pobierz

P R A C A
P O G L Ą D O W A
Review Article
Acta Haematologica Polonica
2006, 37, Nr 1 str. 5–24
ANNA EJDUK, MIROSŁAW MAJEWSKI, KRZYSZTOF WARZOCHA
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych
w ostrej białaczce szpikowej
Prognostic significance of genetic aberrations in acute myeloid leukemia
Z Kliniki Hematologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab. med. Krzysztof Warzocha
SŁOWA KLUCZOWE: Ostra białaczka szpikowa — Aberracje chromosomalne — Rokowanie
KEY WORDS:
Acute myeloid leukemia — Chromosomal aberrations — Prognosis
STRESZCZENIE: Badania cytogenetyczne i molekularne genów fuzyjnych są rutynowo
wykonywane u chorych na ostre białaczki. Stwierdzenie aberracji genetycznych oprócz
znaczenia diagnostycznego, wpływa na wybór leczenia i dostarcza ważnych informacji
prognostycznych. Szczególne znaczenie badań genetycznych znalazło odzwierciedlenie w nowej
klasyfikacji ostrej białaczki szpikowej (OBS) wg. WHO i wyodrębnieniu trzech grup ryzyka
cytogenetycznego: niskiego [z t(8;21) i genem fuzyjnym AML1-ETO, inv(16)/t(16;16) i genem
CBFB-MYH11, t(15;17) i genem PML-RARa], pośredniego [z prawidłowym kariotypem, +8,
— Y, del(12p)] oraz wysokiego [z abberacjami chromosomów 5 i 7, t(3;3), t(6;9), t(9;22),
złożonym kariotypem]. Stratyfikacja chorych do grup ryzyka cytogenetycznego jest jednym z
najważniejszych czynników wpływających na wybór leczenia. W grupie pośredniego i
wysokiego ryzyka, wykonanie allotransplantacji rozważa się już w momencie uzyskania
pierwszej całkowitej remisji (CR) choroby, u chorych niskiego ryzyka takie postępowanie
uzasadnione jest w przypadku uzyskania drugiej CR. Obecność t(15;17) i genu PML-RARa jest
wskazaniem do zastosowania w indukcji kwasu trans-retinowego, chorzy z t(8;21) i inv(16)
odnoszą korzyść z podania kilku kursów leczenia dużymi dawkami AraC w trakcie konsolidacji. Diagnostyka cytogenetyczna (kariotyp, FISH) i molekularna (RT-PCR) stosowane
jako metody komplementarne, pozwalają na lepszą stratyfikację chorych do grup ryzyka.
Ostatnie publikacje wskazują na rolę nowych abberacji genetycznych [FLT3, mutacje genu
NPM (nucleophosmin)] w prognozowaniu przebiegu klinicznego u chorych w grupie pośredniego ryzyka cytogenetycznego. Wykrycie rearanżacji genów w chwili rozpoznania, pozwala
ponadto monitorować chorobę resztkową (MRD) metodą real time PCR i gniazdowego PCR.
Obecność MRD u chorych z PML-RARa jest zapowiedzią wznowy białaczki, znaczenie
monitorowania MRD w przypadku OBS z obecnością innych genów fuzyjnych jest przedmiotem badań.
Praca została zrealizowana w ramach projektów zamawianych PBZ-KBN-091/P05/2003, PBZ-KBN120/P05/2004
[5]
6 A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
SUMMARY: Cytogenetic and molecular techniques are routinely applied in laboratory
diagnostics of acute leukemia. The detection of genetic aberrations not only assists with
diagnosis and treatment decisions, but also adds important prognostic information. The role of
genetic aberrations is reflected by WHO dassification of acute myloid leukemia (AML) and in
stratiDcation to three cytogenetic risk group: Iow [with t(8;21) and AML1-ETO fusion gene,
inv(16)/t(16;16) with CBFB-MYH11, t(15;17) with PML-RARa], intermediate [normal karyotype, +8, - Y, del(12p)], high [aberrations of chromosomes 5 and 7, t(3;3), t(6;9), t(9;22), complex
karyotype]. The cytogenetic risk group stratification is one of the most important factor
determining the treatment outcome. The patients in intermediate and high risk group should
undergo stem celi transplantation (SCT) in first complete remission (CR). In contrast patients in
Iow cytogenetic risk group should receive SCT in second CR. Induction treatment with transretinoic acid is indicated in AML with PML-RARa fusion gene, while patients with core
binding factor AML benefit from consolidation composed of high dose AraC. The
concomitant use of cytogenetic (karyotype, FISH), and molecular methods has significantly
improved stratification into cytogenetic risk group. Several studies indicate the new genetic
aberrations [FLT3 aberrations, mutation of NPM gene (nucleophosmin)] allowing better
prediction of the treatment outcome in patients in intermediate cytogenetic risk group. Gene
rearrangements associated with leukemia can be used as molecular markers allowing the
detection of minimal residual disease (MRD) using real time PCR method. The role of
molecular monitoring of PML-RARa transcript in patients in CR is already established and
other fusion genes transcripts are evaluated.
