do sterylnych polipropylenowych
probówek.
14/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Transport próbek
Transport pełnej krwi, surowicy lub osocza musi przebiegać zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi i lokalnymi dla transportu czynników zakaźnych23. Krew
pełną należy transportować w temperaturze 2–25°C i poddać obróbce w ciągu
6 godzin od pobrania. Surowicę lub osocze transportować można w temperaturze
2–8°C lub zamrożone w temperaturze -70°C lub poniżej i należy je poddać
obróbce w podanych poniżej granicach czasu.
Przechowywanie próbek
Próbki surowicy lub osocza przechowywać można w temperaturze 2–8°C przez
okres do 72 godzin, lub zamrożone w temperaturze -70°C i poniżej. Zaleca się
przechowywanie próbek w porcjach o objętości 250–300 µl, w sterylnych,
polipropylenowych, zakręcanych o pojemności 1,5 ml (takich jak firmy Sarstedt
72.692.105). Próbki surowicy i osocza można dwukrotnie zamrażać i rozmrażać.
Instrukcje użytkowania
Uwaga
Szczegółowe informacje na temat obsługi, drukowania wyników i interpretacji
sygnałów oraz komentarzy przedstawiono w (1) podręczniku obsługi
analizatora COBAS® AMPLICOR® lub (2) — w przypadku używania
programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series — w podręczniku obsługi programu
AMPLILINK w wersji 3.2 Series współpracującego z aparatem COBAS®
AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®, bądź — w przypadku
używania programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series — w podręczniku obsługi
programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series współpracującego z aparatem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem
COBAS® TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® oraz aparatem
cobas p 630.
Uwaga
Wszystkie odczynniki muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem. Przed
rozpoczęciem procedury oznaczenia, sprawdź wzrokowo, czy objętość
odczynników jest wystarczająca.
Uwaga
Próbki surowicy i osocza muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem.
Uwaga
Gdzie to zaznaczono, używać pipetorów z barierą aerozolową lub z końcówkami
dodatniego wypierania. Dołóż wszelkich starań, aby zapewnić selektywną
amplifikację.
Uwaga
Do przygotowywania próbek badanych i kontrolnych konieczne jest stosowanie
zakręcanych probówek, aby zapobiec rozchlapaniu i potencjalnej kontaminacji
między próbkami badanymi i kontrolnymi. Nie należy stosować probówek
z zatrzaskowym zamknięciem.
Liczba cykli
Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające dla ośmiu cykli po 12 oznaczeń
każdy, które wykonywać można oddzielnie lub równocześnie. Każdy cykl
oznaczeń musi zawierać co najmniej jedno powtórzenie AMPLICOR® HCV (–)
Control i AMPLICOR® HCV (+) Control (patrz punkt Kontrola jakości).
Odczynniki do przygotowania próbki i amplifikacji pakowane są w butelki
jednorazowe, wystarczające na przeprowadzenie 12 testów. Kontrole HCV (–)
i HCV (+) pakowane są w fiolki jednokrotnego użytku. Aby najwydajniej
wykorzystać odczynniki, próbki badane i kontrolne należy poddawać obróbce
w seriach będących wielokrotnością 12.
Przebieg pracy
11/2009, Revision 10.0
Test AMPLICOR® HCV Test, v2.0 można wykonać w ciągu jednego dnia lub
dwóch dni. Aby przeprowadzić oznaczenie w ciągu jednego dnia roboczego
należy kolejno wykonywać instrukcje w punktach Przygotowanie odczynników,
Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych oraz Odwrotna transkrypcja,
amplifikacja i detekcja. Test przeprowadzić można w ciągu 2 dni rozpoczynając
od punktu Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych w dniu 1, a następnie
15/42
Przygotowanie odczynników i Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja
w dniu 2 lub rozpoczynając od Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych,
Odwrotna transkrypcja i Amplifikacja w dniu 1, a Detekcja w dniu 2.
Aby przygotować próbkę badaną i kontrolną w dniu 1, a odwrotną transkrypcję,
amplifikacja i detekcja w dniu 2, należy wykonać punkty Przygotowanie próbek
badanych i kontrolnych (etapy 1 do 15) i przechować przygotowane próbki
badane i kontrolne w sposób przedstawiony w etapie 15. Dzień 2 należy rozpocząć
od Przygotowanie odczynników, a następnie rozmrozić przygotowane próbki badane
i kontrolne w temperaturze pokojowej, po czym wykonać punkt Przygotowanie
próbek badanych i kontrolnych, etap 16, oraz Odwrotna transkrypcja,
amplifikacja i detekcja.
Aby przygotować próbki badane i kontrolne oraz wykonać odwrotną transkrypcję
i amplifikację w dniu 1, należy wykonać wszystkie etapy Przygotowanie
odczynników i Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych. Należy
zaprogramować analizator COBAS® AMPLICOR® do pracy w trybie
równoległym, a następnie zakończyć etapy amplifikacji. Należy pozostawić
zdenaturowany amplikon przez noc w temperaturze 2–8°C i kontynuować
oznaczenie od punktu Detekcja w dniu 2.
Przygotowanie
odczynników
Wykonywane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar
przygotowania odczynników
1.
2.
3.
4.
Ustal odpowiednią liczbę pierścieni (A-ring) potrzebnych do oznaczenia
próbek pacjentów i kontrolnych. Umieść pierścienie (A-ring)
w odpowiednim statywie(ach).
Przygotuj główną mieszaninę robocza dodając 100 µl HCV Mn2+, v2.0 do
jednej fiolki z HCV MMX, v2.0. Nie musisz mierzyć objętości głównej
mieszaniny. Dodaj 100 µl HCV Mn2+, v2.0 do całej fiolki HCV MMX, v2.0.
Zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj, odwracając ją 10–15 razy. Nie
mieszaj na mieszadle wibracyjnym roztworu głównej mieszaniny roboczej.
Różowy barwnik w HCV Mn2+, v2.0 używany jest do wizualnego
potwierdzenia, że HCV Mn2+, v2.0 dodano do HCV MMX, v2.0. Usuń
pozostały HCV Mn2+, v2.0. Główna mieszanina robocza musi być
przechowywana w temperaturze 2–8°C i zużyta w ciągu 4 godzin od
przygotowania.
Dodaj 50 µl głównej mieszaniny roboczej do każdej z probówek (A-tube)
używając pipetora powtarzalnego lub pipetora wyposażonego w barierę
aerozolową lub końcówkę dodatniego wypierania. Nie należy jeszcze
zamykać probówek (A-tube).
Włóż pierścień(nie) (A-ring) zawierające główną mieszaninę roboczą do
plastikowego woreczka przeznaczonego do wielokrotnego zamykania
i zamknij go pewnie. Przenieś pierścień(nie) (A-ring) do Obszaru przed
amplifikacją – przygotowanie próbek badanych i kontrolnych. Pierścień(nie)
(A-ring) zawierające główną mieszaninę roboczą należy przechowywać
w temperaturze 2–8°C w Obszarze przed amplifikacją – przygotowanie
próbek badanych i kontrolnych, do czasu zakończenia przygotowywania
próbek badanych i kontrolnych. Główna mieszanina robocza zachowuje
stabilność przez 4 godziny w temperaturze 2–8°C w probówkach (A-tube)
umieszczonych w szczelnie zamkniętej torebce z tworzywa.
Przygotowanie próbek
badanych i kontrolnych
Wykonywane w: Obszar przed amplifikacją – obszar przygotowania próbek
badanych i kontrolnych
Uwaga
W celu amplifikacji uprzednio przygotowanych próbek badanych i kontrolnych,
należy najpierw wykonać etapy w punkcie „Przygotowanie odczynników”.
Należy rozmrozić przygotowane próbki badane i kontrolne w temperaturze
pokojowej, a następnie wykonać „Przygotowanie próbek badanych
i kontrolnych”, etap 16.
16/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Uwaga
Każdą butelkę HCV LYS, v2.0 należy przed użyciem ocenić na białym tle pod
kątem wystąpienia żółtego koloru lub cech nieszczelności. W razie żółtego
zabarwienia zawartości butelki lub cech jej nieszczelności, nie należy używać
butelki do badań. Należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem
firmy Roche w celu wymiany zestawu.
Uwaga
Przechowywanie HCV LYS, v2.0 w temperaturze 2–8°C prowadzi do powstania
osadu. Przed użyciem odczynnik należy ogrzać w temperaturze 25–37°C przez
maksymalnie 30 minut oraz dokładnie wymieszać w celu rozpuszczenia osadu.
1.
Przygotuj 70% etanol. W celu wykonania 12 testów, wymieszaj 11,0 ml 95%
etanolu i 4,0 ml dejonizowanej lub destylowanej wody.
2.
Oznacz jedną zakręcaną probówkę pojemności 1,5 ml dla jednego pacjenta
oraz dwie dodatkowe probówki jako „HCV (–) C” i „HCV (+) C”.
3.
Przygotuj roboczy odczynnik lizujący. Przed użyciem, wymieszaj na
mieszadle wibracyjnym HCV IC, v2.0 przez 5–10 sekund. Dla każdej serii
liczącej do 12 próbek badanych i kontrolnych, dodaj 100 µl HCV IC, v2.0
do jednej butelki HCV LYS, v2.0 i dobrze wymieszaj. Nie musisz mierzyć
objętości HCV LYS, v2.0.
Uwaga
HCV IC, v2.0 musi być dodany do HCV LYS, v2.0 nawet jeżeli HCV Internal
Control nie zostanie wykryty. Usuń pozostały HCV IC, v2.0. Roboczy odczynnik
lizujący jest trwały przez 8 godzin w temperaturze pokojowej.
Uwaga
W razie używania zamrożonych próbek, należy je rozmrozić w temperaturze
pokojowej i wymieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3 do 5 sekund. Aby
zebrać badaną próbką na dnie probówki, odwiruj ją krótko. Zachować
ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic przy obchodzeniu się z próbkami.
4.
Dodaj 400 µl roboczego odczynnika lizującego do każdej z oznaczonych
probówek i zamknij je.
5.
Przygotuj kontrole w następujący sposób:
– Wymieszaj na mieszadle wibracyjnym NHP, HCV (–) C, v2.0
i HCV (+) C, v2.0 co najmniej 5–10 sekund.
– Dodaj 200 µl NHP do każdej z kontrolnych probówek. Zamknij probówki
i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej 3–5 sekund.
– Dodaj 20 µl HCV (–) C, v2.0 do probówki oznaczonej „HCV (–) C”
zawierającej roboczy odczynnik lizujący i NHP. Zamknij probówki
i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej 3–5 sekund.
– Dodaj 20 µl HCV (+) C, v2.0 do probówki oznaczonej „HCV (+) C”
zawierającej roboczy odczynnik lizujący i NHP. Zamknij probówkę
i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3–5 sekund.
11/2009, Revision 10.0
6.
