pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 4, str. 651–659
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
ANNA GESE, KATARZYNA ROSZEK
Metody wydajnej izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych z krwi pępowinowej
Methods of efficient isolation and culture of umbilical cord blood mesenchymal
stem cells
Zakład Biochemii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik Zakładu: Dr hab. Michał Komoszyński, prof. UMK
STRESZCZENIE
Krew pępowinowa jest jednym z najwaŜniejszych i najłatwiej dostępnych źródeł mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC, ang. mesenchymal stem cells). MoŜe być wykorzystywana w terapii wielu chorób, jednak jej zastosowanie jest ograniczone głównie do dzieci. Wynika to z mniejszej ilości komórek macierzystych w porównaniu na
przykład ze szpikiem kostnym. Z tego względu niezwykle istotne jest poznanie biologii komórek MSC, identyfikacja
czynników pozwalających na ich efektywną izolację z krwi pępowinowej oraz hodowlę i namnaŜanie tych komórek
w warunkach in vitro.
SŁOWA KLUCZOWE: Mezenchymalne komórki macierzyste – Krew pępowinowa
SUMMARY
Umbilical cord blood is one of the most important and most readily available source of mesenchymal stem cells
(MSC). It can be used in the treatment of many diseases, although its application is restricted mainly to children. This
is caused by the lower availability of stem cells in this particular type of body fluid (that is umbilical cord blood) in
comparison with other sources of MSC, such as bone marrow. Therefore, it is crucial to understand the biology of
MSC in order to identify the factors enabling their effective isolation from cord blood as well as the culture and proliferation of these cells in vitro.
KEY WORDS: Mesenchymal stem cells – Umbilical cord blood
WSTĘP
DuŜym zainteresowaniem badaczy w ostatnich latach cieszą się multipotencjalne mezenchymalne
komórki macierzyste (MSC, ang. mesenchymal stem cells). W terminologii naukowej nazywa się je
takŜe komórkami mezenchymalnymi stromy (MSC, ang. mesenchymal stromal cells) [1]. Określa się je
jako niehematopoetyczne [2, 5], niezróŜnicowane [6, 7], mononuklearne [8, 9] komórki zdolne do adhezji do plastiku [2-5, 8, 10-15]. W warunkach in vitro dzielą się z duŜą szybkością [4, 9], tworząc kolonie wydłuŜonych komórek wrzecionowatych o morfologii zbliŜonej do fibroblastów [2, 9, 12-16]
o długości 0,1-0,7 mm [17].
MSC występują w tkankach większości narządów dorosłych osobników, w których są róŜnorodnie
rozmieszczone [15]. Do roku 2007 udało się je zlokalizować we wszystkich analizowanych tkankach,
zarówno pochodzących od myszy jak i od człowieka [9, 18]. Najwcześniej odkrytym, a zarazem głównym ich źródłem jest jednak szpik kostny [3-5, 12, 15, 18-20]. Pierwsza udana izolacja MSC z tego
źródła miała miejsce w 1976 roku i przeprowadził ją Friedenstein i wsp. [4].
MSC cechuje ogólna multipotencja [4, 10, 15]. NiezaleŜnie od rodzaju subpopulacji, komórki te
wykazują zdolność do róŜnicowania w komórki pochodzenia mezodermalnego, takie jak: osteocyty,
652
A. GESE, K. ROSZEK
chondrocyty oraz adipocyty [2-6, 8-10, 13-17, 19, 21]. Zmiana fenotypu na bardziej wyspecjalizowany
zachodzi w specyficznych warunkach in vitro i in vivo [3, 14, 15]. Ponadto róŜne grupy badawcze potwierdziły zdolność MSC do róŜnicowania w kierunku innych tkanek pochodzenia mezodermalnego
(np. komórki mięśniowe, kardiomiocyty, ścięgna, więzadła, komórki stromy), ektodermalnego (np.
neurony, oligodendrocyty, astrocyty, komórki glejowe) oraz endodermalnego (np. hepatocyty) [9, 13,
16, 22].
Określenie warunków efektywnej izolacji, hodowli i kontrolowanego róŜnicowania niezróŜnicowanych komórek jest kwestią kluczową dla rozwinięcia przyszłych zastosowań klinicznych w sferze naprawy i regeneracji tkanek łącznych. Wyzwaniem jest takŜe utrzymanie w hodowli multipotencjalności
uzyskanych komórek macierzystych [2]. Między innymi z tego powodu przeprowadza się próby izolacji
MSC z innych tkanek. Do tej pory udało się ustalić, Ŝe ich źródłem mogą być: maź stawowa oraz błona
maziowa, okostna, tkanka chrzęstna, mięśnie szkieletowe, ścięgna, tkanka tłuszczowa, tkanki płodowe
(w tym np. wątroba), łoŜysko, krew płodowa, płyn owodniowy, błona owodniowa, błona kosmówkowa,
pępowina wraz z galaretą Wharton’a, krew pępowinowa), krew obwodowa, trzustka, stroma śledziony,
stroma grasicy, skóra, istota gąbczasta kości, płuca, endometrium, miazga zębowa, zęby mleczne [2, 4,
15, 18, 22].