WSTĘP
Ostre białaczki szpikowe (OBS) stanowią heterogenną grupę chorób różniących
się morfologią komórek, przebiegiem klinicznym i rokowaniem. W 2001 roku
Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaproponowała nowy podział OBS uwzględniający występowanie zaburzeń cytogenetycznych i odpowiadających im genów
fuzyjnych. Rodzaj aberracji cytogenetycznych i molekularnych bardziej precyzyjnie
określa biologię białaczek oraz stanowi niezależny czynnik prognostyczny, pozwalający zakwalifikować chorych do grup różniących się czasem przeżycia i rokowaniem. Pozwala to na wybór optymalnego sposobu leczenia w zależności od
stopnia ryzyka. Poznanie mechanizmów genetycznych odpowiedzialnych za rozwój
białaczek może pozwolić również na identyfikację potencjalnych celów dla nowej
generacji leków przeciwnowotworowych.
Badanie kariotypu metodą prążkową jest podstawowym badaniem klasycznej
cytogenetyki, które pozwala na ocenę ilości i budowy chromosomów. Cennym
uzupełnieniem kariotypu jest badanie wyznakowanymi barwnikami sondami hybrydyzacyjnymi (FISH — fluorescent in situ hybridization) specyficznymi dla poszczególnych chromosomów lub genów. Metoda fusion FISH pozwala na wykrycie
genów fuzyjnych, split FISH na stwierdzenie monosomii lub delecji fragmentów
chromosomów.
Wykrywanie genów fuzyjnych znajduje zastosowanie do ustalenia typu OBS,
rodzaju leczenia oraz monitorowania choroby resztkowej (minimal residual disease
— MRD). Rozwój nowych, bardziej czułych technik molekularnych (gniazdowy
PCR, RQ-PCR), umożliwił bardziej precyzyjną ocenę skuteczności leczenia.
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
7
Wznowa choroby na poziomie molekularnym, jest w niektórych przypadkach
sygnałem do ponownego włączenia leczenia cytostatycznego. Dobry stan hematologiczny i kliniczny chorych na tym etapie determinują lepsze wyniki leczenia
i mniejsze ryzyko powikłań.
KLASYFIKACJA OBS
Stosowana przez wiele lat klasyfikacja OBS wg. French-American-British (FAB)
dostarczała głównie informacji na temat morfologii komórek. Później została
wzbogacona o badania cytochemiczne, które pozwoliły na bardziej precyzyjne
określenie podtypu białaczki.
Tabela 1. Klasyfikacja ostrych białaczek szpikowych wg WHO
Table 1.
Ostra białaczka szpikowa z określonymi zmianami cytogenetycznymi
Ostra białaczka z ^8:21)^22^22), AML1/ETO
Ostra białaczka z nieprawidłowymi eozynofilami w szpiku inv(16Xpl3q22) lub t(16;16)(pl3;q22)
Ostra białaczka promielocytowa z t(15;17)(q22;ql2X PML/RARa
Ostra białaczka z aberracjami Ilq23; rearażacjami MLL
Ostra białaczka szpikowa z wieloliniową dysplazją
Wtórna do zespołów mielodysplastycznych i mielodysplastyczo/mieloproliferacyjnych
Postać bez poprzedzającego zespołu mielodysplastycznego
Ostra białaczka szpikowa i zespoły mielodysplastyczne wtórne do terapii
Wtórne do leczenia lekami alkilującymi
Wtórne do leczenia inhibitorami topoizomerazy typu II
Wtórne do leczenia innymi lekami
Ostre białaczki szpikowe niesklasyfikowane
Ostra białaczka szpikowa niezróżnicowana
Ostra białaczka szpikowa bez cech dojrzewania
Ostra białaczka szpikowa z cechami dojrzewania
Ostra białaczka mielomonocytowa
Ostra białaczka monoblastyczna i monocytowa
Ostra białaczka erytroblastyczna
Ostra białaczka magakarioblastyczna
Ostra białaczka bazofilowa
Ostra mielofibroza
Mięsak granulocytarny
Klasyfikacja WHO łączy w sobie elementy klasyfikacji FAB, uwzględnia ponadto
badania genetyczne, immunofenotypowe, przebieg kliniczny choroby i dane z wywiadu (Tabela 1). Pozwala w bardziej precyzyjny sposób określić rodzaj białaczki, co
przekłada się na określenie stopnia ryzyka choroby i odpowiednie postępowanie
terapeutyczne. W klasyfikacji tej zostały wyodrębnione 4 główne kategorie. Wyodrębnienie pierwszej kategorii ostrych białaczek zostało oparte na badaniach
8 A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
cytogenetycznych i molekularnych, których wykonywanie zalecane jest u wszystkich
chorych w momencie ustalania rozpoznania. W grupie tej znaleźli się chorzy
z dobrym rokowaniem, u których metodami klasycznej cytogenetyki lub metodami
biologii molekularnej wykazano obecność t(8;21), inv(16) lub t(15;17). Kolejną grupę
w klasyfikacji WHO stanowią chorzy z ostrymi białaczkami z cechami wieloliniowej
dysplazji, wtórnymi do zespołu mielodysplastycznego (MDS) lub mielodysplastyczno/mieloproliferacyjnego, jak również chorzy z OBS z cechami wieloliniowej
dyspazji bez poprzedzającego rozpoznanie ostrej białaczki MDS. Trzecią kategorię
stanowią chorzy, u których OBS rozwinęła się z powodu wcześniej stosowanego
leczenia lekami alkilującymi lub inhibitorami topoizomerazy typu II. W ostatniej
grupie znaleźli się chorzy z OBS nie zaliczaną do powyższych kategorii, u których
w dalszym ciągu stosuje się kryteria morfologiczne wg FAB.
