POLMICRO 2014 – Ogólnopolski

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
Diagn Lab 2015; 51(2): 123-130
Praca oryginalna • Original Article
POLMICRO 2014 – Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian
Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej
POLMICRO 2014 – Polish National External Quality Assessment Scheme
in Microbiological Diagnostics
Ewa Młodzińska1, Elżbieta Stefaniuk1,2, Karolina Bosacka1, Beata Chmylak1,
Monika Fortuna1, Waleria Hryniewicz1,2
1
Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa
2
Narodowy Instytut Leków, Warszawa
Streszczenie
W 2014 roku w ramach działania statutowego Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM)
przeprowadzono dwa typy sprawdzianów: jeden – przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę pełnoprofilową oraz
drugi – oddzielny sprawdzian przeznaczony dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Celem programu POLMICRO 2014 była
ocena biegłości laboratoriów w identyfikacji drobnoustrojów, oznaczaniu wrażliwości na antybiotyki i wykrywaniu mechanizmów oporności. Przesyłane w ramach Programu izolaty bakteryjne różniły się wrażliwością na antybiotyki oraz obecnością różnych mechanizmów
oporności. Praca przedstawia wyniki XXI edycji – POLMICRO 2014.
Summary
In 2014 Centre for Quality Control in Microbiology (CQCM)organized two different types of proficiency programmes: one was designed
for laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics and the second was prepared for laboratories dealing with
enteric infections only. The aim of the POLMICRO 2014 programme was to evaluate proficiency of laboratories in the identification of
microorganisms, determination of susceptibility to antibiotics and detection of resistance mechanisms. Bacterial isolates distributed
within the Programme differed in their susceptibility to antibiotics and a presence of various resistance mechanisms. The paper presents
the results of the XXI edition – POLMICRO 2014.
Słowa kluczowe: POLMICRO, zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności
Key words:
POLMICRO, external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance
mechanisms
Wstęp
Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) w Warszawie jest organizatorem Ogólnopolskiego
Zewnątrzlaboratoryjnego Sprawdzianu Wiarygodności Badań
w Diagnostyce Mikrobiologicznej „POLMICRO”. Uczestnictwo medycznych laboratoriów mikrobiologicznych (MLM) w Programie
POLMICRO jest obowiązkowe i wynika z Rozporządzenia Ministra
Zdrowia z dnia 21 stycznia 2009r. zmieniającego rozporządzenie
w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych (Dz. U. Nr 22, poz. 128).
Sprawdzian POLMICRO organizowany jest od roku 1997, a jego
głównym celem jest ocena kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych w zakresie klasycznej diagnostyki mikrobiologicznej:
interpretacji wstępnego etapu diagnostyki mikrobiologicznej
(bezpośredniego preparatu mikroskopowego), identyfikacji
czynników etiologicznych zakażeń, oznaczania lekowrażliwości
i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów
wywołujących zakażenia, a także promowanie nowych metod
diagnostycznych w tym obszarze, standaryzacja i ujednolicanie
rutynowo stosowanych metod w laboratoriach oraz edukacja
mikrobiologów klinicznych.
COBJwDM corocznie prowadzi dwa rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POLMICRO dla laboratoriów świadczących pełnoprofilową
diagnostykę mikrobiologiczną (Edycja Ogólna) oraz sprawdzian
POLMICRO/SSE – dla laboratoriów schorzeń jelitowych.
W roku 2014 przeprowadzono już XXI edycję programu POLMICRO.
Łącznie w roku 2014 COBJwDM zorganizował sześć tur sprawdzianów, cztery w edycji ogólnej i dwie dotyczące identyfikacji
123
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
niem szczepów
b a k t e r y j nyc h
p r ze d s t aw i o nych w tabeli 1,
pochodzących
z kolekcji COBJwDM.
Tury I, III i IV
edycji ogólnej
sprawdzianu
POLMICRO
2014 polegały
na identyfikacji gatunkowej
drobnoustro Rycina 1. Liczba laboratoriów biorących udział w poszczególnych turach POLMICRO 2014 (XXI edycja)
jów izolowanych
pałeczek jelitowych odpowiedzialnych za zakażenia przewodu
z zakażeń inwazyjnych i ocenie fenotypu lekowrażliwości oraz
pokarmowego. Podobnie jak w latach poprzednich, przedmiotem
wytwarzania mechanizmów oporności. W drugiej turze poddano
sprawdzianów edycji ogólnej w roku 2014 były izolaty bakteryjne
kontroli wstępny etap diagnostyki mikrobiologicznej – ocenę
o różnych fenotypach wrażliwości na leki przeciwdrobnoustrojowe.
bezpośredniego preparatu mikroskopowego, a wyniki tego sprawW obliczu coraz częściej pojawiających i rozprzestrzeniających się
dzianu zostały przedstawione w nr 50 Diagnostyki Laboratoryjnej
szczepów wielolekoopornych, prawidłowa identyfikacja gatun(2014).
kowa patogenu oraz szybka i wiarygodna identyfikacja mechaniW ramach edycji POLMICRO 2014/SSE przedmiotem porównań
zmów oporności mają kluczowe znaczenie w terapii zakażeń oraz
międzylaboratoryjnych była identyfikacja (I tura) lub identyfikaw ich skutecznej kontroli. Tematem niniejszego opracowania jest
cja i oznaczenie lekowrażliwości (II tura) szczepów izolowanych
przedstawienie wyników programu – POLMICRO 2014.