Krew pępowinowa jako źródło komórek macierzystych
Krew pępowinowa stanowi część krwi wytworzonej przez rozwijający się płód w trakcie trwania
ciąŜy. Podczas Ŝycia płodowego jest ona konieczna do prawidłowej wymiany tlenu oraz substancji odŜywczych między matką a płodem. Wymiana ta zachodzi za pośrednictwem pępowiny, przy czym sama
krew pępowinowa nie miesza się z krwią matki.
Po porodzie krew pępowinowa pozostaje w sznurze pępowinowym oraz w naczyniach części płodowej łoŜyska [6, 17, 22]. Pomimo udowodnionej znacznej zawartości komórek macierzystych [23],
krew pępowinowa wraz z łoŜyskiem stanowi najczęściej odpad biologiczny i zwykle jest poddawana
utylizacji [22].
Krew pępowinową moŜna pobierać zarówno podczas porodu odbywającego się siłami natury [7, 22,
24], jak i w trakcie cesarskiego cięcia [22, 25]. W drugim przypadku wiąŜe się to jednak ze zmniejszeniem liczby białych krwinek na mililitr pobranej krwi pępowinowej [25]. W większości przypadków
krew pępowinowa jest pobierana przed urodzeniem łoŜyska [7, 19, 26], jednak w sytuacji, gdy proces
pobierania krwi zakłócałby przebieg porodu, krew pępowinową uzyskuje się z łoŜyska, które po jego
urodzeniu umieszcza się na specjalnym statywie [11, 26]. Następująca po pobraniu preparatyka krwi
pępowinowej jest procesem wieloetapowym, obejmującym izolację komórek mononuklearnych i
oczyszczanie populacji komórek macierzystych. Liczba uzyskanych w ten sposób komórek macierzystych zaleŜy od umiejętności pobierającego, a takŜe od takich czynników jak: wielkość łoŜyska i pojemność jego naczyń, długość sznura pępowinowego, czas trwania porodu oraz czas krzepnięcia krwi.
Krew pępowinowa jest waŜnym, szeroko akceptowanym źródłem hematopoetycznych komórek
macierzystych [17, 19], dlatego coraz częściej zostaje ona pobierana podczas porodu i następnie gromadzona w bankach krwi pępowinowej [23]. Na świecie do roku 2004 pobrano, zamroŜono i nadal
przechowuje się ponad 100000 jednostek krwi pępowinowej [6], które mogą zostać wykorzystane do
przeszczepu hematopoetycznych komórek macierzystych zarówno u dzieci, jak i u dorosłych [19].
Krew pępowinowa jest trzecim pod względem waŜności źródłem komórek macierzystych wykorzystywanych do transplantacji. Pozostałymi dwoma są szpik kostny oraz krew obwodowa [9]. Do przeszczepu moŜna wykorzystać zarówno całkowitą krew pępowinową, jak i wysoko oczyszczone populacje komórek macierzystych, czy nawet pojedyncze komórki [9]. Do 2003 roku na świecie przeprowadzono 3000 autologicznych i allogenicznych przeszczepów krwi pępowinowej [11], natomiast do roku
2008 liczba ta wzrosła do prawie 8000 [13].
W 1994 roku ukazało się doniesienie dotyczące moŜliwości uzyskania z krwi pępowinowej komórek adherentnych stromy, co udało się wstępnie potwierdzić w roku 2000 [12]. 3 lata później krew pę-
Metody wydajnej izolacji i hodowli
653
powinowa została uznana za alternatywne źródło MSC, zarówno do przeszczepów auto-, jak i allogenicznych [11, 14, 19]. Obecnie nie jest znane dokładne pochodzenie MSC krwi pępowinowej, jednak
sugeruje się, Ŝe komórki te wywodzą się z płodowej wątroby lub szpiku kostnego i w trakcie Ŝycia płodowego zostają uwolnione do krwioobiegu płodu, skąd trafiają do krwi pępowinowej [21, 27].
W porównaniu z innymi źródłami komórek macierzystych, krew pępowinowa ma wiele zalet [9, 11,
20]. Jedną z nich jest fakt, Ŝe obecne w niej komórki macierzyste są mniej dojrzałe zarówno pod względem stopnia zróŜnicowania, jak i pod względem immunologicznym [9, 22, 27]. Komórki macierzyste
krwi pępowinowej wykazują takŜe większy potencjał proliferacyjny w porównaniu z dorosłymi komórkami macierzystymi [11]. Szybsze tempo podziałów oraz mniejsza dojrzałość komórek macierzystych
z krwi pępowinowej wynikają z obecności w tych komórkach dłuŜszych odcinków telomerowych, będących skutkiem obecności aktywnej telomerazy. Dodatkowo genom komórek macierzystych z krwi
pępowinowej nie wykazuje cech starzenia się, co stwierdza się na postawie znikomego (bądź braku)
stopnia uszkodzenia materiału genetycznego spowodowanego promieniowaniem, mutagenami środowiskowymi lub błędami powstałymi w trakcie replikacji DNA oraz podziału chromosomów [11].