Klonalne zaburzenia chromosomalne są spotykane u 70% pacjentów z OBS
w momencie rozpoznania (1). Dotychczas zostało opisanych około 200 strukturalnych i ilościowych zaburzeń m.in.: translokacje wzajemne, insercje, delecje, izolowane
trisomie lub monosomie, izochromosomy (2). Częstość występowania tych zaburzeń
jest różna, niektóre zostały opisane tylko w pojedynczych przypadkach. Istnieje
korelacja pomiędzy rodzajem występujących aberracji chromosomalnych a wiekiem
chorych, np. t(8;21), inv(16), t(15;17) częściej występują w młodszej grupie wiekowej
(3, 4, 5, 6). Również częściej zaburzenia chromosomalne występują u dzieci
z rozpoznaną de novo OBS niż u osób dorosłych, chociaż przyczyna tych różnic nie
jest poznana (2). Niektóre zmiany strukturalne są związane z określonym podtypem
białaczki wg FAB, np. translokacje t(8;21) z podtypem M2; t(15;17), t(ll;17), t(5;17)
z podtypem M3; inv/dell6 z wariantem eozynofilowym OBS M4 (OBS M4eo) (2, 6,
7). Inne aberracje, np. +8, 7/7q— lub 5q —, występują w różnych typach białaczek,
jak również w zespołach mielodysplastycznych oraz białaczkach wtórnych, bez
uchwytnego związku z określonym typem morfologicznym (8, 9, 10).
W ostatnim czasie na podstawie trzech dużych wieloośrodkowych badań
zaproponowano stratyfikację chorych z de novo OBS do trzech grup ryzyka
cytogenetycznego (Tabela 2). Zostały one zdefiniowane w Europie przez grupę
MRC — Medical Research Council (Wielka Brytania), a w Stanach Zjednoczonych
przez grupy SWOG — Southwestern Oncology Group, ECOG — Eastern Cooperative Oncology Group oraz CALGB — Cancer and Leukemia Group B. Chorzy na
ostre białaczki z obecnością t(8;21), t(15;17), inv(16), t(16;16), zaliczeni zostali do
grupy niskiego ryzyka cytogenetycznego, charakteryzującej się dobrą odpowiedzią
na leczenie, niskim ryzykiem nawrotu choroby i długim czasem przeżycia. Pozostali
chorzy, w zależności od rodzaju stwierdzanych aberracji chromosomalnych lub
mający prawidłowy kariotyp, są stratyfikowani do grup o pośrednim i wysokim
ryzyku choroby (2). Wyniki badania MRC-AML11 oceniające odsetek całkowitych
remisji, ryzyko wznowy i całkowity czas przeżycia chorych z OBS w zależności od
stratyfikacji do grup ryzyka cytogenetycznego, przedstawiono w Tabeli 3.
Istnieją jednak różnice w poglądach pomiędzy ośrodkami biorącymi udział
w definiowaniu grup ryzyka cytogenetycznego. W grupie o niskim ryzyku cytogenetycznym wg SWOG/ECOG znajduje się del(16q), nie wymieniana przez grupy
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
9
Tabela 2. Grupy ryzyka cytogenetycznego w ostrych białaczkach szpikowych
Stopień
ryzyka
Kryteria grupy MRC*
Kryteria grupy SWOG/ECOG**
t (15;17) — z inną aberracją
inv(16)/t(16;16)/del(16q) — z inną aberracją
t(8;21) — bez del(9q) i złożonego kariotypu
Niskie
t(15;17) — z inną aberracją
inv(16)/t(16;16) z inną aberracją t(8;21)
— z jakąkolwiek inną aberracją
chromosomalną
Pośrednie
+8, — Y, + 6, del(12p) normalny kariotyp, + 8, — Y, +6, del(12p) normalny kariotyp
zmiany w Ilq23, del(9q), del(7q) - bez
innych zmian, złożone zmiany w kariotypie w liczbie 3 — 4, zmiany o nieokreślonym znaczeniu
Wysokie
-5 lub del(5q), -7, lub t(8;21) z del(9q)
lub złożonymi zmianami kariotypu,
inv(3q), 20q, 21q, t(6;9), t(9;22), zmiany
17p, złożone zmiany kariotypu w liczbie
co najmniej 5
-5/del (5q), -7/del(7q) t (8;21) z del(9q) lub
złożonym kariotypem inv(3q), zmiany Ilq23,
20q 21q, del(9q), t(6;9) t(9;22), zmiany 17p
złożony kariotyp (> 3 zmian)
Wszystkie inne klonalne aberracje chromosomalne z mniej niż 3 zmianami
Nieznane
*MRC - Medical Research Council (Wielka Brytania)
**SWOG — Southwestern Oncology Group/Eastern Cooperative Oncology Group (USA) (76)
Tabela 3. Odsetek całkowitych remisji, ryzyko wznowy i czas przeżycia w zależności od stwierdzanych
zmian cytogenetycznych — badanie MRC-AML11 (5)
Rodzaj zmian
Łącznie
Liczba
CR
(%)
1065
55
Zgony w Oporność na
Ryzyko
indukcji (%) leczenie (%) wznowy w
ciągu 5 lat
(%)
18
26
79
Całkowite
5-letnie
przeżycie
(%)
13
Grupa niskiego ryzyka cytogenetycznego
t(15;17)
43
63
33
5
26
38
t(8;21)
23
87
0
13
84
35
inv(16)
12
75
17
8
89
17
Grupa pośredniego ryzyka cytogenetycznego
Prawidłowy kariotyp
507
63
20
17
78
15
Izolowana +8
41
51
17
32
95
5
Ilq23
7
86
0
14
100
0
221
54
16
30
84
11
Inne zmiany
Grupa wysokiego ryzyka cytogenetycznego
Złożony kariotyp
145
26
19
56
91
2
Inne zmiany niekorzystne
66
45
14
41
81
7
10
A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
badawcze CALGB i MRC. W grupie niskiego ryzyka wg SWOG/ECOG została
umieszczona translokacja t(8;21) bez del(9q) i złożonego kariotypu, podczas gdy
pozostałe grupy klasyfikują do niskiego ryzyka wszystkie przypadki z obecnością
t(8;21), niezależnie od tego czy jest to izolowana aberracja, czy towarzyszą jej inne
zmiany cytogenetyczne (2, 11).