z zakażeń przewodu pokarmowego. Oceny wyników dokonywano
Materiał i metody
z uwzględnieniem zakresów prowadzonej diagnostyki zadeklaroPorównania międzylaboratoryjne w ramach XXI Edycji Ogólnej
wanych przez poszczególne Laboratoria. Analizie poddano także
Programu POLMICRO 2014 zostały przeprowadzone z wykorzystarutynowo stosowane w laboratoriach metody oznaczania lekow-
Tabela 1. Izolaty bakteryjne wykorzystane w Programie POLMICRO 2014 (edycja XXI)
Gatunek drobnoustroju
Acinetobacter baumannii
Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae
Moraxella catarrhalis
Neisseria meningitidis
Salmonella Eko
Salmonella Hillingdon
Salmonella Muenchen
Salmonella Thompson
nr kolekcji POLMICRO
Fenotyp wrażliwości/mechanizmy oporności
POLMICRO 2014 – tura I – edycja ogólna
PM-223
[AK, TOB, COL]=S [CIP, GE, IPM, MEM, SXT]=R
[AK, TOB, GE, CIP, IPM, MEM, SXT]=S
PM-224
ERT=I, [CTX, CXM, CAZ, CRO, TZP]=R
POLMICRO 2014 – tura III – edycja ogólna
PM-225
HLAR
[AMP, TEC, VA, TGC]=S; LZD=R
PM-226
HLAR
[AMP, TEC, VA, TGC]=S; LZD=R
POLMICRO 2014 – tura IV – edycja ogólna
PM-229
M-fenotyp
P=I/R, [CTX, CRO]=S/I, [LEV, MOX, TET, RF, VA]=S; SXT=R
PM-230
MLSB konstytutywny
P=I/R, [CTX, CRO]=I, [LEV, MOX, TET, RF, VA, SXT]=S
PM-231
BLPAR
[P, AMP]=R, [AMC, CTX, CRO, CXM, CIP, TET, SXT]=S
PM-232
BLNAS
[P, AMP, AMC, CTX, CRO, CXM, CIP, TET, SXT]=S
PM-233
PM-234
POLMICRO 2014/SSE – tura I
PM-221
PM-222
POLMICRO 2014/SSE – tura II
PM-227
[AMP, AMC]=I, [CTX, CAZ, CRO, PEF, CIP, SXT]=S
PM-228
[AMP, AMC]=I, [CTX, CAZ, CRO, PEF, CIP, SXT]=S
HLAR– oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy, M-fenotyp – oporność na erytromycynę, wrażliwość na klindamycynę; BLPAR – sczep wytwarzający β-laktamazę,
ampicylina oporna, BLNAS– sczep β-laktamazo-ujemny, ampicylina wrażliwa
AK-amikacyna, AMP-ampicylina, CAZ-ceftazydym, CIP-ciprofloksacyna, COL-kolistyna, CRO-ceftriakson, CTX-cefotaksym, CXM-cefuroksym, ERT-ertapenem, GE-gentamicyna, IPM-imipenem, LEV-lewofloksacyna, LZD-linezolid, MEM-meropenem, MOX-moksifloksacyna, PEF-pefloksacyna, P-penicylina, RF-rifampicyna, SXT-trimetoprim/
sulfametoksazol, TEC-teikoplanina, TET-tetracyklina, TGC-tigecyklina, TOB-tobramycyna, TZP-piperacylina/tazobaktam, VA-wankomycyna
S (susceptible) – wrażliwy, I (intermediate) – średniowrażliwy, R (resistant)-oporny
124
Diagn Lab 2015; 51(2): 123-130
rażliwości oraz realizację wewnętrznej kontroli jakości testów
wrażliwości. Wyniki analizy miały wyłącznie charakter edukacyjny
i nie miały wpływu na końcową ocenę kompetencji laboratoriów.
Program POLMICRO już od kilku lat przeprowadzany jest z wykorzystaniem specjalnie przygotowanej strony internetowej www.
polmikro.edu.pl. Wyniki testów wrażliwości podlegały ocenie wyłącznie dla izolatów poprawnie zidentyfikowanych; ocenę przeprowadzono w oparciu o kategoryzację błędnych wyników interpretacji klinicznej na małe (mE – minor error), duże (ME– major
error) i bardzo duże błędy (VME – very major error). Zastosowana
kwalifikacja błędów oparta jest na zaleceniach Centers for Disease Control and Prevention (CDC) i stosowana jest w Centralnym
Ośrodku od wielu lat. Szczegółowe wyniki poszczególnych edycji
sprawdzianu oraz interpretacja wyników każdorazowo były zamieszczane na stronie internetowej Ośrodka.
Laboratoria, które uczestniczyły w danej edycji we wszystkich
turach sprawdzianu uzyskując wyłącznie wyniki pozytywne otrzymały Świadectwa Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego
Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej. Świadectwa posiadają indywidualny numer i zachowują
ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia.
Wyniki i omówienie
W poszczególnych turach sprawdzianów POLMICRO w roku 2014
uczestniczyła różna liczba laboratoriów mikrobiologicznych (rycina 1).