Dodaj 200 µl każdej badanej próbki chorego doodpowiednio oznaczonej
probówki zawierającejroboczy odczynnik lizujący. Zamknij probówki
i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3–5 sekund.
7.
Inkubuj probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi w suchym bloku
grzejnym przez 10 minut w temperaturze 60°C ± 2°C. Wymieszaj na
mieszadle wibracyjnym co najmniej 10 sekund.
8.
Otwórz probówki i do każdej z nich dodaj 600 µl 100% alkoholu
izopropylowego (o temperaturze pokojowej). Zamknij ponownie probówki
i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3–5 sekund. Inkubuj
wszystkie probówki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
9.
Na każdą probówkę nanieś znak orientacyjny, a następnie umieść probówki
w mikrowirówce tak, aby wspomniany znak skierowany był na zewnątrz,
a peletki ustawiły się zgodnie ze znakami. Odwiruj próbki badane i kontrolne
w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy maksymalnej prędkości
(12 500–16 000 x g).
17/42
10. Używając dla każdej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienką
końcówką na każdą próbkę odciągnij ostrożnie i usuń supernatant z każdej
probówki, zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić peletki (która może być nie
widoczna). Usuń tak dużo płynu, jak to jest możliwe bez uszkodzenia peletki.
Usuń powoli supernatant, pozwalając na całkowite spłynięcie płynu po ścianie
probówki. Nie należy stosować aspiracji próżniowej.
11. Do każdej probówki dodaj 1,0 ml 70% etanolu (o temperaturze pokojowej),
a następnie zamknij ją i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej
3–5 sekund.
12. Umieść probówki w mikrowirówce ze znakami orientacyjnymi
skierowanymi na zewnątrz i wiruj probówki przez 5 minut w temperaturze
pokojowej przy maksymalnej prędkości (12 500–16 000 x g).
13. Używając dla każdej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej
z cienką końcówką na każdą probówkę odciągnij ostrożnie i usuń
supernatant nie uszkadzając peletki. Na tym etapie peletka powinna być
wyraźnie widoczna. Usuń tak dużo supernatantu, jak to jest możliwe.
Uwaga
18/42
14. Zamknij ponownie probówki i odwiruj przy maksymalnej prędkości przez 3–5
sekund. Ostrożnie usuń supernatant bez uszkadzania peletki przy użyciu pipetora
o pojemności 200 µl zaopatrzonego w nową końcówkę dla każdej probówki. Na
tym etapie peletka powinna być wyraźnie widoczna. Usuń tak dużo supernatantu,
jak to jest możliwe. Pozostały etanol może hamować amplifikację.
15. Dodaj 200 µl HCV DIL, v2.0 do każdej probówki. Jak najdokładniej
rozprowadź peletkę przy użyciu pipetora o pojemności 200 µl zaopatrzonego
w końcówkę z barierą aerozolową. Zamknij ponownie probówki. Wymieszaj
na mieszadle wibracyjnym energicznie przez 10 sekund. Pozostać może
niewielka ilość nierozpuszczalnego materiału. Przygotowane próbki badane
i kontrolne należy poddać amplifikacji w ciągu 3 godzin od przygotowania
lub przechowywać zamrożone w temperaturze -70°C lub niższej przez okres
do jednego miesiąca, przy nie więcej niż dwóch cyklach
zamrażanie/rozmrażanie. Więcej niż dwa cykle zamrażanie/rozmrażanie
mogą powodować utratę sygnału HCV lub HCV Internal Control.
Jeżeli przygotowane próbki badane i kontrolne przechowywano w stanie
zamrożenia przed amplifikacją, przed przejściem do etapu 16 należy je
rozmrozić w temperaturze pokojowej, wymieszać na mieszadle wibracyjnym
przez 5 sekund.
16. Do odpowiednich probówek (A-tube) zawierających główną mieszaninę
roboczą dodaj przy użyciu mikropipetora wyposażonego w końcówki
z barierą aerozolową lub dodatniego wypierania 50 µl każdej
z przygotowanych próbek pacjenta i kontrolnych. Do każdej próbki badanej
i kontrolnej użyj nowej końcówki. Zwróć uwagę, żeby uniknąć przenoszenia
wytrąconego materiału, który mógł nie ulec rozpuszczeniu. Zamknij
probówki (A-tube).
17. Zapisz lokalizację próbek kontrolnych i badanych w pierścieniach
(A-ring). Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 45 minut od czasu dodania
przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do probówek (A-tube)
zawierających główną mieszaninę roboczą. Przenieś przygotowane próbki
badane i kontrolne w pierścieniach (A-ring) do obszaru amplifikacji/detekcji.
Pozostałą część przygotowanej próby można zamrozić w temperaturze -70°C
lub niższej przez okres do jednego miesiąca. Przygotowane próbki można
zamrażać i rozmrażać nie więcej niż dwa razy. Więcej niż dwa cykle
zamrażanie/rozmrażanie mogą powodować utratę HCV RNA.
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Odwrotna transkrypcja,
amplifikacja
i detekcja
Wykonywana w: Obszarze obróbki poamplifikacyjnej – obszarze
amplifikacji/detekcji
Należy wykonać codzienne czynności serwisowe obejmujące:
–
Przetrzyj stanowisko startowe przy użyciu wilgotnej szmatki pozbawionej
kłaczków, a następnie osusz je
–
Przetrzyj końcówkę uchwytu do pojemników D-cup przy użyciu wilgotnej
szmatki pozbawionej kłaczków, a następnie osusz ją
–
Sprawdź pojemnik buforu płuczącego i napełnij go w razie potrzeby
–
Przygotuj roboczy bufor płuczacy (1X) w sposób podany poniżej. Sprawdź
WB, a w razie potrzeby ogrzej go w temperaturze 30–37°C w celu
rozpuszczenia osadu. Dodaj 1 objętość WB do 9 objętości destylowanej lub
dejonizowanej wody. Wymieszaj dokładnie. Przez cały czas utrzymuj co
najmniej 3–4 litry buforu płuczącego (1X) w zbiorniku buforu płuczącego
systemu.
–
Opróżnij pojemnik na odpady
–
Załaduj system
–
Podczas ładowania systemu sprawdź strzykawki i przewody
–
Podczas ładowania systemu sprawdź końcówkę pipetującą
Przed każdym cyklem
– Sprawdź pojemnik na odpady i opróżnij go w razie potrzeby
–
Sprawdź pojemnik bufora płuczącego i dodaj buforu w razie potrzeby
–
Usuń zużyte stojaki do pojemników D-cup
–
Załaduj system
Ładowanie analizatora COBAS® AMPLICOR® i sprawdzenie działania
systemu
11/2009, Revision 10.0
1.
Sprawdź ilości odczynników wewnątrz analizatora COBAS® AMPLICOR®.
Przygotuj wystarczającą ilość kaset z odczynnikami do ukończenia analizy
wprowadzonych próbek.
2.
Wymieszaj dokładnie CX PS1, v2.0 na mieszadle wibracyjnym. Dodaj
2,5 ml CX PS1, v2.0 do jednej kasety zawierającej CX4, v2.0. Umieść
kasetę w stojaku dla odczynników specyficznych dla określonego testu.
Usuń zużytą fiolkę CX PS1, v2.0. Zanotuj datę przygotowania odczynnika
na kasecie CX4, v2.0.
3.
Oznaczając HCV Internal Control, dokładnie wymieszaj na mieszadle
wibracyjnym IC PS1. Dodaj 2,5 ml IC PS1 do jednej kasety z IC4. Umieść
kasetę w stojaku dla odczynników specyficznych dla określonego testu.
Usuń zużytą fiolkę IC PS1. Zanotuj datę przygotowania odczynnika na
kasecie IC4.
4.
Przygotuj substrat roboczy pipetując 5 ml SB do jednej kasety z SB3. Aby
wymieszać roztwór, kilkakrotnie nabierz i usuń płyn z pipety. Usuń pustą
fiolkę SB. Odnotuj datę przygotowania na kasecie z SB3.
5.
Umieść substrat roboczy w ogólnym stojaku dla roztworów.
6.
Umieść kasety z DN4 i CN4 w ogólnym stojaku dla roztworów. Na każdej
kasecie odnotuj datę jej otwarcia.
7.
Oznaczyć ramki na odczynniki jako zwykłe lub określone dla danego testu,
używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania
AMPLILINK.
19/42
8.
Skonfigurować ramki na odczynniki przez wprowadzenie pozycji
odczynników i numerów serii do analizatora COBAS® AMPLICOR®,
AMPLILINK.
9.
Załadować ramki na odczynniki do analizatora COBAS® AMPLICOR®,
AMPLILINK. Upewnić się, że każda kaseta z odczynnikami znajduje się
w przypisanym jej miejscu i jest mocno zamocowana w statywie.
10. Umieść stojak dla pojemników D-cup na przeznaczonej dla nich platformie.
Dla każdej reakcji detekcji wymagany jest jeden pojemnik D-cup, a dla
każdej kasety z substratem roboczym wymagane są dwa pojemniki D-cup,
aby umożliwić wyzerowanie analizatora COBAS® AMPLICOR®.
11. Umieść pierścień(nie) A-ring w segmencie(tach) termocyklera analizatora
COBAS® AMPLICOR®.
12. Załadować pierścienie A do analizatora COBAS® AMPLICOR®, używając
klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK.
13. Utworzyć listę roboczą pierścienia A.
14. Szczelnie zamknąć pokrywę segmentu(ów) termocyklera.
15. Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®.
16. Zaczekać, aż analizator COBAS® AMPLICOR® wyświetli komunikat
o omyślnym sprawdzeniu systemu w czasie uruchamiania.
Uwaga
Analizator COBAS® AMPLICOR® umożliwia wykonanie do 6 oddzielnych
oznaczeń zawartości każdej probówki A-tube. Analizator COBAS®
AMPLICOR® oblicza wymaganą ilość każdego odczynnika, a test wkładu
wykonywany na początku każdego cyklu określa, czy dostępna ilość
odczynników jest wystarczająca do żądanych oznaczeń.
17. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie wykonuje odwrotną
transkrypcję, amplifikację i detekcję. Wyniki wyrażone są w postaci wartości
absorbancji przy długości fali 660 nm oraz jako dodatni, ujemny lub
niejednoznaczny.
20/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Wyniki
Interpretacja wyników
Przy użyciu detekcji kontroli wewnętrznej
1.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, sprawdź sygnały flag
i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeżeli cykl jest
nieprawidłowy, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie próbek,
amplifikacja i detekcja).
2.
W przypadku prawidłowego cyklu, wyniki próbek interpretuje się
w następujący sposób:
HCV A660 Wynik
A660
Komunikat
aparatu
COBAS®
HCV IC A660 Wynik
A660
Komunikat
aparatu
COBAS®
Interpretacja
< 0,15
NEGATIVE
≥ 0,15
POSITIVE
Nie wykryto HCV RNA. Wynik ujemny nie
wyklucza obecności zakażenia HCV,
ponieważ wyniki uzależnione są od
właściwego pobrania próbki, braku
inhibitorów, oraz ilości RNA wystarczającej
do oznaczenia.