Korzystnym aspektem wykorzystania komórek macierzystych z krwi pępowinowej do transplantacji
jest takŜe fakt, Ŝe proces ten obarczony jest niskim ryzykiem odrzucenia przeszczepu [9, 20]. Stąd teŜ
moŜliwe jest wykonanie transplantacji komórek krwi pępowinowej od niespokrewnionego dawcy, posiadającego do dwóch niedopasowań w układzie antygenów HLA. Ostatecznie prowadzi to do znacznego poszerzenia puli dostępnych dawców [20, 22].
Kolejną zaletą komórek macierzystych z krwi pępowinowej jest większa prostota i nieinwazyjność
metody pobrania materiału biologicznego w porównaniu z innymi tkankami, takimi jak szpik kostny
czy tkanka tłuszczowa [21, 22]. Obecnie ze względu na niewielką liczbę MSC w jednej porcji krwi
pępowinowej [21, 26, 28], transplantacje komórek macierzystych z tego źródła stosuje się głównie
w przypadku dzieci [11]. Wynika to z faktu, Ŝe do przeprowadzenia transplantacji komórek macierzystych z krwi pępowinowej niezbędna jest odpowiednia ilość komórek jądrzastych, wynosząca 2,5×107 na
kilogram masy ciała pacjenta [26]. Równocześnie trwają jednak badania nad namnaŜaniem pozaustrojowym komórek macierzystych, co wraz z moŜliwością łączenia kilku jednostek krwi od róŜnych dawców, moŜe spowodować rozszerzenie puli odbiorców tej metody leczenia takŜe o osoby dorosłe [11,
26].
Mezenchymalne komórki macierzyste
Populacja MSC pochodzących z jednego źródła jest heterogenna. Do tej pory nie udało się bowiem
zdefiniować markera powierzchniowego charakterystycznego dla tych komórek, który tym samym pozwalałby na standaryzację procedur ich izolacji z róŜnych źródeł [2, 3, 5, 9]. Prawdopodobną tego przyczyną jest fakt, Ŝe MSC dzielą pewne cechy z komórkami endotelialnymi, epitelialnymi oraz mięśniowymi [2]. Dodatkowym utrudnieniem jest zmiana fenotypu MSC w trakcie ich hodowli w warunkach
in vitro [3].
MSC nie posiadają takich antygenów, jak: CD45 (wspólny antygen leukocytarny), CD34 (sialomucyna, prymitywny marker ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych), CD14 (receptor
LPS), CD11b (marker komórek odpornościowych), CD235 (glikoforyna A, marker linii erytroidalnej),
Ter119, CD31, MHC klasy II [2, 9, 10, 16, 22]. Na powierzchni tych komórek występują natomiast:
CD73 (ekto-5’nukleotydaza), STRO-1, CD105 (endoglina), CD44, CD29, CD90/Thy-1, CD106
(VCAM-1), CD27, CD271, CD13, Sca1, CD10, CD166, HLA klasy I [3, 5, 9, 10, 16, 22]. Szczególne
zainteresowanie wzbudza antygen CD146, wykazujący zmienną ekspresję w MSC. Sugeruje się bowiem, Ŝe moŜe on stanowić marker multipotencji tych komórek [21].
Na immunofenotyp komórek wpływa wiele czynników. Z punktu widzenia hodowli MSC w warunkach in vitro, najbardziej znaczącym jest jego zmienność pod wpływem trwania samej hodowli [3].
Poza tym na ekspresję markerów powierzchniowych wpływają takŜe inne czynniki, jak rodzaj tkanki
654
A. GESE, K. ROSZEK
źródłowej, wiek dawcy, rodzaj przeciwciał stosowanych do izolacji, senescencja w hodowli in vitro,
rodzaj zastosowanej poŜywki czy jej suplementacja [18].
Podczas hodowli in vitro, wzrastające komórki MSC naleŜy analizować pod względem cząsteczek
zaliczanych do negatywnych markerów MSC, obecnych na powierzchni tych komórek, które mogą
przypadkowo zostać wyizolowane wraz z MSC. Do tych typów komórek naleŜą: komórki dendrytyczne
(CD1a, CD33), monocyty (CD14, CD33), limfocyty (CD3, CD45), hematopoetyczne komórki macierzyste (CD34). Ze względu na brak charakterystycznego markera, a takŜe na róŜnice w fenotypie komórek MSC, koniecznym elementem oceny jakości wyizolowanych MSC jest określenie zdolności do
róŜnicowania w kierunku tkanki kostnej, chrzęstnej oraz tłuszczowej [18, 22].
Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z krwi pępowinowej
Standardowe podejście do izolacji MSC obejmuje uzyskanie z tkanki wyjściowej populacji komórek mononuklearnych, którą następnie wysiewa się na szalki w standardowej gęstości w minimalnych
poŜywkach zawierających płodową surowicę bydlęcą (FBS, ang. fetal bovine serum) [14, 21, 22]. Po
24–48 godzinach poprzez zmianę poŜywki usuwane są komórki nieadherentne, a hodowla komórek
przylegających do plastiku prowadzona jest do momentu znacznej redukcji szybkości wzrostu komórek
[7, 8]. Następuje to najczęściej po przekroczeniu wartości 40 podwojeń populacji. Po tym czasie dodaje
się czynniki wzrostu, w wyniku czego otrzymuje się selektywne wzbogacenie określonej subpopulacji
MSC. Najczęściej wykorzystywanym czynnikiem wzrostu jest zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów
(bFGF, ang. fibroblast growth factor), który w obecności 10% FBS wydłuŜa długość Ŝycia MSC do 70
podwojeń populacji [2].
Przed przystąpieniem do izolacji MSC, krew pępowinową rozcieńcza się często buforem fosforanowym (PBS, ang. phosphate-buffered saline) w stosunku 1:1 [7, 14, 19]. Czasami usuwa się takŜe z
próbki erytrocyty poprzez dwugodzinną inkubację krwi z 3% Ŝelatyną w soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej. Po tym czasie próbkę wiruje się przez 10 minut przy 400g. W wyniku tej procedury
otrzymuje się supernatant bogaty w komórki mononuklearne [24].
Właściwa izolacja komórek mononuklearnych obejmuje nałoŜenie próby na medium do izolacji i
wirowanie w gradiencie gęstości. Stosuje się róŜne rodzaje roztworów na bazie glicerolu o gęstości
1,077 g/cm3: Ficoll-Paque-Plus [7, 20, 21], Ficoll/Uropolina [11], Ficoll [14], Ficoll-Hypaque [17, 19,
24], Ficoll-Paque [8, 25, 28]. Tak przygotowane próby następnie się wiruje w następujących warunkach: 20–30 minut [7, 14, 19-21, 24, 25], 400-435g [7, 14, 19, 21, 24, 25], 10ºC [14] lub temperatura
pokojowa [7, 19, 21]. W wyniku tej procedury krew rozdziela się na szereg frakcji w zaleŜności od
gęstości komórek w nich zawartych. MSC znajdują się w interfazie, nad fazą fikolową [14, 19, 21].
Komórki te pobiera się i przemywa roztworem PBS [14, 19, 21], a następnie wiruje przy 200g przez 10
minut w temperaturze pokojowej [14]. Uzyskane komórki mononuklearne są najczęściej umieszczane
w gęstości 1–4×106 komórek/cm2 [7, 11, 17, 19-21, 24] na szalkach powlekanych płodową surowicą
cielęcą (FCS, ang. fetal calf serum) [7, 19] bądź niepowlekanych [14].
Nie istnieje metoda, która gwarantowałaby równocześnie odpowiednią wydajność i powtarzalność
przeprowadzanej izolacji MSC, gdyŜ metoda łącząca obie te cechy wymagałaby odtworzenia w hodowli złoŜonego środowiska in vivo danej tkanki [2].
Aby zwiększyć wydajność izolacji dodatkowo wykorzystuje się róŜnorodne techniki wzbogacania
populacji w komórki o poŜądanych właściwościach. Metody te wykorzystują róŜne cechy MSC, jak
wielkość, zdolność tworzenia monowarstwy lub rodzaj występujących na powierzchni komórek cząsteczek markerowych [2]. W wyniku zastosowania tych procedur uzyskuje się populacje odmienne pod
względem potencjału do wzrostu oraz róŜnicowania [2, 18].
NiezaleŜnie od rodzaju tkanki, moŜliwe jest przeprowadzenie etapu wzbogacania populacji w poŜądane komórki. Na tym poziomie moŜna zastosować kilka metod. Najczęściej wykorzystywanymi z nich
są: wzbogacanie przez wirowanie w gradiencie gęstości oraz oczyszczanie w oparciu o zdolność MSC
do adhezji. Pierwsze podejście wykorzystuje znaną gęstość MSC, która wynosi 1,073 g/ml [12], jednak
Metody wydajnej izolacji i hodowli
655
w jej wyniku nadal otrzymuje się populację heterogenną pod względem zdolności do proliferacji i róŜnicowania [10]. Druga procedura obejmuje usuwanie niezwiązanych z powierzchnią naczynia hodowlanego komórek poprzez wymianę poŜywki po określonym czasie od załoŜenia hodowli (1–7 dni) [12,
18]. Dodatkowo istnieje takŜe metoda pozwalająca na usunięcie innych adherentnych komórek zanieczyszczających populację MSC, takich jak: makrofagi i komórki endotelialne. Jest to procedura czasochłonna, wymagająca wielu cykli obejmujących hodowlę i pasaŜowanie [12]. Redukcję adhezji monocytów znajdujących się w izolowanym preparacie komórek mononuklearnych uzyskuje się przez suplementację medium hodowlanego 10–7 M deksametazonem. Po tygodniowej hodowli usuwa się komórki nieadherentne i wymiena poŜywkę na pozbawioną deksametazonu [21].
