ODDZIAŁYWANIE BENZOESANU SODU NA WYBRANE PROCESY

Proceedings of ECOpole
Vol. 1, No. 1/2
2007
Agata ŚWIĘCIŁO1
ODDZIAŁYWANIE BENZOESANU SODU NA WYBRANE
PROCESY FIZJOLOGICZNE W KIEŁKUJĄCYCH NASIONACH
RZODKIEWKI Raphanus sativus L.
INFLUENCE OF SODIUM BENZOATE ON SOME PHYSIOLOGICAL
PROCESSES TAKING PLACE IN GERMINATING SEEDS OF RADISH
Raphanus sativus L.
Streszczenie: Zbadano wpływ benzoesanu sodu na proces kiełkowania nasion rzodkiewki Raphanus sativus L.
Uzyskane wyniki sugerują, że benzoesan sodu w stężeniach mniejszych niż 0,03 mol · dm–3 obniżał energię,
a w mniejszym stopniu zdolność kiełkowania nasion rzodkiewki. Nie modyfikował jednak dynamiki wzrostu
siewek i nie indukował cech patomorfologicznych. Natomiast zastosowany w stężeniach większych niż
0,03 mol · dm–3 całkowicie hamował proces kiełkowania nasion. Zarodki tych nasion były żywe, ale
charakteryzowały się małą aktywnością katalazy w porównaniu do nasion skiełkowanych.
Słowa kluczowe: benzoesan sodu, kiełkowanie, rzodkiewka Raphanus sativus, katalaza
Kwas benzoesowy oraz jego sole sodowe i potasowe, produkowane na skalę
przemysłową, znalazły zastosowanie głównie jako konserwanty w przemyśle spożywczym,
farmaceutycznym i kosmetycznym. Substancje te występują także w stanie naturalnym
w niektórych owocach jagodowych oraz są intermediatami szlaków metabolicznych. Ze
względu na ich powszechne wykorzystanie przyczyniają się one do chemizacji środowiska
życia człowieka.
W prezentowanej pracy badano oddziaływanie benzoesanu sodu na wybrane parametry
procesu kiełkowania nasion rzodkiewki Raphanus sativus L. Rzodkiewka była często
wykorzystywanym organizmem w badaniach nad mechanizmami allelopatii [1, 2] oraz
odpowiedzi na ksenobiotyki, takie jak metale ciężkie [3-6], długołańcuchowe alkohole
alifatyczne [7] czy zmiany natężenia pola magnetycznego [8].
Kiełki i młode siewki charakteryzują się większą wrażliwością na czynniki
środowiskowe niż dojrzały organizm rośliny, z tego względu proces kiełkowania
i wydłużania korzeni jest wykorzystywany jako krótkoterminowy test w badaniach
ekotoksykologicznych (American Society for Testing and Materials, 1991).
Materiały i metody
W badaniach wykorzystano nasiona rzodkiewki Raphanus sativus L., odmiany Rowa
z Przedsiębiorstwa Nasiennictwa Ogrodniczego i Szkółkarstwa Ożarów Mazowiecki.
Nasiona rzodkiewki wysiano po 50 sztuk na szalki Petriego, wyłożone krążkiem bibuły
filtracyjnej. Podłoże do kiełkowania nasion stanowiły wodne roztwory benzoesanu sodu
o stężeniu: 0; 0,002; 0,005; 0,008; 0,01; 0,03; 0,05 mol · dm–3. Wartości pH tych roztworów
wahały się od 7,2 do 7,6. Szalki z nasionami inkubowano w ciemności w cieplarce
w temperaturze 25ºC.
1
Katedra Biochemii i Chemii Środowiskowej, Wydział Nauk Rolniczych w Zamościu, Akademia Rolnicza
w Lublinie, ul. Szczebrzeska 102, 22-400 Zamość, tel. 084 677 27 00, e-mail: [email protected]
254
Agata Święciło
Po 48, 96 i 144 godzinach od wysiewu policzono liczbę wykiełkowanych nasion. Za
kryterium kiełkowania przyjęto ukazanie się korzenia zarodkowego o długości większej niż
2 mm [13]. Według przepisów ISTA procent wykiełkowanych nasion rzodkiewki po
4 dobach (96 godzinach) od ich wysiewu określa energię kiełkowania. Procent
wykiełkowanych nasion rzodkiewki po 6 dobach (144 godzinach) od ich wysiewu określa
ich zdolność kiełkowania.