U chorych z t(8;21) lub inv(16)/t(16;16) obecność złożonego kariotypu z trzema
lub więcej nieprawidłowościami lub zaburzeń towarzyszących (—Y, —X, +8), nie
wpływa niekorzystnie na przebieg kliniczny choroby (11). Schoch i wsp. wykazali
jednak, że obecność del(9q) u chorych z OBS z t(8;21) stanowi niekorzystny czynnik
rokowniczy (12).
OBS NISKIEGO RYZYKA CYTOGENETYCZNEGO
Do grupy tej zalicza się chorych z translokacjami: t(8;21), inv(16)/t(16;16) oraz
t(15;17) (2, 7, 11, 13, 14). W wyniku rearanżacji chromosomalnych powstają geny
fuzyjne kodujące nowe białka o zmienionej funkcji biologicznej. Metody cytogenetyki molekularnej (FISH) oraz biologii molekularnej (RT-PCR), w wielu
przypadkach pozwalają z większą czułością rozpoznać powyższe zaburzenia genetyczne w porównaniu do metod klasycznej cytogenetyki. U niektórych chorych
są jedynym narzędziem pozwalającym na wykazanie istniejących zaburzeń chromosomalnych (15). W tej grupie chorzy charakteryzują się lepszym rokowaniem,
wysokim odsetkiem całkowitych remisji choroby i mniejszym ryzykiem wznowy (2,
7, 11, 16). Wykazanie obecności tych aberracji chromosomalnych w momencie
rozpoznania determinuje wybór rodzaju leczenia. W odróżnieniu od grupy pośredniego i wysokiego ryzyka cytogenetycznego chorzy ci nie są kandydatami do
allogenicznego przeszczepienia szpiku (allo- SCT) w pierwszej remisji choroby, o ile
nie współistnieją inne czynniki ryzyka (17, 18). W większości przypadków udaje się
uzyskać całkowitą remisję po pierwszym leczeniu indukującym. Allotransplantację
należy rozważyć u chorych w drugiej remisji hematologicznej lub w przypadku
utrzymywania się choroby resztkowej po zakończeniu leczenia indukująco-konsolidujacego (18). Na podstawie licznych badań wiadomo, że niektóre leki i schematy
leczenia stosowane w przypadkach OBS z określonymi zmianami cytogenetycznymi
mają przewagę nad standardową chemioterapią (19, 20, 21, 22). Odnosi się to do
OBS z obecnością genu fuzyjnego PML/RARa występującego w t(15;17), gdzie
w leczeniu indukującym oprócz antracyklin stosuje się leki korygujące zaburzenia
dojrzewania, jak również do grupy chorych z aberracjami dotyczącymi Core Binding
Factor [t(8;21 i inv(16)/t(16;16)], którzy odnoszą szczególną korzyść z leczenia
dużymi dawkami arabinozydu cytozyny (AraC) w trakcie leczenia konsolidującego.
Zastosowanie kilku kursów z dużymi dawkami AraC wydłuża okres wolny od choroby i czas całkowitego przeżycia chorych w tej grupie w porównaniu z zastosowaniem klasycznej konsolidacji (22). Wykazano, że efekt cytotoksyczny AraC różni
się w zależności od aktywności proliferacyjnej komórek białaczkowych, co klinicznie
przekłada się na odsetek uzyskiwanych całkowitych remisji. Grupy chorych zdefiniowane na podstawie zaburzeń cytogenetycznych różnią się wewnętrzną aktywnością
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
11
proliferacyjną komórek blastycznych (22). W grupie chorych z niskim ryzykiem
cytogenetycznym komórki blastyczne wykazują większą aktywność proliferacyjną
w porównaniu z grupą wysokiego ryzyka cytogenetycznego (22). Dotyczy to
szczególnie chorych z t(8;21) i inv(16), podczas gdy w przypadku t(15;17), blasty
wykazują tylko umiarkowaną aktywność proliferacyjną (6, 11, 19, 22, 23).
Wiadomo również, że duże dawki AraC po podaniu dożylnym bardzo dobrze
penetrują do płynu mózgowo-rdzeniowego. Biorąc pod uwagę większe ryzyko
zajęcia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u chorych z inv(16), lepsza
prognoza w tej grupie może wynikać między innymi ze zmniejszenia odsetka
wznowy choroby w OUN (23).
t(8;21) Z OBECNOŚCIĄ GENU AML1/ETO
Translokacja t(8;21)(q22;q22) występuje u około 8-12% chorych z OBS.