Podczas oczyszczania heterogennej populacji komórek wykorzystuje się specyficzne przeciwciała
przeciwko obecnym na powierzchni MSC cząsteczkom markerowym [18]. Wykorzystuje się je podczas
pozytywnej lub negatywnej selekcji z wykorzystaniem cytometrii przepływowej [22], magnetycznej
separacji komórek opłaszczonych metalowymi kulkami powlekanymi immunoglobulinami (MACS,
ang. magnetic immunobead-activated cell sorting) [18, 28] bądź poprzez sortowanie komórek w oparciu o fluorescencję barwników związanych z przeciwciałami (FACS, ang. fluorescence-activated cell
sorting) [18].
Do izolacji oczyszczonych populacji MSC wykorzystuje się takŜe technikę polegającą na selektywnej hodowli komórek o odpowiedniej wielkości [29]. Uzyskanie czystej kulury komórek jest takŜe moŜliwe dzięki metodzie zwanej ograniczonym rozcieńczaniem [8, 18]. Dodatkowo stosuje się nowatorskie
techniki. Jedną z nich jest izolacja MSC w oparciu o kulki magnetyczne powlekane aptamerami – specyficznymi względem komórek cząsteczkami DNA [18].
Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych
W hodowli MSC w warunkach in vitro stosuje się róŜnorodne poŜywki: DMEM [17, 21, 22], LGDMEM [7, 14, 20, 25], IMDM [8, 11, 24], MSCGS [7, 19, 25], α-MEM [25] wzbogacane surowicą 10–
20% (FBS (8, 17, 20, 21, 25) lub FCS [7, 11, 14]), 2-20mM L-glutaminą [8, 14, 17, 20, 24, 25], pirogronianem sodu [25], antybiotykami [8, 14, 17, 20, 24] oraz cytokinami: bFGF [8, 21], SCF (czynnik
wzrostu komórek pnia, ang. stem cell factor) [21], IL-3 [21], EGF (czynnik wzrostu naskórka, ang.
epidermal growth factor) [25], VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, ang. vascular
endothelial growth factor) [25].
Od momentu stwierdzenia w 1995 roku przez Caplana, Ŝe podstawowa poŜywka jest niewystarczająca do zapewnienia adhezji i proliferacji MSC, coraz częściej stosuje się suplementację mediów hodowlanych róŜnymi rodzajami surowic [12]. Do tej pory nie opracowano niezawodnej metody izolacji
MSC, niewykorzystującej surowicy. Najczęściej stosuje się suplementację surowicą o stęŜeniu od 2 do
20%. Większość protokołów opiera się o dodanie FCS [3]. Dostarcza ona komórkom niezbędnych
czynników wzrostu oraz białek odpowiedzialnych za adhezję [12]. Obawy wynikające z moŜliwości
przeniesienia na hodowane komórki BSE lub innej infekcji oraz nieprzewidywalna reakcja immunologiczna gospodarza powodują prowadzenie dalszych badań nad innymi suplementami poŜywek. Udało
się opracować techniki oparte na alternatywnych odczynnikach pochodzenia ludzkiego – surowicy,
lizatu płytkowego bądź osoczu. JednakŜe wpływ tych składników na jakość preparatów komórkowych
jest nieznany. Badania nad kinetyką wzrostu oraz morfologią komórek wskazują na ich istotne znaczenie w procesie izolacji i wzrostu komórek [3, 30]. Wadą płodowej surowicy cielęcej, a takŜe innych
preparatów surowiczych, jest takŜe brak stałego, zdefiniowanego i niezmiennego składu. Zawierają one
nieznane czynniki wzrostu, które mogą wpływać na fizjologię MSC lub modyfikować ekspresję genów
[12]. Rozwój w chemicznie zdefiniowanym, pozbawionym surowicy środowisku jest istotny dla ujednolicenia metod izolacji MSC [3]. Suplementacja poŜywki bFGF minimalizuje wpływ róŜnic w składzie surowicy, natomiast czynniki wzrostowe zawarte w płytkach krwi znoszą całkowicie jej działanie.
Szczególnie waŜny jest w tej grupie płytkowy czynnik wzrostu (PDGF, platelet-derived growth factor).
W hodowli MSC wykorzystywany jest od lat osiemdziesiątych XX wieku, ze względu na silne działa-
656
A. GESE, K. ROSZEK
nie mitogenne, w wyniku czego komórki dzielą się szybciej, przy zachowaniu ogólnej, charakterystycznej morfologii [12].
W latach dziewięćdziesiątych XX wieku opracowano poŜywkę do hodowli MSC, pozwalającą na
jej prowadzenie w określonych warunkach składu podłoŜa. PoŜywka ta nie zawiera cząsteczek odpowiedzialnych za adhezję ani czynników wzrostu. Zatem do utrzymania odpowiedniego poziomu proliferacji niezróŜnicowanych komórek niezbędne jest zastosowanie powlekania powierzchni naczyń hodowlanych fibronektyną oraz dodanie do poŜywki odpowiednich czynników wzrostu [12].