Żywotności nasion rzodkiewki inkubowanych z benzoesanem sodu oznaczono za
pomocą barwienia chlorowodorkiem 2,3,5 trójfenylotetrazoliny [9].
Do badań biochemicznych sporządzono ekstrakty zawierające białka rozpuszczalne
według procedury zamieszczonej w pracy Libik i współpr. [10]. Ekstrakty wykonano
z różnych faz rozwojowych siewek uzyskanych po 48- i 96-godzinnej inkubacji
w obecności wybranych stężeń benzoesanu sodu. Białko w ekstraktach oznaczono metodą
Lowry i współpr. [11]. Aktywność katalazy oznaczono za pomocą metody
spektrofotometrycznej [12].
Wyniki przedstawione w pracy są średnią z co najmniej trzech niezależnie
przeprowadzonych doświadczeń. Ilościowa analiza statystyczna wyników polegała na
wyliczeniu przedziałów ufności dla średniej długości siewek na poziomie istotności
α = 0,05. Przedziały ufności podano w tabelach po znaku ±.
Wyniki
W pierwszym etapie badań oznaczono wpływ benzoesanu sodu na dynamikę procesu
kiełkowania.
Tabela 1
Wpływ benzoesanu sodu na dynamikę kiełkowania nasion rzodkiewki Raphanus sativus L.
Stężenia
benzoesanu sodu
[mol · dm–3]
0
0,002
0,005
0,008
0,01
0,03
0,05
0,08
%
wykiełkowanych
nasion po 48 h od
wysiewu
92,0
90,2
87,0
81,5
85.3
4,0
0
0
%
wykiełkowanych
nasion po 96 h od
wysiewu
93,6
93,3
92,6
92,3
90,0
10, 0
2,0
0
%
wykiełkowanych nasion
po 144 h od wysiewu
94,2
94,5
94,0
92,2
93,0
10,0
2,0
0
Benzoesan sodu w zastosowanych stężeniach obniża procent wykiełkowanych nasion
tylko w pierwszym terminie (po 48 godzinach od wysiewu nasion). W drugim terminie,
który określa energię kiełkowania nasion, oraz w trzecim terminie, oznaczającym zdolność
kiełkowania nasion, tylko stężenia benzoesanu sodu większe niż 0,01 mol · dm–3
w wyraźny sposób zmniejszały procent wykiełkowanych nasion. W przypadku benzoesanu
sodu o stężeniu 0,03 i 0,05 mol· dm–3 zaobserwowano tylko pojedyncze epizody przebicia
okrywy nasiennej przez korzeń zarodkowy, ale nie wiązało się to z dalszym rozwojem
kiełka.
W kolejnym etapie badano wpływ benzoesanu sodu na długość siewek rzodkiewki
wyrosłych w obecności wybranych stężeń benzoesanu sodu. Długość siewek oznaczono
255
Oddziaływanie benzoesanu sodu na wybrane procesy fizjologiczne w kiełkujących nasionach …
jako łączną długość korzeni i łodyg zarodkowych. W tabeli nie uwzględniono długości
kiełków.
Tabela 2
Wpływ benzoesanu sodu na długość siewek rzodkiewki
Stężenia benzoesanu
sodu [mol · dm–3]
po 48 h kiełkowania
Średnia długość siewek [cm]
po 96 h kiełkowania
po 144 h kiełkowania
0
0,002
0,005
0,008
0,01
0,03
0,05
0,08
1,57 (±0,12)
1,21(±0,08)
1,02 (±0,11)
0,5 (±0,32)
0,5 (±0,04)
0
0
0
4,5 (±0,20)
4,2 (±0,13)
3,8 (±0,05)
3,4 (±0,09)
2,8 (±0,08)
0
0
0
5,5 (±0,32)
5,4 ((±0,16)
5,1 (±0,14)
4,2 (±0,12)
3,5 (±0,07)
0
0
0
Siewki, które rozwijały się w obecności benzoesanu sodu o stężeniu mniejszym niż
0,03 mol · dm–3 charakteryzowały się mniejszą średnią długością niż siewki pochodzące
z prób kontrolnych. W przypadku benzoesanu sodu o stężeniu równym bądź większym niż
0,03 mol · dm–3 w badanych terminach nie zaobserwowano przekształcenia kiełka
w siewkę. Pomimo różnic dotyczących średniej długości siewek dynamika ich wydłużania
była podobna, co sugeruje, że benzoesan sodu w małych dawkach ma niewielkie znaczenie
w mechanizmach kontrolujących procesy wzrostu siewki. Siewki, które wyrosły w podłożu
zawierającym benzoesan sodu, charakteryzowały się prawidłową budową morfologiczną.