W 20—40% przypadków związana jest z podtypem M2 (9, 7, 15, 24). W tym
pod typie dochodzi do zaburzeń funkcji czynnika transkrypcyjnego AML1 oraz
deacetylazy histonowej (HDAC). Opisano rzadkie przypadki obecności tej translokacji u chorych z podtypem Ml i M4 OBS, jak również we wtórnej OBS (9). Gen
fuzyjny AML1-ETO może być wykrywany także metodą RT-PCR. Metody biologii
molekularnej (RT-PCR, FISH) z większą czułością wykrywają tę translokację
w porównaniu do metod klasycznej cytogenetyki (3, 9, 25, 26). Translokację t(8;21)
spotyka się zarówno u dorosłych, zwłaszcza w młodszej grupie wiekowej, jak
i u dzieci (14;21). W badaniu immunofenotypowym w komórkach białaczkowych
z t(8;21) stwierdza się ekspresję antygenów mieloidalnych, czasem obserwuje się
koekspresję antygenu CD 19 charakterystycznego dla linii limfoidalnej B-komórkowej (9, 27, 28). Obecność antygenu CD56 w OBS z t(8;21) jest uważana za zły
czynnik prognostyczny u tych chorych (9, 29). Istnieją różne, sprzeczne doniesienia
dotyczące wpływu dodatkowych zaburzeń chromosomalnych u chorych z obecnością
translokacji t(8;21) na przebieg choroby i rokowanie (2, 11).
Metody biologii molekularnej oprócz wykrywania aberracji chromosomalnych
służą również do monitorowania MRD. W monitorowaniu choroby resztkowej mają
zastosowanie zarówno metody jakościowe, zwłaszcza nested PCR, jaki i metody
ilościowe (RQ-PCR). Niektórzy autorzy uważają, że tylko seryjnie powtarzane
metody ilościowe mają znaczenie w przewidywaniu ryzyka wznowy choroby
u chorych z OBS z t(8;21) (25, 26, 31, 32, 33). Morschhauser i wsp. wykazali także, że
pacjenci z konwersją wyniku dodatniego na ujemny w RT-PCR w okresie 6 miesięcy
od momentu ustalenia rozpoznania mają mniejsze ryzyko wznowy niż chorzy,
u których w tym okresie wykrywa się obecność transkryptu AML1-ETO (34). Nie
jest ustalone, jaki wpływ na ryzyko nawrotu choroby u chorych z t(8;21) ma
konwersja wyniku PCR z ujemnego na dodatni w okresie długo trwającej remisji
hematologicznej. Również wykrycie w gniazdowym PCR obecności genu fuzyjnego
AML1-ETO może czasami świadczyć o ryzyku wznowy choroby. Opisywano
chorych z długotrwałą remisją hematologiczną pomimo dodatniego wyniku gniazdowego PCR. Z drugiej strony opisywani są chorzy w długotrwałej całkowitej
12
A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
remisji hematologicznej, u których nigdy nie nastąpiła konwersja wyniku RT-PCR
z dodatniego na ujemny (24, 26, 35). Być może badanie kinetyki zmian ilości
transkryptu AML1-ETO metodą ilościową (RQ-PCR) w okresie po leczeniu
konsolidującym pozwoli bardziej precyzyjnie określić ryzyko wznowy choroby
w przyszłości (24). Wydaje się, że kombinacja metody jakościowej i ilościowej PCR
pozwala lepiej monitorować chorobę resztkową u chorych z OBS z t(8;21) (25). Jako
strategię postępowania można przyjąć wykonywanie badań ilościowych przy konwersji długotrwałego ujemnego wyniku RT-PCR na dodatni co najmniej w dwóch
próbkach (25).
inv(16)/t(16;16) Z OBECNOŚCIĄ GENU CBFJł/MYHll
inv(16)(pl3;q22) została zidentyfikowana przez Lebeau i wsp., którzy wykazali
obecność tej aberracji u chorych z OBS M4eo (19). Obecnie wiadomo, że zaburzenie
to może występować także w innych typach OBS (9, 15) oraz u chorych z kryzą
mieloblastyczną przewlekłej białaczki szpikowej (PBS) (9). W inv(16) dochodzi do
zaburzeń regulacji transkrypcji regulowanej przez CAFpi AML1. Wynikiem inwersji
chromosomu 16 jest powstanie genu fuzyjnego CBFP-MYH1. Transkrypt tego genu
jest wykrywany metodą RT-PCR u około 10-12% de novo OBS i u ponad 40%
chorych z OBS M4eo (9, 15, 19). Częstość występowania tej aberracji u dorosłych
i u starszych dzieci jest podobna. W grupie osób dorosłych zaburzenie dotyczy
młodszej grupy wiekowej, koreluje również z wysoką liczbą krwinek białych
w momencie rozpoznania i hepatosplenomegalią (9). Dyskretne zmiany w kariotypie
w przypadku inv(16) powodują, że trudniej jest wykryć tę aberrację klasycznymi
metodami cytogenetycznymi (3). Z tego względu metody biologii molekularnej są
bardziej skuteczne w diagnostyce chorych z obecnością inv(16) (3, 9). Należy
podkreślić szczególne znaczenie wykonywania tych badań w grupie chorych z prawidłowym kariotypem i zmianami morfologicznymi charakterystycznymi dla OBS
M4eo. Wykazanie obecności inv(16) w tej grupie ma zasadnicze znaczenie w dalszym
postępowaniu terapeutycznym. OBS z inv(16) nie jest wskazaniem do allo-SCT
w pierwszej remisji choroby, i jak już wspomniano wcześniej chorzy odnoszą korzyść
z leczenia dużymi dawkami Arac (3 g/m 2 ) w trakcie konsolidacji (3-4 cykle).