Hodowla in vitro MSC jest prowadzona w 37ºC [7, 11, 14, 17, 19, 20, 24], w atmosferze o odpowiedniej wilgotności [7, 19, 20, 24] i stęŜeniu dwutlenku węgla wynoszącym około 5% [7, 11, 14, 17,
19, 20, 24] do momentu uzyskania 60-80% stanu konfluencji [8, 11, 14, 17, 20]. Po ustalonym czasie
usuwa się z hodowli komórki nieadherentne poprzez wymianę poŜywki nad warstwą komórek przyklejonych do podłoŜa [8, 19]. Najczęściej przeprowadza się to po więcej niŜ 12 godzinach hodowli [7, 17,
20] (1-5 dni [17, 20]). Zbyt krótki czas pozwalający komórkom adherentnym na przyleganie do naczyń
hodowlanych powoduje obniŜenie efektywności izolacji MSC [6].
Po uzyskaniu populacji komórek adherentnych wymienia się całą objętość poŜywki co 3-5 dni [8,
14, 20], bądź połowę objętości poŜywki raz w tygodniu [11, 17, 24]. Hodowlę prowadzi się do momentu uzyskania ponad 50% konfluencji [8, 11, 14, 17, 20], a następnie przeprowadza się pasaŜowanie
przez trypsynizację [7, 8, 11, 14, 17, 19, 20], rozcieńcza w stosunku 1:3 [8, 11] i wysiewa w gęstości 2–
5×103 komórek/cm2 [7, 17, 19, 20].
Na zdolność proliferacji MSC w warunkach in vitro duŜy wpływ ma stęŜenie tlenu w fazie gazowej
nad powierzchnią poŜywki. 20% zawartość tlenu obecna w powietrzu atmosferycznym nie przypomina
warunków fizjologicznych właściwych dla MSC. W warunkach in vivo stęŜenie tlenu jest znacznie
niŜsze i róŜni się w zaleŜności od rodzaju tkanki i umiejscowienia w niej komórek macierzystych.
Przykładowo w tkance kostnej stęŜenie tlenu waha się od 1–12%. MSC w tych warunkach są naraŜone
na działanie hipoksji. Hodowla pozaustrojowa w warunkach niedoboru tlenu stymuluje proliferację
i wydłuŜa czas Ŝycia komórek. Hipoksja zwiększa produkcję (zarówno syntezę, jak i organizację) elementów macierzy zewnątrzkomórkowej, a takŜe zmienia ekspresję genów zaangaŜowanych w metabolizm. ObniŜona zawartość tlenu indukuje takŜe produkcję czynników wzrostu takich, jak: VEGF, endotelialny czynnik wzrostu wiąŜący heparynę (HB-EGF, heparin-binding endothelial growth factor) oraz
czynnik wzrostowy łoŜyska (PGF, placenta growth factor). Dodatkowo hipoksja obniŜa potencjał do
róŜnicowania MSC, ułatwiając w ten sposób utrzymanie ich w stanie niezróŜnicowanym [12].
Odpowiednie warunki hodowli oraz przeprowadzanie pasaŜowania wystarczają do otrzymania ostatecznie oczyszczonych MSC pozbawionych populacji innych komórek adherentnych (makrofagi, limfocyty, komórki endotelialne). Jednak kolejne pasaŜe mogą zmieniać cechy MSC. Mogą powodować
redukcję szybkości podziałów oraz utratę multipotencjalności. Starzenie się MSC podczas wzrostu w
warunkach in vitro moŜe być powiązane z długością telomerów [12].
Jakość otrzymanych MSC moŜna ocenić na podstawie analizy morfologii komórek [7, 17, 19], ich
zdolności do proliferacji [8, 20], potencjału do róŜnicowania [7, 8, 14, 20], immunofenotypu (np. metodą FACS) [7, 8, 14, 17, 19, 20] oraz ekspresji genów [17, 20].
Uwagi końcowe
Porównanie efektywności metod stosowanych do izolacji MSC z krwi pępowinowej jest utrudnione
poprzez brak standaryzacji protokołów oraz przez szereg róŜnych czynników wpływających na wydajność izolacji oraz hodowli tych komórek – Rycina 1.