< 0,15
NEGATIVE
< 0,15
NEGATIVE
Próbka zawierająca substancje hamujące.
Brak możliwości wykrycia HCV RNA mimo
jego obecności. Należy poddać obróbce
kolejną porcję oryginalnej próbki i powtórzyć
test. Inhibitory są często niestabilne i próbki,
które początkowo zawierały substancję
hamującą mogą nie wykazywać jej obecności
w przypadku powtórzenia testu. Jeżeli
oryginalna próbka nie jest dostępna, należy
pobrać nową.
≥ 1,0
POSITIVE DOWOLNY DOWOLNY
Wykryto HCV RNA. W próbce wykryto
obecność HCV.
≥ 0,15, < 1,0 GZ 0.15 - 0.99 DOWOLNY DOWOLNY
Niejednoznaczny. Wyniki oznaczenia HCV
RNA są niejednoznaczne. Należy powtórzyć
całą procedurę oznaczenia w dwóch
powtórzeniach przy użyciu nowej porcji próbki
chorego. Próbki, w których wyniki testu dla
jednego lub obu powtórzeń ≥ 0,15 A660 należy
uznać za dodatnie w kierunku obecności HCV
RNA. Próbki, w których wyniki testu dla obu
powtórzeń są < 0,15 A660 przyjmuje się za
ujemne w kierunku HCV RNA, pod
warunkiem, że wyniki IC dla obu powtórzeń są
≥ 0,15 A660.
11/2009, Revision 10.0
21/42
Bez użycia detekcji kontroli wewnętrznej
1. Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, sprawdź sygnały flag
i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeżeli cykl jest
nieprawidłowy, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie próbek,
amplifikacja i detekcja).
2. W przypadku prawidłowego cyklu, wyniki próbek interpretuje się
w następujący sposób:
A660
Wynik HCV
Komunikat
aparatu COBAS®
Interpretacja
< 0,15
NEGATIVE
Nie wykryto HCV RNA. Wynik ujemny nie wyklucza
obecności zakażenia HCV, ponieważ wyniki uzależnione są od
właściwego pobrania próbki, braku inhibitorów oraz ilości RNA
wystarczającej do oznaczenia.
≥ 1,0
POSITIVE
Wykryto HCV RNA. W próbce wykryto obecność HCV.
≥ 0,15
< 1,0
GZ 0.15 - 0.99
Niejednoznaczny. Wyniki oznaczenia HCV RNA są niejednoznaczne.
Należy powtórzyć całą procedurę oznaczenia w dwóch powtórzeniach
przy użyciu nowej porcji próbki chorego. Próbki, w których wyniki testu dla
jednego lub obu powtórzeń ≥ 0,15 A660 należy uznać za dodatnie w kierunku
obecności HCV RNA. Próbki, w których wyniki testu dla obu powtórzeń są
< 0,15 A660 przyjmuje się za ujemne w kierunku HCV RNA.
Kontrola jakości
Każdy cykl oznaczeń musi zawierać co najmniej jedno powtórzenie
AMPLICOR® HCV (–) Control i AMPLICOR® HCV (+) Control. Podobnie jak
w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowi operatorzy do czasu
uzyskania przez nich wysokiej biegłości w poprawnym wykonywaniu testu
powinni rozważyć użycie dodatkowych prób kontrolnych podczas każdego
oznaczenia. Dodatkowo w czasie przygotowywania próbek, do każdej z nich
należy dodać kontroli wewnętrznej. Końcowa detekcja przy użyciu analizatora
COBAS® AMPLICOR® jest opcjonalna dla użytkownika. Brak jest wymagań
dotyczących położenia próbek kontrolnych w pierścieniu(ach) A-ring.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, sprawdź sygnały i komentarze
umieszczone na wydruku dla danego cyklu.
W zależności od zaleceń lub wymagań przepisów lokalnych, stanowych i/lub
federalnych, lub organizacji udzielających akredytacji, analizować można
dodatkowe próbki kontrolne.
Kontrola ujemna
Wynik oznaczenia dla AMPLICOR® HCV (–) Control musi wynosić poniżej
0,1 przyA660. Jeżeli absorbancja AMPLICOR® HCV (–) Control jest równa lub
wyższa niż 0,1 A660, cały cykl jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces
(przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, odwrotna transkrypcja, amplifikacja
i detekcja). Jeżeli absorbancja AMPLICOR® HCV (–) Control systematycznie
przekracza 0,1 A660, należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy
Roche celem pomocy technicznej.
Kontrola dodatnia
Wynik oznaczenia dla AMPLICOR® HCV (+) Control powinien być równy lub
wyższy niż 1,0 przy A660. Jeżeli absorbancja AMPLICOR® HCV (+) Control wynosi
poniżej 1,0 A660, cały cykl jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces
(przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, odwrotna transkrypcja, amplifikacja
i detekcja). Jeżeli absorbancja AMPLICOR® HCV (+) Control systematycznie
wynosi poniżej 1,0, należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy
Roche celem uzyskania pomocy technicznej.
22/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Środki ostrożności dotyczące procedury
Praca w laboratorium musi zachodzić w sposób jednokierunkowy, z początkiem
w obszarze „przedamplifikacyjnym” i z jednokierunkowym ruchem w stronę
obszaru „poamplifikacyjnego” (amplifikacji/detekcji). Czynności przed
procesem amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników,
a następnie przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być
przeznaczone wyłącznie od określonej czynności przed procesem amplifikacji
i nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między
obszarami. W każdym z obszarów konieczne jest używanie rękawiczek, które
należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenia i materiałów
użytych do przygotowania odczynników nie wolno używać w czynnościach
związanych z przygotowaniem próbki, pipetowaniem, obróbką amplifikowanego
DNA ani innych źródeł badanego DNA. Materiały i wyposażenie związane
z etapem po amplifikacji muszą przez cały okres czasu pozostawać w obszarze
„poamplifikacyjnym”.
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia
badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu, należy przedsięwziąć
wyjątkową ostrożność aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz
mieszanin do amplifikacji. Należy ściśle monitorować czystość wszystkich
odczynników. Należy usunąć wszystkie podejrzane odczynniki.
Ograniczenia procedury
Test ten został sprawdzony do stosowania tylko z surowicą lub osoczem ludzkim
pobranym na antykoagulant EDTA lub ACD. Badanie innych rodzajów próbek
może dawać wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
Heparyna hamuje PCR; testu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 nie
można stosować do próbek pobranych przy użyciu heparyny jako środka
przeciwkrzepliwego.
Wiarygodne wyniki uzależnione są od właściwego pobrania próbki, transportu,
przechowywania oraz procedur obróbki.
Detekcja HCV zależy od liczby cząsteczek wirusa obecnych w próbce, na którą
wpływać mogą metody pobierania próbek, czynniki związane z pacjentem
(tj. wiek, obecność objawów) i/lub faza zakażenia.
Wyniki fałszywie ujemne pojawiać się mogą na skutek hamowania polimerazy.
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 uzupełniono o kontrolę wewnętrzną
HCV Internal Control aby, umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek
zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR.
Obecność enzymu AmpErase w mieszaninie głównej HCV Master Mix zmniejsza
ryzyko skażenia amplikonu. Mimo tego skażenia kontrolą dodatnią HCV
i próbkami klinicznymi uniknąć można jedynie dzięki dobrej praktyce
laboratoryjnej i dokładnemu przestrzeganiu procedur wyszczególnionych
w Instrukcji użytkowania.
Nie oceniono dotychczas wpływu krioglobulin na COBAS® AMPLICOR® HCV
Test, v2.0. Należy ostrożnie interpretować ujemne wyniki badania w kierunku
HCV RNA z próbek, o których wiadomo, że zawierają wysoki poziom
krioglobulin.
Nie oceniono dotychczas wpływu leków stosowanych w zakażeniach
bakteryjnych i grzybiczych na COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0.
Podobnie jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, wyniki COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0 należy interpretować z uwzględnieniem wszystkich
wyników badań klinicznych i laboratoryjnych.
Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane
w technikach PCR.
Niniejszego produktu używać można wyłącznie w analizatorze COBAS®
AMPLICOR®.
11/2009, Revision 10.0
23/42
Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnego regionu genomu wirusowego,
z którym wiążą się startery i/lub sonda używane w teście COBAS® AMPLICOR®
HCV, v2.0, chociaż rzadkie, mogą spowodować niewykrycie wirusa.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą
stosowanych metod użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji
stosowanych metod w celu określenia jakościowych różnic występujących
pomiędzy nimi.
Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych
Czułość analityczna
Międzynarodowy standard WHO dla HCV RNA, Ocena 96/790, dla granicy
wykrywalności w osoczu i surowicy pobranych przy użyciu EDTA dla COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0.
Czułość COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 oceniono analizując
międzynarodowy standard WHO dla HCV RNA, NIBSC kod 96/790.
Międzynarodowy standard WHO dla HCV RNA, 96/790, otrzymano ze
wspólnego badania zorganizowanego przez National Institute for Biological
Standards and Control (NIBSC) w Wielkiej Brytanii oraz Central Laboratory of
the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service (CLB). Wspomniany
standard jest próbką genotypu 1 HCV zawierającą 105 jednostek
międzynarodowych (IU)/ml.
Rozcieńczenia międzynarodowego standardu WHO dla HCV RNA, NIBSC kod
96/790 przygotowano rozpuszczając uwodniony standard w osoczu ludzkim
wykazującym ujemny wynik testu w kierunku HCV do stężeń 100, 75, 60
i 50 IU/ml, opartych na przyjętej wartości 105 IU/ml. Testy wykonało czterech (4)
operatorów dla sześciu (6) powtórzeń stężeń 75, 60 i 50 IU/ml oraz czterech (4)
powtórzeń stężenia 100 IU/ml, zarówno w osoczu jak i w surowicy, w każdym
z pięciu (5) dni (łącznie odpowiednio 120 i 80 powtórzeń). Granicę
wykrywalności dla COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 ustalono w oparciu
o najniższe stężenie HCV, przy którym stwierdzano odsetek dodatnich oznaczeń
wynoszący 95% lub powyżej. Odsetek dodatnich oznaczeń wynoszący 95%
stwierdzono dla 50 IU/ml w przypadku osocza pobranego na EDTA oraz dla
60 IU/ml dla surowicy. 95% granica wykrywalności w oparciu o analizę Probit
wyniosła 43 IU/ml dla osocza pobranego na EDTA oraz 53 IU/ml dla surowicy.