Wyniki wcześniejszych doświadczeń (tabele 1 i 2) wskazują, że benzoesan sodu
o stężeniu większym niż 0,03 mol · dm–3 hamuje proces kiełkowania prawie całej populacji
wysianych nasion. Zbadano zatem żywotność zarodków tych nasion metodą tetrazolinową.
Nasiona kontrolne poddane 2-godzinnemu pęcznieniu w wodzie destylowanej oraz nasiona
pochodzące z próby zawierającej benzoesan sodu o stężeniu 0,08 mol · dm–3 w wyniku
barwienia tetrazoliną zabarwiły się na kolor czerwony, co wskazuje na to, że są one
aktywne metabolicznie. Uzyskane wyniki sugerują, że benzoesan sodu nawet
w największym badanym stężeniu nie jest toksyczny dla zarodków nasion rzodkiewki.
Procesowi kiełkowania towarzyszy zjawisko wydzielania przez rozwijający się
zarodek i łupinę nasienną reaktywnych form tlenu (RFT) [13], w tym nadtlenku wodoru.
Zbadano zatem aktywność komórkowego systemu antyoksydacyjnego poprzez pomiar
aktywności katalazy, enzymu usuwającego nadtlenek wodoru.
Aktywność katalazy oznaczono spektrofotometrycznie w ekstraktach sporządzonych
z różnych faz rozwojowych roślin uzyskanych po inkubacji z benzoesanem sodu. Uzyskane
wartości wyrażono w procentach. Za 100% przyjęto aktywność katalazy uzyskaną dla
próbki kontrolnej.
Tabela 3
Aktywność katalazy [%] w ekstraktach z materiału roślinnego po inkubacji z benzoesanem sodu
Czas
kiełkowania
[h]
96
144
Stężenie benzoesanu sodu [mol · dm–3]
0
0,002
0,005
0,008
0,01
0,03
0,05
0,08
100
100
106,3
95,3
95,5
106,1
82,4
92,3
85,5
89,3
14,3
16,5
16,7
18,6
13,3
15,7
256
Agata Święciło
Relatywnie dużą aktywność katalazy zanotowano w próbkach uzyskanych z siewek
inkubowanych w roztworze benzoesanu sodu o stężeniu mniejszym od 0,01 mol · dm–3.
Wraz ze wzrostem stężenia benzoesanu sodu w środowisku obserwowano spadek
aktywności katalazy. Najmniejszą aktywność katalazy zanotowano dla próbek pozyskanych
z nasion, które nie były zdolne do kiełkowania.
Obserwowany wzrost aktywności katalazy w ekstraktach z kiełków i młodych siewek
może stanowić odpowiedź organizmu na obecność w środowisku potencjalnie
niebezpiecznej, bo łatwo przenikającej przez błony biologiczne, molekuły, jaką jest
nadtlenek wodoru.
Wnioski
1.
2.
Benzoesan sodu zastosowany w stężeniach mniejszych niż 0,03 mol · dm–3 obniża
energię i zdolność kiełkowania nasion. Siewki uzyskane z tych nasion były mniejsze
niż siewki kontrolne, ale bez cech patomorfologicznych. Charakteryzowały się one
dużą aktywnością katalazy.
Benzoesan sodu zastosowany w stężeniach większych niż 0,03 mol · dm–3 hamuje
proces kiełkowania nasion rzodkiewki, ale nie obniża żywotności zarodków tych
nasion. Ekstrakty z tych nasion charakteryzowały się małą aktywnością katalazy.