Opisuje się także występowanie dodatkowych zmian cytogenetycznych u chorych
z inv(16). Najczęściej są to trisomia chromosomu 8, 21 i 22, rzadziej delecja długiego
ramienia chromosomu 7 (9, 15, 36).
W badaniu szpiku kostnego u większości chorych z inv(16) oprócz typowego
obrazu dla białaczki mielomonocytowej, zwraca uwagę zwiększona liczba nieprawidłowych eozynofili na różnych szczeblach rozwoju. Większość zaburzeń dotyczy
prekursorów na szczeblu promielocyta i mielocyta. Ziarnistości mają zabarwienie
purpurowo-fioletowe i są większe niż zwykle spotykane w niedojrzałych formach
eozynofilów (14). Immunofenotyp komórek białaczkowych w przypadku obecności
inv(16), oprócz antygenów charakterystycznych dla linii mieloidalnej wykazuje
obecność markerów linii monocytoidalnej, tzn.: CD14, CDllb, CDllc, CD64, CD36
i lizozymu. Żaden z tych antygenów nie jest jednak specyficzny dla komórek
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
13
z inv(16) (9, 14). Częsta koekspresja antygenu CD2 na powierzchni komórek również
nie jest specyficzna dla tego zaburzenia cytogenetycznego (9).
Pomimo bardzo dobrych wyników chemioterapii u chorych z inv(16), istnieje
duże ryzyko wznowy choroby. Monitorowanie choroby resztkowej w czasie trwania
remisji hematologicznej ma zasadnicze znaczenie dla dalszego wczesnego postępowania terapeutycznego w przypadku wznowy choroby. Podobnie jak w przypadku t(8;21), u większości chorych będących w długiej remisji hematologicznej
obserwuje się konwersję dodatniego wyniku PCR na ujemny. Istnieje jednak grupa
chorych, u których nigdy nie dochodzi do konwersji wyniku pomimo długotrwałej
remisji hematologicznej. Wydaje się, że metoda RQ-PCR pozwoli w przyszłości po
leczeniu konsolidującym ustalić poziom ekspresji genu CBFB-MYH11, pozwalający
przewidzieć ryzyko wznowy choroby (14, 24, 26, 35, 37).
t(15;17) Z OBECNOŚCIĄ GENU PML/RARa
Translokacja t(15;17)(q22;q21) występuje u chorych z ostrą białaczką promielocytową M3 wg klasyfikacji FAB. Wynikiem translokacji jest powstanie genu hybrydowego PML/RARa, który występuje u 5—15% wszystkich przypadków OBS (1,
15). Częściej ten podtyp białaczki występuje w krajach śródziemnomorskich i latynoskich (9). Najczęściej dotyczy młodych dorosłych i osób w średnim wieku. Bardzo
rzadko wykrywa się t(15;17) u dzieci poniżej 12 miesiąca życia (2). Białko PMLRARa działa jako dominujący aktywny mutant w stosunku do białek PML i RARa
(38). Nieprawidłowo zbudowany receptor RARa nie reaguje w sposób właściwy na
fizjologiczne stężenia retinoidów, które determinują prawidłowe dojrzewanie komórek. Zwiększenie stężenia retinoidów poprzez podanie kwasu trans-retinowego
(ATRA) koryguje zaburzenia dojrzewania. Z tego względu w aktualnie obowiązujących standardach leczenia ostrej białaczki z obecnością PML/RARa, w leczeniu
indukującym remisję stosuje się schematy oparte na łącznym podawaniu ATRY
i antracyklin (20, 21, 39). Komórki PML/RARa cechują się także zwiększoną
proliferacją i zahamowaniem apoptozy (38). Stwierdza się także zaburzenia mechanizmu naprawy DNA (38).
OBS M3 z obecnością t(15;17) charakteryzuje się zwiększeniem odsetka nieprawidłowych promielocytów w szpiku kostnym i krwi obwodowej. Opisano typową
postać hypergranularną tej białaczki jak również rzadziej występujący wariant
mikrogranularny. Z OBS M3 związany jest immunofenotyp z ekspresją antygenów
CD13, CD33, MPO i brakiem ekspresji antygenów CD34 i HLA DR (9). Wyższa
ekspresja antygenu CD34 bywa czasem związana z podtypem mikrogranularnym
OBS M3 oraz koekspresja antygenu CD2 (9). W przypadkach białaczek z t(15;17)
rzadziej niż w innych typach OBS występuje również ekspresja antygenu CD38.
Obecność CD56 na powierzchni komórek białaczkowych u chorych z t(15;17) jest
stwierdzana rzadko, jednak podobnie jak u chorych z t(8;21) wiąże się z gorszym
przebiegiem klinicznym choroby (9).