WYNIKI POLMICRO 2014 – EDYCJA OGÓLNA
Identyfikacja drobnoustrojów
1. Poprawną identyfikację badanych szczepów przekazanych laboratoriom w ramach I tury POLMICRO 2014 (Acinetobacter
baumannii PM-223 i Enterobacter cloacae PM-224) podało
aż 99,1% jednostek. Tylko 2 spośród 453 Laboratoriów błędnie zidentyfikowało obydwa badane szczepy, a cztery laboratoria popełniły błąd w identyfikacji jednego ze szczepów.
Szczep A. baumannii błędnie został określony jako Pseudomonas putida, a także jako Escherichia coli, natomiast szczep
E. cloacae w pięciu przypadkach zidentyfikowany został jako
Enterobacter kobei lub Klebsiella pneumoniae, a nawet Enterococcus casseliflavus. Laboratoriom tym przyznano oceny negatywne i tym samym nie oceniano testów lekowrażliwości.
2. W ramach III tury edycji ogólnej 2014 laboratoria otrzymały
dwa izolaty ziarenkowców Gram-dodatnich z rodzaju Enterococcus (E. faecalis PM-225 oraz E. faecium PM-226). Gatunek
każdego z badanych izolatów poprawnie określiło czterysta
pięćdziesiąt laboratoriów (99,6%). Tylko dwa laboratoria popełniły błędy oznaczając szczepy E. faecium jako E. faecalis.
3. W ramach IV tury POLMICRO 2014 laboratoria otrzymały zestaw sześciu szczepów bakteryjnych, należących do
grupy drobnoustrojów wymagających, wyizolowanych
z zakażeń inwazyjnych (tabela 1). Cztery laboratoria nie
ożywiły badanych szczepów, mimo, że przygotowanie
i procedura rozsyłania próbek kontrolnych przez COBJwDM
gwarantowały żywotność szczepów. Brak wzrostu badanych izolatów spowodowany był nieprzestrzeganiem za-
sad rutynowych procedur diagnostycznych stosowanych
przy tego typu drobnoustrojach: przechowywanie podłoży
transportowych w lodówce, posiew na podłoża niezapewniające wymagań wzrostowych dla tych izolatów, a także
inkubacja w warunkach tlenowych. Zadaniem laboratoriów
była identyfikacja gatunkowa wszystkich izolatów, natomiast określenie wrażliwości tylko szczepów Streptococcus
pneumoniae (PM-229 i PM-230) oraz Haemophilus influenzae (PM-231 i PM-232). Czterysta dwadzieścia cztery
(95,9%) laboratoria poprawnie zidentyfikowały wszystkie
sześć izolatów, a trudności w identyfikacji pojedynczych
izolatów miało czternaście laboratoriów (3,2%). Błędna
identyfikacja dotyczyła głównie izolatów Neisseria meningitidis (PM-234) oraz Moraxella catarrhalis (PM-233).
Sześć laboratoriów nieprawidłowo określiło izolaty M. catarrhalis PM-233, jako N. meningitidis i N. meningitidis PM234 jako M. catarrhalis. W przypadku izolatu Moraxella catarrhalis PM-233 aż osiem laboratoriów podało starą nazwę
gatunkową Branhamella catarrhalis (odpowiedź oceniono
wprawdzie pozytywnie, jednak opatrzono ją uwagą o obowiązku stosowania aktualnego nazewnictwa. Szczegółowe wyniki identyfikacji szczepów w tej turze sprawdzianu
przedstawiono w tabeli 2.
Tabela 2. Identyfikacja izolatów w kontroli POLMICRO 2014 – IV tura
Identyfikacja
Liczba laboratoriów n=442
Streptococcus pneumoniae PM-229
Streptococcus pneumoniae
440
Streptococcus mitis
1
Brak identyfikacji
1
Streptococcus pneumoniae PM-230
Streptococcus pneumoniae
440
Brak identyfikacji
2
Haemophilus influenzae PM-231
Haemophilus influenzae
439
Haemophilus parainfluenzae
2
Brak identyfikacji
1
Haemophilus influenzae PM-232
Haemophilus influenzae
437
Haemophilus parainfluenzae
2
Brak identyfikacji
3
Moraxella catarrhalis PM-233
Moraxella catarrhalis
416
Branhamella catarrhalis
8
Neisseria meningitidis
7
Neisseria sicca
2
Neisseria gonorrhoeae
1
Staphylococcus aureus
2
Kocuria rosea
1
Brak identyfikacji
5
Neisseria meningitidis PM-234
Neisseria meningitidis
424
Moraxella catarrhalis
8
Neisseria spp.
2
Neisseria sicca
2
Neisseria gonorrhoeae
1
Staphylococcus aureus
2
Brak identyfikacji
3
125
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
prawidłową odpowiedź:
„Szczep jest podejrzewany
o wytwarzanie MBL”. Laboratoriom tym przyznano oceny
negatywne.