Tabele 1 i 2 przedstawiają granicę wykrywalności odpowiednio w osoczu
pobranym na EDTA oraz w surowicy.
Tabela 1
Granica wykrywalności międzynarodowego standardu WHO
dla HCV RNA w osoczu pobranym na EDTA
HCV RNA (IU/ml)
Powtórzenia (n)
HCV RNA dodatni
(n)
HCV RNA dodatni
(%)
Granice przedziału
ufności*
100
80
80
100%
95,5 – 100%
75
120
118
98,3%
94,1 – 99,8%
60
120
119
98,3%
94,1 – 99,8%
50
119**
115
96,6%
91,6 – 99,1%
* Dokładne 95% dwumianowe granice ufności
** Dla jednego powtórzenia stwierdzono ujemny wynik testu w kierunku HCV i IC
24/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Tabela 2
Granica wykrywalności międzynarodowego standardu WHO
dla HCV RNA w surowicy
HCV RNA (IU/ml)
Powtórzenia (n)
HCV RNA dodatni HCV RNA dodatni
(n)
(%)
Granice przedziału
ufności*
100
80
79
98,8%
93,2 – 100%
75
120
117
97,5%
92,9 – 99,5%
60
120
117
97,5%
92,9 – 99,5%
50
120
112
93,3%
87,3 – 97,1%
* Dokładne 95% dwumianowe granice ufności
Ocena genotypu HCV
Względną czułość COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 dla głównych
genotypów HCV określono analizując próbki kliniczne (n = 8) uzyskane od osób
zakażonych HCV. Badane próbki zawierały zarówno częstsze (1a, 1b, 2a, 2b, 3a)
jak i rzadsze (4a, 5a, 6a) genotypy HCV oraz podtypy zidentyfikowane w Stanach
Zjednoczonych3. W oparciu o wyjściowe stężenia HCV RNA, przygotowano
końcowe rozcieńczenia każdej próbki rozcieńczając każdą z nich przy użyciu
osocza ludzkiego wykazującego ujemny wynik testu w kierunku HCV do
końcowych stężeń wynoszących około (zakres ± 2 SD) 100, 75 i 50 IU/ml. Każde
rozcieńczenie badano w 24 powtórzeniach. Wyniki COBAS® AMPLICOR® HCV
Test, v2.0 wskazują na równoważną zdolność detekcji (odsetek detekcji 100%)
HCV RNA niezależnie od genotypu, przy stężeniach docelowych bliskich granicy
wykrywalności, 100 IU/ml (zakres 2 SD = 48-208 IU/ml).
Badanie paneli serokonwersji HCV
Początkowy czas wykrycia zakażenia HCV przy użyciu COBAS® AMPLICOR®
HCV Test, v2.0 porównano z tradycyjnymi testami serologicznymi przy użyciu
dostępnych w handlu paneli serokonwersji HCV (n = 9). Każdy panel
serokonwersji HCV reprezentuje dobrze scharakteryzowaną serię próbek
pobranych na przestrzeni określonego okresu czasu od jednej osoby przed oraz po
wytworzeniu przeciwciał anty-HCV. Każdy panel próbek badano w trzykrotnych
powtórzeniach przy użyciu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0. Dodatkowo
jedną próbkę przesłano do Laboratory Corporation of America celem badania
przeciwciał przeciw HCV przy użyciu Abbott 2.0 Test i badań potwierdzających
przy użyciu testu RIBA 3.0. Pierwsza detekcja HCV RNA w panelach badanych
przy użyciu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 miała miejsce średnio
trzydzieści dwa (32) dni przed wykryciem przeciwciał przeciw HCV,
dostarczając wcześniejszego markera zakażenia HCV w porównaniu do
tradycyjnych badań serologicznych.
Specyficzność analityczna
Badanie reprezentatywności genotypu HCV
Swoistość COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 dla HCV RNA oceniano przy
użyciu próbek reprezentujących główne genotypy HCV. Badaniom poddano
panel próbek klinicznych (n = 87) składający się z 6 genotypów reprezentujących
piętnaście (15) podtypów HCV stwierdzonych w Stanach Zjednoczonych3 (1a,
1b, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 4a, 4c, 4f, 4g, 4h, 5a i 6a). Wynik COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0 na obecność HCV RNA był pozytywny we
wszystkich próbkach klinicznych (patrz Tabela 3).
11/2009, Revision 10.0
25/42
Tabela 3
Reprezentatywność genotypu HCV
Genotyp HCV
Badane próbki
(n)
HCV RNA dodatni
n (% poprawnych)
1
1a
9
9 (100)
2
1b
9
9 (100)
3
2a
12
12 (100)
4
2b
14
14 (100)
5
2c
4
9 (100)
6
2d
1
1 (100)
7
3a
17
17 (100)
8
3b
1
1 (100)
9
4a
3
3 (100)
10
4c
5
5 (100)
11
4f
1
1 (100)
12
4g
1
1 (100)
13
4h
2
2 (100)
14
5a
4
4 (100)
15
6a
4
4 (100)
RAZEM
87
87 (100%)
Badanie wirusowego zapalenia wątroby wywołanego wirusami innymi
niż HCV
Swoistość COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 dla HCV RNA oceniono
w oparciu o testy na potencjalną reaktywność krzyżową z próbkami od osób
z częstymi postaciami wirusowego zapalenia wątroby innymi niż typ C (HBV
i HAV). Badając próbki od osób z podwyższonymi poziomami HAV-IgM
(n = 10), próbkę izolatu HAV (n = 1), jak również próbki z HBsAg (n = 10)
i próbkę plazmidu z HBV DNA (n = 1) przy użyciu COBAS® AMPLICOR®
HCV Test, v2.0, stwierdzono ujemny odczyn w kierunku HCV RNA. COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0 jest swoisty dla detekcji HCV RNA i nie prowadzi
do fałszywie dodatnich wyników w przypadku częstych wirusów zapalenia
wątroby, HAV i HBV.
Zdolność wykluczania drobnoustrojów
Swoistość COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 oceniono w oparciu o testy na
potencjalną reaktywność krzyżową z drobnoustrojami patogennymi oraz
czynnikami kontaminującymi prawidłową mikroflorę naskórka, które mogą
znaleźć się w próbkach. Badano próbki (łącznie n = 29) zawierające izolaty
wirusów (n = 25) lub bakterii (n = 4). Wszystkie próbki badane przy pomocy
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 wykazały negatywny odczyn w kierunku
HCV RNA (patrz Tabela 4). Powyższe wyniki wskazują, że COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0 jest swoisty dla HCV RNA i nie wchodzi w reakcje
krzyżowe z szeregiem wirusów i bakterii, które potencjalnie znajdują się
w próbkach.
26/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Tabela 4
Swoistość analityczna: zdolność wykluczania drobnoustrojów
Izolat /opis próbki
Próbki (n)
HCV RNA
dodatni (n)
IC dodatni (n)
1
Adenowirus (typy 2, 3 i 7)
3
0
3
2
Enterowirusy (włączając wirus Echo 1
i wirus Coxackie B1)
2
0
2
12
0
12
3
Wirusy Herpes [włączając wirus Herpes
Simplex (typy 1 i 2), ludzki wirus Herpes
(typy 6 i 7), Cytomegalovirus (AD-169,
Davis i Towne, wirus Varicella Zoster]
4
HIV-1 (podtypy A-F)
6
0
6
5
HTLV (I & II)
2
0
2
6
Propionibacterium acnes
1
0
1
7
Staphylococcus (aureus & epidermis)
3
0
3
Razem
29
0
29
Zakłócenia
Substancje endogenne
Zbadano szereg próbek zawierających podwyższone poziomy substancji
endogennych (hemoglobina, albuminy, trójglicerydy, immunoglobuliny lub
bilirubina) pod kątem ich zdolności do zakłócania COBAS® AMPLICOR® HCV
Test, v2.0. Próbki zawierające podwyższony poziom (patrz zakresy, Tabela 5)
hemoglobiny (n = 12), albumin (n = 10), trójglicerydów (n = 13), bilirubiny
(n = 11) oraz immunoglobulin (n = 11) oceniano jako czyste (bez piku HCV) oraz
z pikiem HCV (HCV-spiked) w ilości zbliżonej do granicy wykrywalności
(100 IU/ml) COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0.
Tabela 5
Zakresy stężeń substancji endogennych do badania zakłóceń
Podwy szone
stę enie
Górne granice normy
(mg/dl)
Stę enie w teściewg
CLSI (mg/dl) (referencyjne)
Albumina
5000
6000
4630 – 6100
Bilirubina
0,.2
40
1,1 – 60
Hemoglobina
2,5
500
12,2 – 5000
Trójglicerydy
190
3000
364 – 3000
Immunoglobuliny
1200
6000
1860 – 8610
HCV RNA dodatni
n (% poprawnych)
Wszystkie próbki badano w trzykrotnych powtórzeniach. Do oceny próbek
z nieoczekiwanym (rozbieżnym) wynikiem testu na HCV RNA użyto
alternatywnej pary primerów do badania HCV. Wszystkie próbki po dodaniu
HCV (100 IU/ml) wykazywały dodatni odczyn w kierunku HCV RNA przy
użyciu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0, co wskazywało, że powyższe
substancje endogenne nie wpływają na zdolność testu do wykrycia HCV RNA
w ilości zbliżonej do granicy wykrywalności. Wszystkie próbki bez
zanieczyszczenia (bez pików HCV) zawierające podwyższone poziomy
substancji endogennych wykazywały negatywny wynik testu w kierunku HCV
RNA przy użyciu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0, z wyjątkiem dwóch
11/2009, Revision 10.0
27/42
próbek z wysokim poziomem bilirubiny. W próbkach zawierających
podwyższony poziom bilirubiny potwierdzono następnie dodatni wynik testu
w kierunku HCV RNA w oparciu o różnicującą metodę badania używając
naprzemiennych par primerów. Próbki zawierające podwyższone poziomy
albumin, bilirubiny, hemoglobiny, trójglicerydów i immunoglobulin nie
wywołują fałszywie dodatnich ani fałszywie ujemnych wyników testu przy
użyciu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0.
Leki egzogenne
Leki stosowane w terapii HCV, HIV, HBV i CMV badano pod kątem ich
potencjału do zakłócania COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0. Zakłócenia
badano dodając do osocza ludzkiego zawierającego HCV RNA (100 IU/ml, bliski
granicy wykrywalności) lub pozbawionego HCV RNA każdego z leków w trzech
stężeniach (patrz Tabela 6), nie dodając leku (0X Cmax), a także dodając lek
w maksymalnym stężeniu w osoczu (1X Cmax) i stężeniu trzykrotnie wyższym
niż maksymalne stężenie w osoczu (3X Cmax).
Tabela 6
Podsumowanie badań interferencji leków egzogennych
#
Nazwa handlowa
Nazwa rodzajowa
leku
leku
Producent
1X
3X
Cmax
Cmax
Jednostki
1
CRIXIVAN®
Siarczan indynawiru
2
CYTOVENE®
Gancyklowir
Merck & Co., Inc.