Metody wydajnej izolacji i hodowli
Biomateriały i powlekanie powierzchni:
- adhezja do plastiku
- powlekanie fibronektyną, Ŝelatyną, kolagenem
- hodowle 3D
Metoda izolacji komórek i wzboWarunki hodowli:
gacanie:
- rodzaj poŜywki podstawo- ficoll
wej
- rodzaj uŜytych markerów moleku- ciśnienie tlenu
larnych:
- eliminacja komórek CD45
- stęŜenie dwutlenku węgla
- pozytywna selekcja (np. CD271)
- kriokonserwacja
Wydajność izolacji i hodowli MSC
Rodzaj tkanki:
- szpik kostny
- krew pępowinowa
- krew obwodowa
- tkanka tłuszczowa
- skóra
Zmienność dawcy
657
Suplementacja związkami
chemicznymi:
- L-glutamina
- pirogronian sodu
- antybiotyki
- cytokiny i czynniki wzrostu
Suplementacja surowicą:
- FCS (i inne)
- ludzka surowica
- osocze bogate w płytki
Hodowla in vitro:
- czas hodowli
- pasaŜowanie
- senescencja
- gęstość komórek
- kriokonserwacja
Ryc. 1. Czynniki wpływające na wydajność izolacji i hodowli MSC (3) – zmodyfikowano.
Fig. 1. Factors affecting the efficiency of MSC isolation and culture (3) – modified
Ustalono doświadczalnie, Ŝe objętość pobranej próbki krwi pępowinowej przekraczająca 33 ml,
czas od pobrania do izolacji komórek macierzystych – nie większy niŜ 15 godzin oraz uzyskana ogólna
liczba komórek mononuklearnych przekraczająca 108 pozwalają na efektywną izolację MSC z 60%
jednostek krwi [12, 25, 31]. Znaczną poprawę efektywności (nawet 90%) uzyskuje się skracając czas do
mniej niŜ 2 godzin, przy wyselekcjonowaniu jednostek krwi pępowinowej przekraczających objętość
90 ml [21].
Na efektywność izolacji MSC wpływają takŜe czynniki niezaleŜne od samej procedury izolacji [3,
12]. NajwaŜniejszym parametrem tego typu jest zmienność dawcy materiału. MSC są izolowane jako
pierwotne preparaty komórkowe od dawców o róŜnym podłoŜu genetycznym. Dlatego wykluczenie
wpływu tego parametru na izolację jest praktycznie niemoŜliwe [3].
MSC mogą być pasaŜowane ograniczoną liczbę razy – ok. 8–15 pasaŜy, co odpowiada 25–40 podwojeniom populacji. Po tym czasie komórki ulegają senescencji (starzeniu się) i przestają proliferować. Towarzyszą temu zmiany morfologiczne objawiające się powiększeniem komórek. Obserwowana
jest takŜe redukcja gęstości hodowli. Dokładny molekularny mechanizm senescencji jest nieznany.
Wiadomo jednak, Ŝe proces starzenia komórkowego ma wpływ na profile molekularne oraz cechy
funkcjonalne MSC. Wykazano takŜe, Ŝe komórki w stanie konfluencji tracą częściowo potencjał do
róŜnicowania [3].
MSC są często poddawane zamraŜaniu w ciekłym azocie w obecności dimetylosulfotlenku
(DMSO). Udowodniono, Ŝe w wyniku kriokonserwacji komórki te nie tracą potencjału do róŜnicowania
[3], jednak ilość komórek macierzystych po rozmroŜeniu spada do 0–19% liczebności wyjściowej populacji [12]. Nie moŜna wykluczyć takŜe wpływu zamraŜania na właściwości biologiczne MSC [3].
Wszystkie te czynniki wpływają na brak powtarzalności rezultatów zastosowanych procedur izolacji MSC z krwi pępowinowej, przez co ograniczają kliniczne moŜliwości ich wykorzystania [21]. Ze
względu na liczbę moŜliwych róŜnic wynikających z wpływu wspomnianych czynników, nie jest moŜliwe uwzględnienie ich wszystkich w procedurze izolacji i hodowli MSC. Dlatego właśnie odnalezienie
precyzyjnego markera molekularnego, który mógłby być stosowany do specyficznej izolacji wszystkich
MSC – niezaleŜnie od ich źródła, wydaje się być niezbędne [3].
658
A. GESE, K. ROSZEK
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
Urbaniak-Kujda D, Wołowiec D, Tomaszewska-Toporska B, Kapelko-Słowik K, Kuliczkowski K. Mezenchymalne
komórki macierzyste: ich biologia i perspektywy zastosowań klinicznych. Acta Haematol Pol. 2005; 36(2):161-6.
Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and
gene therapy. J Cell Mol Med. 2004; 8(3): 301-16.
Wagner W, Ho AD. Mesenchymal stem cell preparations - comparing apples and oranges. Stem Cell Rev. 2007; 3(4):
239-48.
Pountos I, Giannoudis PV. Biology of mesenchymal stem cells. Injury. 2005; 36 Suppl 3:S8-S12.
Bajek A, Olkowska J, Drewa T. Mezenchymalne komórki macierzyste narzędziem terapeutycznym w regeneracji tkanek i
narządów. Postepy Hig Med Dosw. 2011; 65: 124-32.
Lee MW, Choi J, Yang MS, Moon YJ, Park JS, Kim HC, et al. Mesenchymal stem cells from cryopreserved human
umbilical cord blood. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 320(1): 273-8.
Kern S, Eichler H, Stoeve J, Kluter H, Bieback K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,
umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 2006; 24(5): 1294-301.