Szczep Enterobacter cloacae PM-224 to szczep
z derepresją cefalosporynazy
AmpC. Szczep był wrażliwy
na aminoglikozydy – amikacyna, gentamicyna i tobramycyna – wszystkie podane
przez laboratoria wyniki,
z jednym wyjątkiem, były
prawidłowe – jedno laboratorium popełniło błąd oznaczając szczep jako oporny
Rycina 2. Rozkład wielkości stref zahamowania wzrostu (mm) – E. cloacae PM-224/ ertapenem 10 µg
na gentamicynę. Nie odnotowano także znaczących
Lekowrażliwość i mechanizmy oporności
rozbieżności w wynikach oznaczeń wrażliwości szczepu na
ciprofloksacynę i trimetoprim z sulfametoksazolem – 99,8%
1. W ramach I tury POLMICRO 2014 ocenie poddano wyniki
prawidłowych wyników (szczep wrażliwy na oba leki).
oznaczeń 447 laboratoriów, które poprawnie zidentyfikowały
Szczep E. cloacae PM-224 nie był producentem ESBL
obydwa badane izolaty (Acinetobacter baumannii PM-223
(β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym),
i Enterobacter cloacae PM-224).
natomiast obecność mechanizmu ESBL stwierdziło osiem
Wrażliwość szczepu Acinetobacter baumannii PM-223 na
laboratoriów (1,8%). Wszystkie te laboratoria otrzymały nekolistynę, amikacynę i tobramycynę prawidłowo określiło
gatywne oceny końcowe.
blisko 100% laboratoriów. Dwa spośród 447 laboratoriów
Szczep PM-224 był wrażliwy na imipenem i meropenem,
zastosowało niezgodną z europejskimi zaleceniami (EUCAST;
wykazywał natomiast obniżoną wrażliwość na ertapenem,
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)
w związku z czym, zgodnie z zaleceniami KORLD (Krajowy
metodę oznaczania wrażliwości na kolistynę, co zostało poOśrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów)
traktowane jako „bardzo duży błąd” (VME) i zadecydowało
z roku 2013, kwalifikował się do wykonania testów w kierunku
o przyznaniu tym Laboratoriom negatywnej oceny końcowykrywania karbapenemaz.
wej. Zgodnie z zaleceniami wrażliwość na kolistynę należy
oznaczać wyłącznie na podstawie wartości MIC (ang. minimal
Na rycinach 1 i 2 przedstawiono rozkład stref zahamowania
inhibitory concentration – najmniejsze stężenie hamujące),
wzrostu (mm) i rozkład wartości MIC (mg/L) ertapenemu
pomimo tego, cztery laboratoria wykonały oznaczenie meuzyskane przez laboratoria uczestniczące w niniejszej edycji
todą dyfuzyjno-krążkową; ale dwa z nich oznaczyły również
sprawdzianu POLMICRO.
MIC kolistyny.
Szczep PM-223 był oporny na pozostałe leki zawarte w anSzczep Enterobacter cloacae PM-224 nie wytwarzał MBL, jedkiecie; po przeanalizowaniu wyników oznaczeń dla ciprofloknak wytwarzanie MBL wykryło osiem laboratoriów, w tym
sacyny, gentamicyny i trimetoprimu z sulfametoksazolem
jedno laboratorium, które popełniło wcześniej błąd w wystwierdzono 99,8-100% prawidłowych odpowiedzi.
krywaniu mechanizmie ESBL. Laboratoriom tym zostały przyWartości MIC imipenemu i meropenemu mieściły się w kateznane oceny negatywne.
gorii oporny – MIC >32 mg/L. Dwanaście laboratoriów (2,7%)
Szczep E. cloacae PM-224 nie wytwarzał także karbapenemapopełniło błąd przy oznaczaniu wrażliwości na imipenem,
zy KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase); czterdzieści
określając szczep jako średniowrażliwy – „mały błąd”. Jedno
jeden laboratoriów udzieliło właśnie takiej odpowiedzi. Jedlaboratorium określiło szczep jako wrażliwy na meropenem,
nak 406 laboratoriów uznało szczep E. cloacae za podejrzany
co jest uznawane za „bardzo duży błąd” – najpoważniejszy
o wytwarzanie KPC. Z uwagi na fakt, że w przypadku szczepu
z klinicznego punktu widzenia.
wykazującego derepresję AmpC, fenotypowy test na obecOmawiany szczep nie wytwarzał MBL (metalo-β-laktamaz).
ność KPC daje wynik fałszywie pozytywny, odpowiedź taka
Czterysta trzydzieści dwa laboratoria (96,6%) udzieliły prawiuznana była za prawidłową.
dłowej odpowiedzi – „Szczep nie wytwarza MBL”. Piętnaście
Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2014 uzylaboratoriów 3,4% miało trudności w interpretacji testów
skało 418 (92,2%) laboratoriów.
wykrywania mechanizmu MBL, laboratoria te wybrały nie126
Diagn Lab 2015; 51(2): 123-130
2. Przekazane Laboratoriom w ramach III tury edycji ogólnej
POLMICRO 2014 – szczepy Enterococcus PM-225 i PM-226
były wrażliwe na glikopeptydy, oporne na linezolid i wykazywały oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy (HLAR).
Wszystkie laboratoria poprawnie określiły wrażliwość szczepów na wankomycynę, natomiast tylko jedno laboratorium
błędnie oznaczyło wrażliwość szczepów na teikoplaninę
(jako oporne). Blisko 100% laboratoriów prawidłowo wykryło
oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy – HLAR obu
szczepów E. faecalis PM-225 i E. faecium PM-226 (n=450).
Oporność na linezolid szczepów E. faecalis PM-225 i E. faecium
PM-226 określiło ponad 98% laboratoriów.
Pojedyncze duże i małe błędy odnotowano w oznaczaniu
wrażliwości szczepów na ampicylinę.