8,98
26,94
µg/ml
Hoffmann-La Roche
1,18
3,54
µg/ml
3
Epivir-HBV®
Lamiwudyna, 3TC
GlaxoSmithKline
1,5
4,5
µg/ml
4
FORTOVASE®
Sakwinawir
Hoffmann-La Roche
2,477
7,431
µg/ml
5
HIVID®
Zalcytabina, ddC
Hoffmann-La Roche
25,2
75,6
ng/ml
6
INFERGEN®
Interferon alfakon-1
AMGEN Inc.
0,3
0,9
ng/ml
7
INTRON® A
Interferon alfa-2b
Schering-Plough Corp.
273
819
IU/ml
8
INTRON®A/
REBETOL®
Interferon
alfa-2b/rybawiryna
Schering-Plough Corp.
3,68
11,04
µg/ml
9
NORVIR®
Rytonawir
Abbott Laboratories
11,2
33,6
µg/ml
10
Paxil®
Chlorowodorek paroksetyny
GlaxoSmithKline
61,7
185,1
ng/ml
11
PEGASYS®
Peginterferon alfa-2a
Hoffmann-La Roche
18
54
ng/ml
12
PROZAC®
Chlorowodorek fluoksetyny
Eli Lilly & Co.
302
906
ng/ml
13
RESCRIPTOR®
Metanosulfonian delawyrdyny
Agouron Pharmaceuticals Inc.
19,3
57,9
µg/ml
14
Retrovir®
Zydowudyna
GlaxoSmithKline
1,06
3,18
µg/ml
15
ROFERON®A
Interferon alfa-2a
Hoffmann-La Roche
2,58
7,74
ng/ml
16
Symmetrel®
Chlorowodorek amantadyny
Endo Pharmaceuticals Inc.
0,51
1,53
µg/ml
17
VIDEX®
Didanozyna, ddI
Bristol-Myers Squibb Co.
2,32
6,96
µg/ml
18
VIRACEPT®
Metanosulfonian nelfinawiru
4
12
µg/ml
19
VIRAMUNE®
Newirapina
Roxane Laboratories, Inc.
4,5
13,5
µg/ml
20
ZADAXIN®
Tymozyna alfa 1
SciClone
100
300
ng/ml
21
ZERIT®
Stawudyna, d4T
Bristol-Myers Squibb Co.
4,15
12,45
µg/ml
22
ZOLOFT®
Chlorowodorek sertraliny
Pfizer Inc.
190,2
570,6
ng/ml
Próbki badano w trzykrotnych powtórzeniach. Leki badane w niniejszym badaniu
nie powodowały fałszywie ujemnych ani fałszywie dodatnich wyników. Przy
każdym stężeniu leku, wszystkie próbki zawierające HCV wykazały dodatni
odczyn w kierunku HCV RNA, a wszystkie próbki pozbawione HCV
wykazywały ujemny odczyn w kierunku HCV RNA przy użyciu COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0. Leki badane w niniejszym badaniu nie wpływają
na zdolność COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 do wykrycia HCV RNA.
Dlatego też COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 stosować można do badań
próbek uzyskanych od chorych w trakcie leczenia przy użyciu szeregu środków
terapeutycznych przeciwko zakażeniu HCV i zakażeniom HCV współistniejącym
z innymi zakażeniami.
28/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Koinfekcja HCV
Badaniom poddano próbki od chorych z zakażeniem HCV, które towarzyszyło
innym zakażeniom (HAV, HBV i HIV) pod kątem możliwości zakłócania
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0. Zbadano następujące seropozytywne
próbki HCV/współistniejące zakażenie wirusowe: HBV/HCV (n = 8), HIV/HCV
(n = 10), HIV/HBV/HCV (n = 5) oraz HAV/HBV/HCV (n = 2). Każdą z próbek
analizowano w trzykrotnych powtórzeniach, a do oceny próbek z wynikami testu
HCV RNA odbiegającymi od wyników badań serologicznych używano
alternatywnej pary primerów HCV. Cztery próbki seropozytywne dla HCV
wykazały negatywny wynik testu dla HCV RNA przy użyciu COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0: jedna (1) HBV/HCV, jedna (1) HIV/HBV/HCV
oraz dwie (2) HAV/HBV/HCV. Wyniki kontroli wewnętrznej dla każdej z próbek
były dodatnie, co wskazuje brak hamowania reakcji PCR i zgodność wyników
testu ze specyfikacją. Wyniki badań dla wszystkich czterech próbek przy użyciu
każdej z trzech naprzemiennych par primerów były również ujemne, wykazując
brak obecności HCV RNA. Równoczesne zakażenie HAV, HBV, i/lub HIV
w próbkach seropozytywnych dla HCV nie wpływa na zdolność COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0 do wykrycia HCV RNA. Wyniki zawarte są
w Tabeli 7.
Tabela 7
Interferencja współzakażenia HCV
Próbka w koinfekcji
1
2
3
4
Próbki (n)
HCV RNA dodatni (n)
HBV/HCV
8
7*
8
HIV/HCV
10
10
10
HIV/HBV/HCV
5
4*
5
HAV/HBV/HCV
2
0*
2
25
21
25
Razem
IC wa ny (n)
*Cztery próbki wykazujące ujemny wynik badania w kierunku HCV RNA przy użyciu
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0, wykazywały również ujemny wynik badania
w kierunku HCV RNA przy użyciu naprzemiennych par primerów (badanie rozbieżności)
11/2009, Revision 10.0
29/42
Ocena kliniczna
Cele i metodyka
badania klinicznego
Celem oceny użyteczności klinicznej COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0
w diagnostyce aktywnego zakażenia HCV u chorych demonstrujących biochemiczne,
kliniczne i/lub histologiczne cechy schorzenia wątroby, w czterech centrach
hepatologicznych zlokalizowanych w różnych regionach geograficznych Stanów
Zjednoczonych przeprowadzono prospektywne, wieloośrodkowe badanie kliniczne.
Skuteczność testu oceniano w porównaniu o dwa badania standardowe: (1) Badania
serologiczne anty-HCV, oraz (2) skojarzenie badań serologicznych anty-HCV,
poziomów ALAT w surowicy i badania histologicznego wątroby.
Oceniano dwie populacje chorych:
1. „Grupa ogólna”. Chorzy badani pod kątem zakażenia HCV i/lub schorzenia
wątroby, którzy nie byli uprzednio leczeni z powodu zakażenia HCV i nie byli
poddani przeszczepowi wątroby.
2. „Grupa leczona uprzednio”. Chorzy uprzednio leczeni z powodu zakażenia
HCV, którzy nie byli poddani przeszczepowi wątroby. Chorych leczonych
w przeciągu 6 miesięcy od prowadzonego badania przesiewowego przy użyciu
leków przeciwwirusowych wykluczano z badania.
Lekarze oceniający chorych odnotowywali rozpoznanie kliniczne (kategorie
obejmowały przewlekłe zakażenie HCV, alkoholową chorobę wątroby, pierwotną
marskość żółciową, itp.) w oparciu o wywiad chorobowy, badanie fizykalne
i wyniki badań laboratoryjnych przed włączeniem do badania. W czasie badania
przesiewowego, w wielu przypadkach osoby prowadzące badanie miały dostęp
do wyników badań serologicznych anty-HCV, nie znały natomiast wyników
badań w kierunku HCV RNA. U wszystkich chorych oznaczano aktywność
transaminazy alaninowej (ALAT) w surowicy. Jeżeli w przeszłości wykonywano
badanie histologiczne wątroby, uzyskiwano kopie wyników tego badania.
Do oznaczenia HCV RNA przy użyciu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 oraz
przeciwciał anty-HCV przy użyciu enzymatycznych badań immunologicznych (antyHCV EIA) pobierano próbki surowicy i/lub osocza z dodatkiem EDTA. Wszystkie
próbki wykazujące wielokrotnie dodatni wynik testu anty-HCV EIA badano
dodatkowo testem typu RIBA. Badania przy użyciu testu RIBA wykonywano na
próbkach wykazujących pozytywny wynik w teście EIA. Testu RIBA nie
wykonywano w próbkach wykazujących negatywny wynik testu EIA. Wyniki testu
anty-HCV EIA oraz RIBA interpretowano zgodnie z instrukcją dołączoną przez
producenta. Wyniki oznaczeń COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0
interpretowano w oparciu o Instrukcję użytkowania.
Wyniki COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 porównywano do wyników
badań serologicznych anty-HCV EIA i testu RIBA. W podgrupie chorych, dla
których dostępne były wyniki badań histologicznych wątroby, wyniki COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0 oceniano dodatkowo w oparciu o badania
serologiczne anty-HCV, poziomy transaminazy alaninowej (ALAT) w surowicy
i wyniki badań histologicznych wątroby.
Wyniki badania klinicznego Łącznie uzyskano 1 038 próbek od 848 chorych zakwalifikowanych do badania.
Średni wiek chorych wynosił 46 lat, mężczyźni stanowili 54,5%, a 71,8%
populacji należało do rasy białej. Powodem zgłoszenia się do kliniki
hepatologicznej było wcześniejsze rozpoznanie HCV (40,2%), badania
w kierunku HCV (34,7%) oraz badania w kierunku schorzenia wątroby (25,8%).
Średnia wartość ALAT u chorych zakwalifikowanych do badania wynosiła
95,5 IU/ml (zakres 7 do 668 IU/ml), wyniki badania histologicznego dostępne
były u 51,7% chorych, a 18,2% leczono uprzednio z powodu HCV, przy czym
leczenie zakończono co najmniej 6 miesięcy przed przystąpieniem do badania.
Rozpoznania kliniczne w chwili włączenia do badania obejmowały przewlekłe
zakażenie HCV (72,9%), autoimmunologiczne zapalenie wątroby (2,2%),
30/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
alkoholową chorobę wątroby (5,5%), przewlekłe zakażenie wirusem zapalenia
wątroby typu B (4,4%), pierwotna marskość żółciowa (5,3%), a u 13,7% chorych
stwierdzano inne rozpoznanie.
Liczbę, rodzaj i warunki przechowywania próbek ocenianych w trakcie badania
i zebrano w Tabeli 8.
Tabela 8
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0: liczba, rodzaj i warunki przechowywania
próbek ocenianych w ośrodkach prowadzących badanie kliniczne
Ośrodek 1
Ośrodek 2
Ośrodek 3
Ośrodek 4
Surowica
(-20°C do -80°C)
101
321
228
158
808
Surowica
(2°C do 8°C)
35
0
35
0
70
Osocze pobrane na EDTA
(-20°C do -80°C)
0
0
35
125
160
Razem
136
321
298
283
1038
Typ próbki
Razem
Wyniki kliniczne
w porównaniu do wyników
badań serologicznych
anty-HCV
Wyniki COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 w porównaniu do badań
serologicznych anty-HCV były porównywalne dla wszystkich czterech ośrodków
prowadzących badanie. Powyższe dane zebrano dla wszystkich ośrodków łącznie
w Tabeli 9. Tabela ta zawiera wyniki dla surowicy i osocza EDTA dla ogólnej grupy
chorych oraz grupy chorych leczonych uprzednio.