Lee OK, Kuo TK, Chen WM, Lee KD, Hsieh SL, Chen TH. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from
umbilical cord blood. Blood. 2004; 103(5): 1669-75.
Bieback K, Kluter H. Mesenchymal stromal cells from umbilical cord blood. Curr Stem Cell Res Ther. 2007;2(4):310-23.
Kolf CM, Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche,
self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 2007; 9(1): 204.
Pojda Z, Machaj EK, Gajkowska A, Ołdak T, Jastrzewska M. Badanie potencjalnej przydatności klinicznej komórek
macierzystych uzyskiwanych z krwi pępowinowej. Postępy Biol Kom. 2003; 30: 127-37.
Bourin P, Gadelorge M, Peyrafitte J-A, Fleury-Cappellesso S, Gomez M, Ragea C, et al. Mesenchymal Progenitor Cells:
Tissue Origin, Isolation and Culture. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2008; 35: 160-7.
Roszek K, Komoszynski M. Kontrola i kierunki róŜnicowania komórek macierzystych krwi pępowinowej oraz ich
zastosowanie terapeutyczne. Postepy Hig Med Dosw. 2008; 62: 660-7.
Musina RA, Bekchanova ES, Belyavskii AV, Grinenko TS, Sukhikh GT. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells.
Bull Exp Biol Med. 2007; 143(1): 127-31.
Chen Y, Shao JZ, Xiang LX, Dong XJ, Zhang GR. Mesenchymal stem cells: a promising candidate in regenerative
medicine. Int J Biochem Cell Biol. 2008; 40(5): 815-20.
Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. J Inflamm (Lond). 2005;
2: 8.
Goodwin HS, Bicknese AR, Chien SN, Bogucki BD, Quinn CO, Wall DA. Multilineage differentiation activity by cells
isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers. Biol Blood Marrow Transplant. 2001;
7(11): 581-8.
Rojewski MT, Weber BM, Schrezenmeier H. Phenotypic Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Various
Tissues. Transfus Med Hemother. 2008; 35: 168-84.
Feldmann RE, Jr., Bieback K, Maurer MH, Kalenka A, Burgers HF, Gross B, et al. Stem cell proteomes: a profile of
human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood. Electrophoresis. 2005; 26(14): 2749-58.
Gang EJ, Hong SH, Jeong JA, Hwang SH, Kim SW, Yang IH, et al. In vitro mesengenic potential of human umbilical
cord blood-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 321(1): 102-8.
Zhang X, Hirai M, Cantero S, Ciubotariu R, Dobrila L, Hirsh A, et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem
cells from human umbilical cord blood: Reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to
proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose
tissue. J Cell Biochem. 2011; 112(4): 1206-18.
Malgieri A, Kantzari E, Patrizi MP, Gambardella S. Bone marrow and umbilical cord blood human mesenchymal stem
cells: state of the art. Int J Clin Exp Med. 2010; 3(4): 248-69. PMCID: 2971538.
Sikora MA, Olszewski WL. Komórki macierzyste - biologia i zastosowanie terapeutyczne. Postepy Hig Med Dosw. 2004;
58: 202-8.
Alfonso ZZC, Forneck ED, Allebrandt WF, Nardi NB. Establishment of an adherent cell layer from human umbilical cord
blood. Genetics and Molecular Biology. 2000; 23(3): 519-22.
Flynn A, Barry F, O'Brien T. UC blood-derived mesenchymal stromal cells: an overview. Cytotherapy. 2007; 9(8): 71726.
Rubinstein P. Cord blood banking for clinical transplantation. Bone Marrow Transplant. 2009; 44(10): 635-42.
Korycka A, Robak T. Komórki macierzyste krwi pępowinowej - nadzieje i rzeczywistość. Acta Haematol Pol. 2005; 36:
389-98.
Laitinen A, Laine J. Isolation of mesenchymal stem cells from human cord blood. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2007;
Chapter 2: Unit 2A 3.
Hung SC, Chen NJ, Hsieh SL, Li H, Ma HL, Lo WH. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human
bone marrow. Stem Cells. 2002; 20(3): 249-58.
Metody wydajnej izolacji i hodowli
659
30. Avanzini MA, Bernardo ME, Cometa AM, Perotti C, Zaffaroni N, Novara F, et al. Generation of mesenchymal stromal
cells in the presence of platelet lysate: a phenotypic and functional comparison of umbilical cord blood- and bone marrowderived progenitors. Haematologica. 2009; 94(12): 1649-60. PMCID: 2791945.
31. Fan X, Liu T, Liu Y, Ma X, Cui Z. Optimization of primary culture condition for mesenchymal stem cells derived from
umbilical cord blood with factorial design. Biotechnol Prog. 2009; 25(2): 499-507.
Praca wpłynęła do Redakcji 16.06.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 03.11.2011 r.
Adres do korespondencji:
Anna Gese
Zakład Biochemii UMK
ul. Gagarina 7
87-100 Toruń
e-mail: [email protected]