Pozytywny wynik III tury sprawdzianu POLMICRO 2014 uzyskało 440 (97,3%) laboratoriów.
Pozytywny wynik IV tury sprawdzianu POLMICRO 2014 uzyskało 408 (92,3%).
Stosowane metody oznaczania lekowrażliwości
W codziennej pracy laboratoria wykorzystują różne metody oznaczania wrażliwości na leki w zależności od potrzeb diagnostycznych.
1. Spośród 452 laboratoriów uczestniczących w I turze sprawdzianu tylko siedemdziesiąt pięć podmiotów (16,6%) wskazało, że jedyną stosowaną metodą oznaczania lekowrażliwości była metoda dyfuzyjno-krążkowa. Sto czterdzieści trzy
laboratoria (31,6%) dodatkowo stosowały metodę pasków
gradientowych, a sto dwadzieścia sześć laboratoriów (27,8%)
wspomagało się ponadto metodą automatyczną.
2. Podczas IV tury sprawdzianu metodę dyfuzyjno-krążkową
stosowało 437 laboratoriów spośród 442 (98,9%), paski z gradientem stężeń antybiotyku – 400 laboratoriów (90,5%), metody automatyczne – 181 laboratoriów (40,9%).
3. Różnice w testach wrażliwości szczepów wymagających,
w ramach IV tury POLMICRO 2014, dotyczyły wartości MIC
(mg/L), czy też wielkości stref zahamowania wzrostu (mm)
w metodzie Kirby-Bauer, nie dotyczyły natomiast kategorii
wrażliwości. Odsetek prawidłowych wyników oznaczania
wrażliwości na leki badanych izolatów wyniósł ponad 98%,
odnotowano tylko pojedyncze błędy.
Trzy laboratoria oznaczyły wrażliwość szczepów S. pneumoniae PM-229 i PM 230 na antybiotyki β-laktamowe (penicylina, cefotaksym i ceftriakson) tylko i wyłącznie metodą dyfuzyjno-krążkową, co zgodnie z wytycznymi EUCAST
(wersja 4.0) jest niedopuszczalne. Laboratoria te otrzymały
ocenę negatywną.
WYNIKI – POLMICRO 2014/SSE
Wszystkie laboratoria otrzymały zestawy zawierające dwa szczepy
izolowane z zakażeń przewodu pokarmowego wymienione w Tabeli 1. Zadaniem ośrodków była identyfikacja (I tura) lub identyfikacja i oznaczenie lekowrażliwości (II tura) szczepów na poziomie
zadeklarowanym przez każde z laboratoriów.
Zakres identyfikacji (poziom identyfikacji) rodzaju Salmonella
deklarowany przez laboratoria:
–– pięćdziesięciu dziewięciu uczestników (51,3%) zadeklarowało
identyfikację szczepów Salmonella do serowaru,
–– czterdziestu jeden (35,6%) do grupy serologicznej,
–– piętnastu (13,1%) do rodzaju.
Poprawność identyfikacji oceniano zgodnie z zakresem podanym
przez każdego z uczestników programu POLMICRO/SSE, natomiast, w sytuacji rozszerzenia zakresu, ocenie podlegała wskazana w ankiecie odpowiedź. W poszczególnych turach POLMICRO
2014/SSE uczestniczyły laboratoria stacji sanitarno-epidemiologicznych (WSSE wraz z Oddziałami, PSSE), laboratoria mikrobiologiczne spoza PIS (laboratoria szpitalne, Wojskowe Ośrodki
Medycyny Prewencyjnej) oraz laboratorium weterynaryjne. Liczby
laboratoriów uczestniczące w obu turach zostały przedstawione
Znaczne różnice wielkości stref zahamowania wzrostu (mm)
w metodzie dyfuzyjno-krążkowej między poszczególnymi
laboratoriami odnotowano dla szczepów H. influenzae
PM-232 i PM 232. Różnice te nie miały jednak wpływu na
interpretację kategorii wrażliwości tych szczepów. Z przeprowadzonych przez Centralny Ośrodek badań przedstawionych
w Tabeli 3. wynika, że rozbieżności te najprawdopodobniej
wynikały ze stosowania przez laboratoria podłoży antybiogramowych różnych producentów.
Tabela 3. Oznaczenie lekowrażliwości szczepów H.influenzae PM-231 i PM-232 metodą dyfuzyjno-krążkową z wykorzystaniem podłoży antybiogramowych różnych
producentów (1,2,3,4) – inokulacja wszystkich płytek tą samą zawiesiną o gęstości 0,5 McFarlanda; inkubacja – warunki 5% CO2, 35±1°C, 18±2 godz.