Tabela 9
Wyniki COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 w surowicy i osoczu EDTA w porównaniu do badań
serologicznych anty-HCV ogólnej grupy chorych oraz grupy chorych leczonych uprzednio
Surowica
Wyniki
Odsetek wyników
Wynik PCR
Wynik PCR
Wynik PCR
Wynik PCR
Odsetek wyników
badania
zgodnych
dodatni
ujemny
ujemny
zgodnych z wynikiem EIA dodatni
serologicznego (liczba próbek) (liczba próbek)
(liczba próbek) (liczba próbek) z wynikiem EIA (%)
(%) (95% p.u.)*
(95% p.u.)*
Ogólna grupa pacjentów
EIA+/RIBA +
437
21
95,4 (93,08; 97,14)
89
5
94,7 (88,02; 98,25)
EIA+/RIBA IND
16
10
61,.5 (40,57; 79,77)
2
2
50,0 (6,76; 93,24)
EIA+/RIBA –
0
1
0,0 (0,0; 97,50)
0
0
EIA –
3¥
217
98,6 (96,07; 99,72)
1
24
96,0 (79,65; 99,90)
83,8 (67,99; 93,81)
Grupa pacjentów uprzednio leczonych
EIA+/RIBA +
EIA+/RIBA IND
148
11
93,1 (87,96; 96,50)
31
6
3
0
100,0 (29,24; 100,0)
0
0
* Granice ufności w oparciu o dokładną metodę dwumianową
¥ Jedna dodatkowa próbka w badaniu wykazywała początkowo niejednoznaczny wynik,
który okazał się być dodatni w PCR po ponownym zbadaniu w dwukrotnym powtórzeniu
(powtórzony wynik 1 = ujemny powtórzony wynik 2 = niejednoznaczny).
11/2009, Revision 10.0
31/42
Spośród chorych w obu grupach z dodatnim wynikiem badania EIA
potwierdzonym testem RIBA, w większości (84% do 95%) próbek stwierdzono
HCV RNA dla obu matryc próbek. U chorych w grupie ogólnej, HCV RNA
wykryto odpowiednio u 62% i 50% próbek surowicy i osocza EDTA, oraz
u żadnego z leczonych uprzednio chorych z niejednoznacznym wynikiem
badania serologicznego RIBA. Wszyscy chorzy z ujemnym wynikiem testu EIA
należeli do grupy ogólnej, a w większości tych próbek (odpowiednio 99% i 96%
dla surowicy i osocza EDTA) wynik badania w kierunku HCV RNA był ujemny.
Dlatego też stwierdzono dobrą korelację między COBAS® AMPLICOR® HCV
Test, v2.0 i wynikami badań serologicznych anty-HCV dla surowicy i osocza
EDTA zarówno w ogólnej grupie chorych jak i grupie chorych leczonych
uprzednio.
Wyniki kliniczne
Wyniki testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 oceniono dodatkowo anty-HCV,
w porównaniu do badań
poziomów transaminazy alaninowej (ALAT) w surowicy i badania histologicznego
serologicznych
wątroby. Dane porównujące wyniki COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 do
biochemicznych,
wyników badań serologicznych, biochemicznych i histologicznych przedstawiono
i histologicznych
w Tabeli 10.
Tabela 10
Wyniki COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0
w porównaniu do wyników badań serologicznych, biochemicznych i histologicznych
w surowicy i osoczu EDTA – grupa ogólna
Surowica
Wyniki
badania
serologicznego
Wynik PCR
Wynik PCR
dodatni (liczba ujemny (liczba
przypadków) przypadków)
Odsetek wyników
zgodnych z wynikiem
EIA (%) (95% p.u.)*
Wynik PCR
dodatni (liczba
przypadków)
Wynik PCR
ujemny (liczba
przypadków)
Odsetek wyników
zgodnych z wynikiem
EIA (%) (95% p.u.)*
Podwy szone stę enie ALA T i zapalenie wątroby stwierdzone w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
162
2
98,8 (95,67; 99,85)
21
0
100,0 (83,89;, 100,0)
EIA+/RIBA IND
4
0
100,0 (39,76; 100,0)
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
EIA+/RIBA –
0
EIA –
0
16
100,0 (79,41; 100,0)
0
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
Prawidłowe stę enie ALA T i zapalenie wątroby stwierdzone w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
57
0
100,0 (93,73; 100,0)
10
0
EIA+/RIBA IND
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
0
0
0
9
100,0 (66,37; 100,.0)
0
0
EIA –
100,0 (69,15; 100,0)
Podwy szone stę enie ALA T i brak zapalenia wątroby stwierdzonego w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
3
EIA+/RIBA IND
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
EIA –
1
1
28
75,0 (19,41; 99,37)
96,6 (82,24; 99,91)
1
0
0
100,0 (2,50; 100,0)
0
EIA+/RIBA +
1
2
33,3 (0,84; 90,57)
0
0
EIA+/RIBA IND
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
0
0
EIA –
1
32
97,0 (84,24; 99,92)
0
1
100,0 (2,50; 100,0)
32/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Wśród chorych w grupie ogólnej z podwyższonymi poziomami ALAT i cechami
zapalenia wątroby w badaniu histologicznym, u których stwierdzono pozytywne
wyniki testów anty-HCV EIA i RIBA, HCV RNA wykryto odpowiednio w 98,8%
i 100% dla surowicy i osocza EDTA. HCV RNA wykryto w 100% próbek
surowicy i osocza EDTA z pozytywnym wynikiem testu EIA oraz
niejednoznacznym wynikiem testu RIBA. U 100% chorych w tej grupie,
u których stwierdzono ujemny wynik testu EIA, w surowicy ani osoczu EDTA nie
wykryto HCV RNA. Co prawda w tej grupie chorych z ujemnym wynikiem testu
EIA stwierdzano zapalenie wątroby w badaniu histologicznym, jego cechy nie
były charakterystyczne dla HCV tylko sugerowały autoimmunologiczne
zapalenie wątroby, zmiany wywołane wirusem zapalenia wątroby typu B lub
nieswoiste zmiany zapalne wątroby.
Wśród chorych w grupie ogólnej z prawidłowymi poziomami ALAT i cechami
histologicznymi zapalenia wątroby, HCV RNA wykryto w 100% próbek
surowicy i osocza EDTA w przypadku pozytywnych wyników testu EIA
potwierdzonych testem RIBA. W 100% próbek surowicy w przypadku ujemnych
wyników testu EIA, nie stwierdzono HCV RNA. Brak było próbek osocza EDTA
od chorych z tej kategorii. HCV RNA wykryto w surowicy jednego chorego
z dodatnim wynikiem testu EIA i niejednoznacznym wynikiem testu RIBA.
Cechy histologiczne zapalenia wątroby u chorych z ujemnym wynikiem testu
EIA również sugerowały schorzenia inne niż zakażenie HCV.
Wśród chorych z podwyższonymi poziomami ALAT i brakiem cech zapalenia
wątroby w badaniu histologicznym, HCV RNA wykryto w 75% próbek surowicy
i 100% próbek osocza EDTA w przypadku dodatnich wyników testu EIA
potwierdzonych testem RIBA. Ujemny wynik testu EIA stwierdzono
u większości (29/33 lub 88%) chorych w tej kategorii, gdzie schorzenie wątroby
(tj. podwyższony ALAT) spowodowane było przez czynniki inne niż zapalenie
wątroby. W powyższych przypadkach z ujemnym wynikiem testu EIA, HCV
RNA nie wykryto w 96,6% próbek surowicy. W tej kategorii chorych brak było
próbek osocza EDTA. W tej kategorii brak było chorych z pozytywnym
wynikiem testu EIA i niejednoznacznym wynikiem testu RIBA.
Wśród chorych, u których poziom ALAT był prawidłowy, a w badaniu
histologicznym nie stwierdzono cech zapalenia wątroby, większość przypadków
wykazywała ujemny wynik testu anty-HCV EIA. W tej kategorii stwierdzono trzy
przypadki dodatnich wyników testu EIA potwierdzonych w teście RIBA. Osocze
EDTA nie było dostępne w żadnym z powyższych przypadków, a HCV RNA
wykryto w surowicy jednego (33,3%) chorego. HCV RNA nie wykryto u 97,0%
chorych w tej kategorii z ujemnym wynikiem testu EIA, dla których dostępne
były próbki surowicy. Mimo cech schorzenia wątroby stwierdzonych w badaniu
histologicznym u tych chorych, nie były one charakterystyczne dla zapalenia
wątroby. HCV RNA wykryto w jednej próbce surowicy, w której wynik testu EIA
był dodatni, a wynik testu RIBA był niejednoznaczny.
Dane porównujące wyniki COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 z wynikami
badań serologicznych, biochemicznych i histologicznych dla surowicy i osocza
EDTA w grupie uprzednio leczonych chorych zebrano w Tabeli 11.
11/2009, Revision 10.0
33/42
Tabela 11
Wyniki COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 w porównaniu z wynikami
badań serologicznych, biochemicznych i histologicznych dla surowicy i osocza
EDTA – grupa uprzednio leczonych
Surowica
Wyniki
Odsetek wyników
Wynik PCR
Wynik PCR
badania
serologicznego dodatni (liczba ujemny (liczba zgodnych z wynikiem
EIA (%) (95% p.u.)*
przypadków) przypadków)
Wynik PCR
dodatni (liczba
przypadków)
Wynik PCR
ujemny (liczba
przypadków)
Odsetek wyników
zgodnych z wynikiem
EIA (%) (95% p.u.)*
EIA+/RIBA +
82
2
97,6 (91,66; 99,71)
16
1
EIA+/RIBA IND
3
0
100,0 (2,50; 100,0)
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
EIA –
0
0
0
94,1 (71,31; 99,85)
Prawidłowe stę enie ALA T i zapalenie wątroby stwierdzone w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
22
4
EIA+/RIBA IND
0
0
84,6 (65,13; 95,64)
3
2
0
0
0
EIA+/RIBA
0
0
0
0
0
EIA –
0
0
0
0
0
60,0 (14,66; 94,73)
Podwy szone stę enie ALA T i brak zapalenia wątroby stwierdzonego w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
2
1
EIA+/RIBA IND
0
0
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
0
0
0
0
EIA –
66,7 (9.43, 99,16)
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
EIA+/RIBA +
2
0
EIA+/RIBA IND
0
0
100,.0 (15,81;, 100,.0)
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
EIA–
0
0
1
0
100,.0 (2,50; 100,0)
0
0
0
0
U żadnego chorego w grupie uprzednio leczonej nie stwierdzono ujemnego
wyniku testu EIA; wszystkie próbki od chorych w tej kategorii wykazywały
dodatni wynik testu anty-HCV EIA.