Długotrwałą remisję i potencjalne wyleczenie uzyskuje się u prawie 70% chorych
z OBS M3. Pomimo dobrych wyników leczenia, w dalszym ciągu problemem jest
14
A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
duży odsetek wczesnych zgonów w trakcie indukcji remisji i wysokie ryzyko nawrotu
choroby. Ryzyko zgonu w okresie indukcji jest często związane z rozwojem ostrego
zespołu wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC).
Stosując metodę RT-PCR, której czułość detekcji transkryptu PML-RARa
wynosi 10"3 —10~4, wykazano że wykrycie resztkowego transkryptu genu fuzyjnego w
trakcie całkowitej remisji po leczeniu konsolidacyjnym jest zapowiedzią wznowy
hematologicznej białaczki (21). Monitorowanie choroby resztkowej i wczesna
interwencja terapeutyczna na etapie wznowy molekularnej daje szansę na uzyskanie
drugiej remisji molekularnej (21, 39). U prawie połowy chorych remisję molekularną
udaje się uzyskać stosując w leczeniu tylko kwas trans-retinowy (21). Leczenie na
etapie wznowy hematologicznej oprócz większego ryzyka wczesnego zgonu w przebiegu DIC, wymaga zwykle terapii skojarzonej z antracyklinami związanej z większym ryzykiem powikłań. Zastosowanie ATRY w monoterapii lub w połączeniu
z atracyklinami w leczeniu wznowy molekularnej białaczki promielocytowej jest
kwestią nierozstrzygniętą (21). Niektórzy autorzy uważają, że samo leczenie kwasem
trans -retinowym prowadzi tylko do redukcji liczby komórek białaczkowych poniżej
możliwości detekcji w metodzie RT-PCR, a nie jest równoznaczne z eradykacją
klonu nowotworowego. Z tego względu wśród niektórych badaczy przeważa pogląd,
że w leczeniu wznowy molekularnej należy stosować schematy leczenia podobne jak
w przypadkach wznowy hematologicznej choroby (21). Znaczenie trójtlenku arsenu
(As2O3) w monoterapii wznowy molekularnej jest aktualnie przedmiotem badań
klinicznych (40). Wstępne wyniki sugerują, że jest on bardziej skuteczny niż ATRA,
jednak czas obserwacji chorych leczonych tym lekiem jest zbyt krótki, aby móc
wyciągnąć ostateczne wnioski (21, 39). Biorąc pod uwagę dobre wyniki leczenia po
zastosowaniu ATRY w połączeniu z antracyklinami, nie jest rekomendowane
kwalifikowanie chorych do allo-SCT w pierwszej całkowitej remisji OBS M3
z obecnością PML/RARa. Takie postępowanie należy rozważyć natomiast w przypadku wznowy hematologicznej choroby, kiedy uzyskuje się drugą CR (CR2) lub
utrzymywania się choroby resztkowej po zakończeniu terapii pierwszej linii (41).
U chorych w drugiej remisji molekularnej dobre wyniki leczenia uzyskuje się
wykonując autologiczny przeszczep szpiku (auto-SCT) (42, 43).
Oprócz translokacji t(15;17) wykryto również inne aberracje chromosomalne
z obecnością rearanżacji genu RARa w ostrej białaczce promielocytowej w tym
t(ll;17)(q23;q21) z utworzeniem genu fuzyjnego PLZF/RARa, t(ll;17)(ql3;q21)
z utworzeniem NUMA/RARa i t(5;17)(q35;q21) z utworzeniem NPMl/RARa.
W przypadku genu PLZF/RARa podanie kwasu retinowego nie prowadzi do
skorygowania zaburzenia dojrzewania komórek (44).
OBS POŚREDNIEGO RYZYKA CYTOGENETYCZNEGO
W tej grupie znajdują się chorzy, u których w momencie rozpoznania choroby
stwierdza się prawidłowy kariotyp lub rzadkie aberracje chromosomalne, np. + 8, Y, +6, del(12p). Są to chorzy, którzy mają mniejszy odsetek całkowitych remisji,
większe ryzyko wznowy i krótszy czas przeżycia w porównaniu z grupą chorych
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
15
0 niskim ryzyku cytogenetycznym (2, 7, 11, 16). U niewielkiego odsetka chorych
z prawidłowym kariotypem stratyfikowanych do grupy pośredniego ryzyka na
podstawie klasycznych metod cytogenetycznych udaje się wykryć metodami moleku
larnymi (RT-PCR, FISH) obecność genów fuzyjnych charakterystycznych dla t(8;21)
lub inv(16). Dzieje się tak szczególnie w przypadkach aberracji, które dają dyskretne
zmiany w klasycznych metodach cytogenetycznych (3, 15). Wskazane jest wykorzys
tanie metod biologii molekularnej równolegle z klasycznymi metodami cytogenetycznymi w celu wyodrębnienia tej grupy chorych i stratyfikacji do odpowiedniej
grupy ryzyka. Grupa pośredniego ryzyka cytogenetycznego stanowi około 40%
wszystkich chorych z OBS (45). Wyniki wstępnych badań nad czynnikami prognos
tycznymi w tej grupie pozwoliły na identyfikację nowych niezależnych wpływających
na czas przeżycia chorych zaburzeń genetycznych. Na szczególną uwagę zasługują
mutacje genu receptora FLT3, w tym wewnętrzne duplikacje fragmentu genu
prowadzące do nadmiernej aktywności kinazy tyrozynowej. Receptor FLT3 może
być także aktywowany w wyniku punktowych mutacji, szczególnie często spotykana
jest mutacja D835. Oba rodzaje mutacji są niezależnymi czynnikami prognostycz
nymi związanymi z gorszym rokowaniem w OBS (46).