szczep
H. influenzae
PM–231
H. influenzae
PM–232
Mueller-Hinton agar
+5% krwi końskiej +20mg/L β-NAD
Cefotaksym (5 µg)
Ceftriakson (30 µg)
Ciprofloksacyna (5 µg)
Trimetoprim
/sulfametoksazol (25 µg)
Cefotaksym (5 µg)
Ceftriakson (30 µg)
Ciprofloksacyna (5 µg)
Trimetoprim
/sulfametoksazol (25 µg)
27
32
30
S
S
S
33
37
39
S
S
S
25
27
37
R
R
S
32
29
32
S
R
S
Różnica stref
[mm]
8
10
9
31
S
37
S
22
I
27
S
15
27
33
33
S
S
S
27
30
32
S
S
S
24
30
35
R
S
S
30
32
37
S
S
S
6
3
5
39
S
34
S
30
S
32
S
9
Producent nr 1
Producent nr 2
Producent nr 3
Producent nr 4
S (susceptible) – wrażliwy, I (intermediate) – średniowrażliwy, R (resistant)-oporny
127
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
Rycina 3. Rozkład wartości MIC (mg/L) ertapenemu dla E. cloacae PM-224
na Rycinie 1. Sto osiem (93,9%) laboratoriów, biorących udział
w sprawdzianie POLMICRO/SSE w 2014 roku, posiadało akredytację Polskiego Centrum Akredytacji na zgodność z normą PN-EN
ISO/IEC 17025:2005.
Identyfikacja drobnoustrojów
1. W ramach I tury sprawdzianu POLMICRO 2014/SSE laboratoria otrzymały następujące izolaty:
a. szczep Salmonella Eko PM-221, należący do grupy O:4 (B),
antygen somatyczny O – 4,12; antygen rzęskowy H – I faza –
e,h; II faza – 1,6.
–– Szczep prawidłowo zidentyfikowało sto trzynaście laboratoriów (98,3%).
–– Dziewięć ośrodków (7,8%) rozszerzyło deklarowany zakres
identyfikując badany szczep do poziomu serowaru, a jedno
określając grupę serologiczną.
–– Trzy laboratoria (2,6%) wykonały oznaczenie w zakresie węższym niż deklarowany – podały identyfikację wyłącznie do
grupy zamiast do serowaru.
–– Dwa laboratoria (1,7%) błędnie zidentyfikowały szczep jako
Salmonella Typhimurium i jako Salmonella Enteritidis.
b. szczep Salmonella Hillingdon PM-222 należący do grupy
O:9,46 (D2), antygen somatyczny O – 9,46; antygen rzęskowy
H – I faza – g,m;
–– Salmonella Hillingdon został prawidłowo zidentyfikowany
przez 112 ośrodków (97,4%).
–– Siedemdziesiąt osiem laboratoriów (67,8%) określiło typ serologiczny szczepu, w tym trzynaście (11,3%) rozszerzyło
deklarowany zakres identyfikacji.
–– Trzy laboratoria (2,6%) błędnie zidentyfikowały szczep jako
Salmonella Typhimurium (jedno laboratorium) i jako Salmonella Enteritidis (dwa ośrodki).
Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 2014/SSE uzyskało 110 laboratoriów (96%).
128
2. W ramach II tury sprawdzianu POLMICRO 2014/
SSE wszystkie laboratoria
otrzymały:
a. szczep Salmonella Muenchen PM-227, należący
do grupy O:8 (C2-C3), antygen somatyczny O – 6, 8;
antygen rzęskowy H – I faza
d; II faza 1, 2; inne [z67]
–– Szczep prawidłowo zidentyfikowało sto dwanaście laboratoriów (97,4%).
–– Trzy ośrodki podały niepoprawną identyfikację
szczepu. Pierwszy określił
badany izolat jako Salmonella Duesseldorf, drugi jako
Salmonella Albany, a trzeci
scharakteryzował szczep jako Salmonella grupy O:7 (C1).
–– Dwa laboratoria podały identyfikację w zakresie węższym
niż deklarowany – podały identyfikację wyłącznie do grupy
zamiast do serowaru.
–– Pięć ośrodków rozszerzyło deklarowany zakres identyfikując szczep do poziomu serowaru, a dwa określając grupę
serologiczną.
b. szczep Salmonella Thompson PM-228 należący do grupy
O:7 (C1), antygen somatyczny O – 6, 7, 14; antygen rzęskowy
H – I faza k; II faza 1, 5; inne [R1...].
–– Szczep został prawidłowo zidentyfikowany przez 108 ośrodków (93,9%).
–– Siedem laboratoriów błędnie zidentyfikowało izolat jako
Salmonella Isangi (n=6) lub jako Salmonella Tennessee (n=1).
–– Szesnaście laboratoriów (13,9%) wykonało identyfikację w zakresie węższym niż deklarowany– identyfikacja wyłącznie
do grupy.
–– Trzy laboratoria rozszerzyły deklarowany zakres identyfikacji
(dwa laboratoria określając serowar szczepu, a jedno laboratorium identyfikując izolat do grupy).
–– Kilkanaście laboratoriów (n=15) zgłaszało problem z identyfikacją szczepu do typu serologicznego związane z trudnością
zahamowania II fazy rzęskowej. Błędy związane z identyfikacją szczepu do serowaru wynikały najprawdopodobniej
z nieprawidłowego oznaczenia I fazy rzęskowej. Salmonella
Thompson i Isangi należą do grupy O:7 (C1), antygen somatyczny O – 6, 7, 14. Salmonella Thompson posiada antygen
rzęskowy w I fazie – k, natomiast Salmonella Isangi antygen
rzęskowy w I fazie – d; oba szczepy mają w II fazie rzęskowej
antygen 1, 5.
Lekowrażliwość (w ramach II tury POLMICRO 2014/SSE)
Niewielka grupa laboratoriów (n=20) przeprowadziła badanie
lekowrażliwości przesłanych izolatów Salmonella zgodnie z dekla-
Diagn Lab 2015; 51(2): 123-130
rowanym zakresem badań.