Literatura
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Basile A., Sorbo S., López-Sáez J.A. i Castaldo Cobianchi R.: Effects of seven pure flavonoids from mosses
on germination and growth of Tortula muralis HEDW (Bryophyta) and Raphanus sativus L
(Magnoliophyta). Phytochemistry, 2000, 62(7), 1145-1151.
Chiapusio G., Pellissier F. i Gallet C.: Uptake and translocation of phytochemical 2-benzoxazolinone (BOA)
in radish seeds and seedlings. J. Exp. Bot., 2004, 55(402), 1587-1592.
Chen Y.X., He Y.F., Luo Y.M., Yu Y.L., Lin Q. i Wong M.H.: Physiological mechanism of plant roots
exposed to cadmium. Chemosphere, 2003, 50(6), 789-793.
Nath K., Saini S. i Sharma Y.K.: Chromium in tannery industry effluent and its effect on plant metabolism
and growth. J. Environ. Biol., 2005, 26(2), 197-204.
Wieczorek J., Wieczorek Z. i Olszewski J.: Wrażliwość rzodkiewki (Raphanus sativus L.) i sałaty (Lactuca
sativa L.) na niskie stężenia antracenu podawanego dolistnie. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol., 2004, 496,
527-536.
Zhang K. i Zhou Q.: Toxic Effects of Al-Based Coagulants on Brassica chinensis and Raphanus sativus
growing in acid and neutral conditions. Inc. Environ. Toxicol., 2005, 20, 179-187.
Blamowski Z., Borowski E. i Blamowska M.: Wpływ długołańcuchowych alkoholi alifatycznych na wzrost,
wymianę gazową i rozdział asymilatów w roślinach rzodkiewki. Acta Agrobot., 1998, 54, 5-10.
Yano A., Ohashi Y., Hirasaki T. i Fujiwara K.: Effects of a 60 Hz magnetic field on photosynthetic CO2
uptake and early growth of radish seedlings. Bioelectromagnetics, 2004, 25(8), 572-581.
Uziak Z.: Przewodnik do ćwiczeń z fizjologii roślin. WAR, Lublin 1979.
Libik M., Konieczny R., Pater B., Slesak I. i Miszalski Z.: Differences in the activities of some antioxidant
enzymes and in H2O2 content during rhizogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of the ice
plant. Plant Cell Rep., 2005, 23(12), 834-841.
Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. i Randall R.J.: Protein measurement with the Folin phenol
reagent. Biol. Chem., 1951, 193(1), 265-275.
Beers R.F. i Sizer I.W.: A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by
catalase. J. Biol. Chem., 1952, 195(1), 133-140.
Schopfer P., Plachy C. i Frahry G.: Release of reactive oxygen intermediates (superoxide radicals, hydrogen
peroxide, and hydroxyl radicals) and peroxidase in germinating radish seeds controlled by light, gibberellin,
and abscisic acid. Plant Physiol., 2001, 125(4), 1591-1602.
Oddziaływanie benzoesanu sodu na wybrane procesy fizjologiczne w kiełkujących nasionach …
257
INFLUENCE OF SODIUM BENZOATE ON SOME PHYSIOLOGICAL
PROCESSES TAKING PLACE IN GERMINATING SEEDS OF RADISH
Raphanus sativus L.
Summary: Derivatives of benzoate acid are produced at industrial level and are used as preservatives in food,
pharmaceutical and cosmetic industries. They also occur naturally in some berries and are intermediates of
metabolic trails. In over-physiological doses they have a destructive effect on human body and other living
organisms. The aim of this study was determine the influence of sodium benzoate on germination processes of
radish seeds Raphanus sativus L. The results that were obtained reveal that sodium benzoate in concentration
lower than 0.03 mol · dm–3 decreases energy, and to a smaller extent germination ability of radish seeds. However,
sodium benzoate does not modify growth dynamics of seedlings, nor does it induce pathomorphological features.
In concentration higher than 0.03 mol · dm–3 sodium benzoate totally inhibits seed germination process. Despite
the lack of signs of seed germination in the investigated samples, no decrease in germ vitality in the seeds was
observed. The results suggest that biological tests based on seed germination process can be used to determine
potential toxicity of preservatives.
Keywords: sodium benzoate, seed germination, radish Raphanus sativus, catalase