Wśród leczonych uprzednio chorych z podwyższonymi poziomami ALAT
i cechami histologicznymi zapalenia wątroby, HCV RNA wykryto odpowiednio
w 97,6% i 94,1% próbek surowicy i osocza EDTA w przypadku dodatnich
wyników testu EIA potwierdzonych testem RIBA. HCV RNA wykryto we
wszystkich trzech (100%) surowicach wykazujących pozytywny wynik testu
EIA, u których wynik testu RIBA był niejednoznaczny.
Wśród leczonych uprzednio chorych z prawidłowymi poziomami ALAT
i cechami histologicznymi zapalenia wątroby, HCV RNA wykryto odpowiednio
w 84,6% i 60% próbek surowicy i osocza EDTA w przypadku dodatnich
wyników testu EIA potwierdzonych testem RIBA. HCV RNA wykryto
odpowiednio w 66,7% i 100% próbek surowicy i osocza EDTA w przypadku
dodatnich wyników testu EIA potwierdzonych testem RIBA u chorych
z podwyższonym poziomem ALAT i brakiem cech histologicznych zapalenia
wątroby.
HCV RNA wykryto w 100% próbek surowicy i osocza EDTA z dodatnim
wynikiem testu EIA potwierdzonym testem RIBA u chorych z prawidłowymi
poziomami ALAT i brakiem cech histologicznych zapalenia wątroby.
34/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Podsumowanie i wnioski
Ocena COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 uwidoczniła, że test ten
charakteryzuje się wysokiego stopnia korelacją przy porównywaniu z wynikami badań
serologicznych anty-HCV w ogólnej grupie chorych i grupie chorych uprzednio
leczonych zarówno w surowicy, jak i osoczu EDTA.
Stwierdzono również wysokiego stopnia zgodność COBAS® AMPLICOR® HCV
Test, v2.0 porównanego z wynikami badań serologicznych, biochemicznych
i histologicznych w ogólnej grupie chorych i grupie chorych uprzednio leczonych
zarówno w surowicy, jak i osoczu EDTA.
Ogólne wyniki badania wskazują, że COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0,
posiada kliniczną wartość diagnostyczną u chorych badanych w kierunku
zakażenia HCV i/lub schorzenia wątroby. Badania te są użyteczne, aby
potwierdzić rozpoznanie czynnego zakażenia HCV.
Powtarzalność
W celu oceny powtarzalności wyników COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0,
zbadano dwa panele próbek, każdy liczący sześć próbek, z czego jedną
przygotowano w zamrożonej surowicy, a pozostałe w zamrożonym osoczu
EDTA. Przygotowano cztery próbki zawierające HCV w postaci rozcieńczeń
z trzech próbek klinicznych genotypu 1 HCV, aby otrzymać docelowe stężenia
HCV RNA wynoszące 50, 75, 100 i 200 IU/ml. Pozostałe dwie próbki nie
zawierały wykrywalnych ilości HCV RNA. Powtarzalność oceniano między
ośrodkami prowadzącymi badanie, dniami oznaczeń i seriami odczynników.
Każdą macierz badało dwóch operatorów w każdym z trzech ośrodków (dwa
referencyjne laboratoria kliniczne oraz laboratorium Roche Molecular Systems).
Każdy operator wykonywał badania przez okres 5 dni przy użyciu każdej z trzech
serii odczynników. Podczas każdego cyklu pracy urządzenia zbadano trzy
objętości każdej z prób w celu oceny wyników w ciągu bieżącego dnia.
3209 wyników z omawianego badania zebrano w Tabeli 12 dla próbek surowicy
i w Tabeli 13 dla próbek osocza EDTA. Ujemne wyniki uzyskano w 100%
spośród > 500 próbek pozbawionych HCV RNA dla każdej matrycy, wyników
ogólnych i każdej ze zmiennych w ciągu danego dnia (Tabele 12.A, 12.C, 13.A
i 13.C). Badanie wykazało całkowitą powtarzalność wyników jakościowych dla
próbek pozbawionych HCV RNA.
Powtarzalność dla próbek zawierających HCV RNA również także porównując
częstość występowania wyników dodatnich dla zmiennych w ciągu danego dnia
(Tabele 12.B i 13.B). Dla każdego stężenia HCV RNA, wszystkie przedziały
ufności nakładały się dla każdej zmiennej ocenianej w ciągu danego dnia (patrz
druga stopka w Tabeli 12 i Tabeli 13). Dlatego też obserwowane różnice między
częstością występowania wyników dodatnich w obrębie zmiennej dla określonego
stężenia HCV RNA są prawdopodobnie losowe. Powyższe wyniki wskazują na
powtarzalność dla próbek zawierających HCV RNA.
Warto zwrócić uwagą na kilka trendów. Dla próbek surowicy zawierających
najwyższe stężenie (200 IU/ml) HCV RNA, przedziały częstości występowania
wyników dodatnich wynosiły 99–100% dla porównań między ośrodkami
i seriami odczynników, oraz 98-100% dla porównań między poszczególnymi
dniami; stanowią one najwęższe przedziały częstości występowania wyników
dodatnich (najwyższa powtarzalność) spośród próbek surowicy. Dla próbek
surowicy o stężeniu 50 IU/ml, przedziały częstości występowania wyników
dodatnich wynosiły 85–89% dla porównań między ośrodkami, 78–91% dla
porównań między seriami odczynników, oraz 80–93% dla porównań między
poszczególnymi dniami. Dwa ostatnie przedziały reprezentują najszersze
przedziały częstości występowania wyników dodatnich (najniższa
powtarzalność) spośród wszystkich próbek i otrzymano je dla najniższego
stężenia HCV RNA. Podobnie różniła się powtarzalność wśród próbek osocza
EDTA odnośnie do stężenia HCV RNA.
11/2009, Revision 10.0
35/42
Dla każdego stężenia HCV RNA w surowicy, przedziały częstości występowania
wyników dodatnich dla porównań między ośrodkami były węższe (sugerujące
wyższą powtarzalność) niż te dla porównań między seriami odczynników lub
między poszczególnymi dniami.
Powyższe dane wskazują na powtarzalność wyników oznaczeń COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0 odnośnie do różnych serii odczynników, ośrodków
prowadzących badanie, dni badania oraz matryc próbek.
Uwagi dotyczące wyników
niejednoznacznych (GZ)
Próbek z badania powtarzalności, które dały wynik niejednoznaczny (GZ) nie
badano ponownie (patrz punkt Interpretacja wyników), dlatego nie uzyskano dla nich
ostatecznego wyniku. Gdyby wykonano powtórne oznaczenia, zasadne jest założenie,
że wzrosłyby częstości występowania wyników dodatnich. W przypadku, kiedy na
przykład wykluczono wyniki niejednoznaczne, próg 95% wyników dodatnich
osiągnięto przy stężeniu 50 IU/ml, lub 1,8 log10 IU/ml, dla surowicy i osocza EDTA.
Powyższe wyniki są zbliżone do uzyskanych po wykonaniu obliczeń w oparciu o
dane z badania LOD przy użyciu standardu WHO (patrz punkt Czułość
analityczna).
COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0 zazwyczaj dawał ≥ 95% wyników
dodatnich dla niższych stężeń badanego genotypu 1 HCV w osoczu EDTA niż
w surowicy (Tabele 1, 2, 12 i 13). Jednakże różnice między matrycami były małe
(= 0,3 log10 IU/ml) i wpływ na wskazania do stosowania (patrz punkty
Przeznaczenie i Ocena kliniczna) był mało prawdopodobny.
Tabela 12
Powtarzalność: Próbki surowicy
A. Ogólne częstości wyników
Wyniki testu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0
HCV RNA
Liczba
zbadanych*
IU/ml
(log10 IU)/ml
200
100
75
50
2,3
2,0
1,9
1,7
267
268
266
269
Obszar niejednoznaczny
(0,15 ≤ A660 < 1,0)
Obszar dodatni
(A660 ≥ 1,0)
Liczba
%
Liczba
%*
p.u. **
1
7
12
32
0,4%
3%
5%
12%
266
257
249
233
99,6%
96%
94%
87%
98 - 100%
93 - 98%
90 - 96%
82 - 91%
Obszar ujemny
(A660 < 0,15)
0
36/42
–
531
0
531
100%
99 - 100%
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
B. Zmienne w obrębie badania: częstość występowania wyników dodatnich (A660 = 1,0)*
dla próbek zawierających HCV RNA
HCV RNA/ml
Między ośrodkami
Między seriami odczynników
Między dniami
IU
log10 IU
Ośrodek
Liczba/
Liczba badanych
%
Seria
Liczba/
Liczba badanych
%
Dzień
Liczba/
Liczba badanych
%
200
2,3
A
B
C
86/87
90/90
90/90
99%
100%
100%
1
2
3
90/90
87/88
89/89
100%
99%
100%
1
2
3
4
5
54/54
54/54
53/53
55/55
50/51
100%
100%
100%
100%
98%
100
2,0
A
B
C
83/88
88/90
86/90
94%
98%
96%
1
2
3
84/89
88/90
85/89
94%
98%
96%
1
2
3
4
5
50/53
51/54
52/54
55/57
49/50
94%
94%
96%
97%
98%
75
1,9
A
B
C
82/86
83/90
84/90
95%
92%
93%
1
2
3
80/88
83/90
86/88
91%
92%
98%
1
2
3
4
5
49/53
53/54
48/52
51/56
48/51
93%
98%
92%
91%
94%
50
1,7
A
B
C
76/89
80/90
77/90
85%
89%
86%
1
2
3
70/90
82/90
81/89
78%**
91%**
91%
1
2
3
4
5
50/54
46/54
48/54
49/57
40/50
93%
85%
89%
86%
80%
C. Zmienne w obrębie badania: częstości występowania wyników ujemnych
(A660 < 0,15) dla próbek bez HCV RNA
Między ośrodkami
Między dniami
Ośrodek
Liczba/
Liczba badanych
%
Seria
Liczba/
Liczba badanych
%
Dzień
Liczba/
Liczba badanych
%
A
B
C
172/172
179/179
180/180
100%
100%
100%
1
2
3
176/176
180/180
175/175
100%
100%
100%
1
2
3
4
5
106/106
107/107
106/106
114/114
98/98
100%
100%
100%
100%
100%
Brak HCV RNA
* Wyniki niejednoznaczne włączono do mianownika (liczba badanych) wykonywanych obliczeń, ale wyłączono wyniki potencjalnie
zahamowane.