Wszyscy uczestnicy prawidłowo oznaczyli wrażliwość szczepu Salmonella
Muenchen oraz Salmonella
Thompson na ampicylinę
oraz amoksycylinę z kwasem klawulanowym (wrażliwy n=16, średniowrażliwy
n=4). Poprawnie została
oznaczona także wrażliwość
na cefotaksym, ceftazydym,
ceftriakson, trimetoprim/
sulfametoksazol. Siedemnaście z dwudziestu laboratoRycina 4. Wrażliwości szczepu S. pneumoniae PM-229 na cefalosporyny III generacji
riów (70%) wykonało badania przesiewowe w kierunku
8468 do kontroli jakości krążków oraz H. influenzae ATCC 49766
oporności na fluorochinolony szczepów z rodzaju Salmonella spp.
do kontroli oznaczania wartości MIC. Stosowanie szczepu NCTC
z zastosowaniem krążka z pefloksacyną (5 µg). Oba szczepy były
8468 zadeklarowało dwieście siedem laboratoriów, natomiast
wrażliwe na tę grupę leków. Jedenaście laboratoriów (55%) wnioskowało o wrażliwości szczepów na ciprofloksacynę na podstawie
oznaczenia strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z ciprofloksacyną 5 µg. Według najnowszych wytycznych – EUCAST wersja
4.0 z 01.01.2014 badania przesiewowe w kierunku oporności na
fluorochinolony szczepów z rodzaju Salmonella spp. należy przeprowadzać z zastosowaniem krążka z pefloksacyną (5 µg).
Pozytywny wynik II tury sprawdzianu POLMICRO 2014/SSE uzyskało 99 laboratoriów (86,1%).
WEWNĘTRZNA KONTROLA TESTÓW LEKOWRAŻLIWOŚCI
Zgodnie z wytycznymi EUCAST do oceny jakości krążków antybiogramowych i pasków z gradientem stężeń pozwalających ocenić lekowrażliwość szczepów Acinetobacter spp. należy stosować
szczep Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 – ok 80 % (n=365)
laboratoriów zadeklarowało stosowanie tego szczepu. Natomiast
do kontroli jakości (QC, ang. quality control) oznaczeń szczepów
z rodziny Enterobacteriaceae – szczep Escherichia coli ATCC 25922,
który zastosowało 95,6 % (n=433) uczestników.
Pozostałe laboratoria biorące udział w I turze POLMICRO 2014 do
QC pałeczek Gram-ujemnych zastosowały inne szczepy wzorcowe
np.: Staphylococcus aureus ATCC 29213 – cztery laboratoria; S. aureus ATCC 25923 – cztery laboratoria; Enterococcus faecalis ATCC
29212 – jedno laboratorium.
QC lekowrażliwości enterokoków (bez względu na stosowaną metodę oznaczenia lekowrażliwości), należało przeprowadzić z wykorzystaniem szczepu Enterococcus faecalis ATCC 29212. Szczep
ten był wykorzystany w QC przez 93,8% laboratoriów (n=424).
Szczep Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 stosowany, zgodnie
z wytycznymi EUCAST, do QC testów lekowrażliwości pneumokoków, użyło czterysta osiemnaście laboratoriów (94,6%).
We wrześniu 2014 roku pojawiły się zmienione wytyczne EUCAST
odnośnie kontroli jakości – wersja 4.0 obowiązująca od 05.09.2014.
Zgodnie z nimi, do kontroli jakości oznaczeń izolatów z rodzaju
Haemophilus należało zastosować szczepy: H. influenzae NCTC
szczepu ATCC 49766 – trzydzieści trzy laboratoria.
Dyskusja i podsumowanie
Ogólnopolski Zewnątrzlaboratoryjny Sprawdzian Wiarygodności
Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej – Program POLMICRO
pełni przede wszystkim rolę edukacyjną. Założeniem organizatora Sprawdzianu jest promowanie aktualnych standardów diagnostyki mikrobiologicznej i ujednolicanie metod badawczych
w polskich laboratoriach medycznych. Jak co roku, główny nacisk
położono na identyfikację drobnoustrojów oraz prawidłowe oznaczanie fenotypów wrażliwości na antybiotyki badanych izolatów
bakteryjnych z uwzględnieniem wytwarzanych przez nie mechanizmów oporności. Biegłość laboratorium w oznaczaniu fenotypów
wrażliwości patogenów umożliwia podejmowanie odpowiednich
decyzji terapeutycznych i działań związanych z kontrolą zakażeń.
Kluczowym elementem diagnostyki mikrobiologicznej jest właściwa identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia. Laboratoria
wykorzystują obecnie szereg różnych metod identyfikacji, od
klasycznych, po spektrometrię masową. Kompetentne laboratorium potrafi odpowiednio stosować nowe techniki diagnostyczne
i właściwie interpretować uzyskiwane wyniki. Dlatego też Laboratoria, które w przedstawionych sprawdzianach posługiwały
się „starymi” nazwami drobnoustrojów, powinny samodzielnie
zidentyfikować przyczynę tej sytuacji. Być może przyczyna leży po
stronie systemu identyfikacyjnego stosowanego w laboratorium.
Nie stanowi to jednak usprawiedliwienia, gdyż ostateczną decyzję
o treści wyniku podejmuje mikrobiolog.
Wśród bakterii Gram-dodatnich wytwarzających mechanizmy
oporności szczególnie niebezpieczne są szczepy Staphylococcus
aureus oporne na meticylinę, wankomycynę czy linezolid, gatunki
z rodzaju Enterococcus oporne na wankomycynę, teikoplaninę,
aminoglikozydy i linezolid oraz izolaty Streptococcus pneumoniae oporne na penicylinę, makrolidy i cefalosporyny III generacji. Istotne epidemiologicznie jest także wykrywanie szczepów
pałeczek Gram-ujemnych, zarówno jelitowych z rodziny Entero129
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
bacteriaceae, jak i pałeczek niefermentujących, wytwarzających
enzymy nabyte takie jak: β-laktamazy o rozszerzonym spektrum
substratowym (ESBL) i karbapenemazy. W ramach Sprawdzianów
POLMICRO 2014 ocenie podlegały więc znane laboratoriom już
od lat bakteryjne mechanizmy oporności, takie jak HLAR, ESBL,
ale także stosunkowo nowe: MBL i KPC. Trudność diagnostyczna Gram-ujemnych pałeczek opornych na karbapenemy może
wynikać z różnorodnych podstaw takiej oporności: wytwarzania
β-laktamaz hydrolizujących karbapenemy, tzw. karbapenemaz
(klasy A, B i D), zmniejszenia przepuszczalności osłon komórkowych i ograniczania transportu leku do komórki. Wiele laboratoriów mikrobiologicznych w procesie diagnostyki wykorzystywało
systemy automatyczne do identyfikacji i lekowrażliwości drobnoustrojów. Wzrosła też liczba laboratoriów określających wartości
MIC z użyciem pasków z gradientem stężeń antybiotyku. Uwagę
zwrócił również fakt coraz częstszego wprowadzania do rutynowej
diagnostyki nowoczesnych i szybkich metod diagnostycznych.
Jednak to mikrobiolog ostatecznie interpretuje wyniki lekowrażliwości uzyskane różnymi metodami oraz decyduje o formie
wyniku przekazywanego lekarzowi.
Nieodłącznym elementem wiarygodnej diagnostyki mikrobiologicznej jest wewnętrzna i zewnętrzna kontrola jakości. Uzyskane
wyniki porównań międzylaboratoryjnych wykazały pewne niedoskonałości procedur wewnętrznej kontroli jakości u niektórych
uczestników Programu POLMICRO. Nieprawidłowości te muszą
być przeanalizowane i zweryfikowane przez laboratoria, co zostało
opisane przy poszczególnych turach sprawdzianu. Stosowanie
w kontroli jakości antybiogramów szczepów innych gatunków niż
rekomendowane przez EUCAST jest nieprawidłowe, może zagrażać wiarygodności oznaczeń i wymaga pilnego przeanalizowania
procedur laboratoryjnych.
Procent prawidłowych wyników uzyskiwanych przez laboratoria
w kolejnych turach Programu POLMICRO w roku 2014 był wysoki
i wyniósł blisko 93%. Przedstawione na Rycinie 1 różnice w liczbie
laboratoriów biorących udział w poszczególnych turach sprawdzianu wynikały z sytuacji na rynku diagnostycznym, tj. likwidacji
laboratoriów, czy też przejmowaniem laboratoriów szpitalnych
przez zewnętrzne firmy diagnostyczne.
Ogółem w roku 2014 świadectwa uczestnictwa i uzyskania bardzo
dobrych wyników Ogólnopolskiego Zewnątrzlaboratoryjnego
Sprawdzianu Wiarygodności Badań w Diagnostyce Mikrobiologicznej otrzymały 454 laboratoria spośród 577 (78,7%): 356 podmiotów w edycji ogólnej (spośród 460; 77,4%) i 98 z 117 w edycji
w zakresie schorzeń jelitowych (83,8%).
Piśmiennictwo:
1.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty – Fourth Informational Supplement, CLSI
document M100-S24,Wayne PA, 2014.
2.
Eksperckie zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów – zalecenia EUCAST, wersja 2.0, Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr
hab. n. med. Walerii Hryniewicz – www.korld.edu.pl
3.
Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing
Methods, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 2000, 54,
3; Supp. TR33
130
4.
Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST), Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń hamujących (MIC) oraz wielkości
stref zahamowania wzrostu; wersja 4.0, 2014; Polskie tłumaczenie pod red. prof.
dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz – www.korld.edu.pl
5.
Grimont Patrick A.D., Weill Francois-Xavier; „Antigenic formulae of the Salmonella
serovars”, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella,
2007, 9th edition.
6.
Młodzińska Ewa, Bosacka K., Stefaniuk E., Fortuna M., Hryniewicz W. Bezpośredni
preparat mikroskopowy – kontrola jakości pierwszego etapu diagnostyki mikrobiologicznej. Diagn. Lab. 2014; 50(4): 299-306.
7.
Rekomendacje European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
EUCAST, Version 4.0, 2014 – www.eucast.org
Adres do korespondencji:
dr n. med. Elżbieta Stefaniuk
Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej
01-793 Warszawa, ul. Rydygiera 8
tel/fax: +48 22 8415834
e-mail: [email protected], [email protected]
Zaakceptowano do druku: 30.06.2015