** Dokładny 95% dwumianowy przedział ufności obliczony w B. jedynie dla dwóch najbardziej różniących się częstości występowania dla
danej zmiennej (50 IU/ml, między seriami odczynników): seria 1 CI = 68-86%, a seria 2 CI = 83-96%; wszystkie analogiczne przedziały
ufności również się nakładają.
Tabela 13
Powtarzalność: próbki osocza EDTA
A. Ogólne częstości występowania wyników
HCV RNA
Liczba
zbadano*
IU/ml
(log10 IU)/ml
200
100
75
50
2,3
2,0
1,9
1,7
268
269
270
269
Wyniki testu COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0
Obszar pozytywny
(0,15 ≤ A660 < 1,0)
(A660 ≥ 1,0)
Liczba
%
Liczba
%*
p.u. **
1
6
6
20
0,4%
2%
2%
7,4%
266
262
262
240
99,3%
97%
97%
89%
97 - 100%
95 - 99%
94 - 99%
85 - 93%
Obszar ujemny
(A660 < 0,15)
0
–
11/2009, Revision 10.0
532
0
532
100%
99 - 100%
37/42
B. Zmienne w obrębie badania: częstości występowania wyników dodatnich (A660 = 1,0)* dla
próbek zawierających HCV RNA
HCV RNA/ml
Między ośrodkami
Między dniami
IU
log10 IU
Ośrodek
Liczba/
Liczba badanych
%
Seria
Liczba/
Liczba badanych
%
Dzień
Liczba/
Liczba badanych
%
200
2.3
A
C
D
88/89
89/90
89/89
99%
99%
100%
1
2
3
87/89
90/90
89/89
98%
100%
100%
1
2
3
4
5
53/53
54/54
53/54
55/56
51/51
100%
100%
98%
98%
100%
100
2,0
A
C
D
84/89
89/90
89/90
94%
99%
99%
1
2
3
88/89
88/90
86/90
99%
98%
96%
1
2
3
4
5
53/53
53/54
52/54
54/57
50/51
100%
98%
96%
95%
98%
75
1,9
A
C
D
88/90
88/90
86/90
98%
98%
96%
1
2
3
86/90
87/90
89/90
96%
97%
99%
1
2
3
4
5
51/54
52/54
54/54
55/57
50/51
94%
96%
100%
97%
98%
50
1,7
A
C
D
80/89
83/90
77/90
90%
92%
86%
1
2
3
79/90
81/89
80/90
88%
91%
89%
1
2
3
4
5
45/53
52/54
50/54
49/57
44/51
85%**
96%**
93%
86%
86%
C. Zmienne w obrębie badania: częstości występowania wyników ujemnych
(A660 < 0,15) dla próbek bez HCV RNA
Między ośrodkami
Liczba HCV RNA
Między dniami
Ośrodek
Liczba/
Liczba badanych
%
Seria
Liczba/
Liczba badanych
%
Dzień
Liczba/
Liczba badanych
%
A
C
D
172/172
180/180
180/180
100%
100%
100%
1
2
3
178/178
175/175
179/179
100%
100%
100%
1
2
3
4
5
107/107
105/105
107/107
113/113
100/100
100%
100%
100%
100%
100%
* Wyniki niejednoznaczne włączono do mianownika (liczba badanych) wykonywanych obliczeń, ale wyłączono wyniki
potencjalnie zahamowane.
** Dokładny 95% dwumianowy przedział ufności obliczony w B. jedynie dla dwóch najbardziej różniących się częstości
występowania dla danej zmiennej (50 IU/ml, porównania między poszczególnymi dniami): dzień 1 CI = 72-93% oraz
dzień 2 CI = 87-100%; wszystkie analogiczne przedziały ufności również się nakładają.
38/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Piśmiennictwo
1.
Choo, Q-L., Weiner, A.J., Overby, L.R. et al. 1990. Hepatitis C Virus:
The major causative agent of viral non-a, non-b hepatitis. British Medical
Bulletin 46:423-441.
2.
Alter, H. 1991. Descartes before the horse: I clone, therefore I am:
The hepatitis C virus in current perspective. Annals of Internal Medicine
115:644-649.
3.
Alter, M.J., D. Kruszon-Moran, O.V. Nainan, G.M. McQuillan, F. Gao,
L.A. Moyer, R.A. Kaslow and H.S. Margolis. The prevalence of hepatitis C
virus infection in the United States, 1988 through 1994. N Engl J Med 1999;
341(8):556-562.
4.
Gretch, D.R. 1996. Diagnostic tests for hepatitis C. Hepatology 26
(suppl. 1): 43S-47S.
5.
Schiff, E.R., M. de Medina and R.S. Kahn. 1999. New Perspectives in the
Diagnosis of Hepatitis C. Seminars In Liver Disease 19 (suppl.1): 3-15.
6.
Lok, A.S. and N.T. Gunaratnam. 1997. Diagnosis of hepatitis C. Hepatology
26 (suppl.1): 48S-56S.
7.
Damen, M., H.L. Zaaijer, H.T. Cuypers, H. Vrielink, C.L. van der Poel,
H.W. Reesink and P.N. Lelie. 1995. Reliability of the third-generation
recombinant immunoblot assay for hepatitis C virus. Transfusion 35:
745-749.
8.
NIH. 1997. Management of Hepatitis C. National Institutes of Health
Consensus Development Conference Statement #105.
9.
1998. Recommendations for Prevention and Control of Hepatitis C Virus (HCV)
Infection and HCV-Related Chronic Disease. MMWR, Vol. 47, No. RR-19.
10. Pawlotsky, J-M, A. Bastie, C. Pellet, J. Remire, F. Darthuy, L. Wolfe,
C. Sayada, J. Duval and D. Dhumeaux. 1996. Significance of Indeterminate
Third-Generation Hepatitis C Virus Recombinant Immunoblot Assay. Journal
of Clinical Microbiology. 34: 80-83.
11. Lu, R.H., S.J. Hwang, C.Y. Chan, F.Y. Chang and S.D. Lee. 1998.
Quantitative measurement of serum HCV RNA in patients with chronic
hepatitis C: comparison between AMPLICOR® HCV monitor system and
branched DNA signal amplification assay. Journal of Clinical Laboratory
Analysis 12: 121-125.
12. Gretch, D., D. de la Rosa, L. Corey and R. Carithers. 1996. Assessment of
hepatitis C viremia using molecular amplification technologies. Viral
Hepatitis Reviews 2: 85-96.
13. Young, K.Y., Resnick, R. and Myers, T.W. 1993. Detection of hepatitis C
virus RNA by a combined reverse transcriptase-polymerase chain reaction
assay. Journal of Clinical Microbiology 31:882-886.
14. Myers, T.W. and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA
amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry
30:7661-7666.
11/2009, Revision 10.0
39/42
15. Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A. et al. 1993. Typing hepatitis C virus
isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay.
Journal of General Virology 74:1093-1102.
16. Machida, A., Ohnuma, H., Tsuda, F. et al. 1992. Two distinct subtypes of
hepatitis C virus defined by antibodies directed to the putative core protein.
Hepatology 16:886-891.
17. Bukh, J. R. Purcell and R. Miller. 1992. Importance of primer selection for
the detection of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reaction
assay. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89: 187-191.
18. Bukh, J., Purcell, R.H. and Miller, R.H. 1992. Sequence analysis of the 5'
noncoding region of hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy
of Sciences, USA 89:4942-4946.
19. Okamoto, H., Okada, S., Sugiyama, Y. et al. 1990. The 5'-terminal sequence
of hepatitis C virus genome. Japanese Journal of Experimental Medicine
60:167-177.
20. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain
reactions. Gene 93:125-128.
21. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
22. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory
Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third
Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.
23. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st
Edition. 2000. 704 pp.
40/42
11/2009, Revision 10.0
Hepatitis C Virus
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 10.0
11/2009
Poniżej znajduje się podsumowanie zmian dokonanych w obecnej wersji ulotki dołączonej do
opakowania:
• Poprawiono błąd typograficzny. W całym tekście ulotki informacyjnej dołączonej do opakowania
symbol oznaczający „większy lub równy” (≥) zastąpił znak „³”, a symbol oznaczający „mniejszy
lub równy” (≤) zastąpił znak „£”.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z lokalnym przedstawicielem firmy Roche.
"
Distributed by
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Członek Grupy Roche
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
ROCHE, AMPERASE, AMPLICOR, AMPLILINK, AMPLIPREP, COBAS,
CYTOVENE, FORTOVASE, HIVID, PEGASYS, ROFERON i TAQMAN są
znakami towarowymi firmy Roche.
CRIXIVAN® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Merck & Co., Inc.
Dynabeads® cząsteczki paramagnetyczne są licencjonowane w oparciu o patent,
którego właścicielem jest Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia. Dynabeads®
jest zastrzeżonym znakiem towarowym Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia,
licencjonowanym dla Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana.
Epivir-HBV®, Paxil® i Retrovir® są zastrzeżonymi znakami towarowymi
GlaxoSmithKline.
Eppendorf Multipette® i Eppendorf Combitip® są zastrzeżonymi znakami
towarowymi Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Niemcy.
INFERGEN® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Amgen, Inc.
11/2009, Revision 10.0
41/42
INTRON®A i INTRON®A/REBETOL® są zastrzeżonymi znakami towarowymi
Schering-Plough Corporation.
NORVIR® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Abbott Laboratories.
ProClin® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Rohm and Haas Company.
PROZAC® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Eli Lilly and Company.
RESCRIPTOR® and VIRACEPT® są zastrzeżonymi znakami towarowymi
SST® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Becton Dickinson and Co.
Symmetrel® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Endo Pharmaceuticals, Inc.
VIDEX® i ZERIT® są zastrzeżonymi znakami towarowymi Bristol-Myers Squibb
Company lub któregoś z jej oddziałów lub filii.
VIRAMUNE® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Roxane Laboratories, Inc.
ZADAXIN® jest zastrzeżonym znakiem towarowym SciClone Pharmaceuticals,
Inc.
ZOLOFT® jest zastrzeżonym znakiem towarowym Pfizer, Inc., jej filii, firm
zależnych lub firm udzielających jej licencji lub partnerów spółek joint venture.
Copyright 2009, Roche Molecular Systems, Inc.
Wszystkie prawa zastrzeżone.
11/2009
(00058003595-07ENGL)
04498356001-06
42/42
11/2009, Revision 10.0

COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus Test, version 2.0

Transkrypt

Podobne dokumenty

Ulotka, str. 1

Generuj PDF - Centralny Szpital Kliniczny MSWiA

1 PAŹDZIERNIK- Międzynarodowy Dzień Walki z

„STOP! HCV” Pilotażowy Program Profilaktyki Zakażeń HCV

POZnAńSKie SPOtKAniA infeKcJOLOGicZne

Śląsk zadba o bezpieczeństwo i higienę Rusza

Czytaj więcej