Spośród wymienionych na wstępie aberracji chromosomalnych, najwięcej publikacji dotyczących przebiegu klinicznego i rokowania odnosi się do trisomii
chromosomu 8 (+8). Jest to najczęściej spotykana trisomia u chorych z OBS, której
częstość występowania ocenia się na 10—15% (2, 8). Może dotyczyć wszystkich
podtypow białaczek wg klasyfikacji FAB (8). Zaburzenie to może występować jako
izolowana aberracja u chorych z OBS, jak również towarzyszyć innym zmianom
w kariotypie. Według danych z piśmiennictwa odsetek uzyskiwanych całkowitych
remisji u chorych z +8 waha się od 29% do 91% (2, 47). Różnią się również dane
określające ryzyko wznowy choroby i rokowanie (2). Włączenie do analizy badań
klinicznych zarówno chorych z izolowaną +8, a także chorych z +8 i współistniejącymi zmianami cytogenetycznymi, wydaje się mieć zasadnicze znaczenie w wyjaśnieniu przyczyny tych różnic. Izolowana + 8 jest związana z pośrednim ryzykiem
cytogenetycznym wg SWOG. W niektórych publikacjach sugerowano, że 4-8 jest
niezależnym czynnikiem prognostycznym u chorych na OBS (11). Wyniki badania
Cancer and Leukemia Group B (CALGB) wskazują, że stratyfikacja chorych z + 8
do poszczególnych gryp ryzyka, powinna jednak uwzględniać współistnienie dodatkowych zaburzeń cytogenetycznych (11). W przypadku chorych z grupy niskiego
ryzyka cytogenetycznego, stwierdzenie dodatkowych zmian w kariotypie w tym + 8,
nie pogarsza rokowania (2, 11). Rozpoznanie +8 towarzyszącej złożonym zmianom
w kariotypie jest natomiast dodatkowym złym czynnikiem prognostycznym (8).
Ostateczne znaczenie obecności + 8 dla przebiegu klinicznego i rokowania chorych
na OBS jest przedmiotem dalszych intensywnych badań.
Do grupy pośredniego ryzyka cytogenetycznego stratyfikowani są również chorzy
z trisomia chromosomu 6 (+6). Jako izolowane zaburzenie cytogenetyczne aberracja
ta występuje najczęściej w podtypie Ml OBS. Spotykana jest także u chorych z zespołami mielodysplastycznymi (48). Opisywano również chorych z anemią aplastyczną
1 +6, u których w toku dalszej obserwacji wystąpiła transformacja w OBS (49).
16
A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
Kolejnym zaburzeniem cytogenetycznym świadczącym o pośrednim ryzyku
cytogenetycznym chorych z OBS jest utrata chromosomu Y (—Y). Ponieważ
częstość — Y wzrasta z wiekiem, trudno jest czasami rozstrzygnąć czy aberracja ta
jest konsekwencją naturalnego procesu starzenia się organizmu, czy też jest związana
z obecnością klonu nowotworowego (50). Nieprawidłowy kariotyp z obecnością — Y
w 75 —100% metafaz, jest najprawdopodobniej związany z OBS, nawet u starszych
mężczyzn (50). Utratę chromosomu Y obserwuje się również u chorych z przewlekłymi zespołami mieloproliferacyjnymi, zespołami mielodysplastycznymi, rzadko
u chorych z chorobami limfoproliferacyjnymi (51).
Delecja ramienia chromosomu 12 del(12p) jest kolejną aberracją na podstawie
której chorzy z OBS stratyfikowani są do grupy o pośrednim ryzyku cytogenetycznym. Zaburzenie to, oprócz OBS występuje w wielu innych nowotworach układu
krwiotwórczego (52, 53). Jako izolowaną zmianę stwierdza się del(12p) u 20%
chorych, często natomiast towarzyszy aberracjom chromosomu 5 i 7. Uważa się, że
aberracja ta jest charakterystyczna dla wtórnych białaczek (52). Istnieją różnice
w przebiegu klinicznym u chorych z ostrą białaczką w zależności od rejonu
złamania. Utrata mniejszego fragmentu krótkiego ramienia chromosomu 12 charakteryzuje się łagodniejszym przebiegiem klinicznym choroby, utracie większego
fragmentu 12p towarzyszą często dodatkowe zaburzenia chromosomalne i rokowanie jest gorsze (53).
W grupie chorych z OBS o pośrednim ryzyku cytogenetycznym, niezależnie od
odsetka uzyskiwanych CR (60—70%) po zastosowaniu leczenia indukującego,
istnieje duże prawdopodobieństwo nawrotu choroby. Wyniki leczenia w okresie
wznowy z zastosowaniem konwencjonalnej chemioterapii są złe, szczególnie u chorych u których nawrót choroby nastąpił w krótkim czasie po uzyskaniu CR. Z tego
względu w tej grupie chorych rekomendowane jest wykonanie allo SCT w CR1
w przypadku dostępności zgodnego w HLA rodzeństwa (18) Rola auto-SCT w CR1
jest niepewna.Wydaje się, że zastosowanie tej procedury może wydłużać czas wolny
od choroby w porównaniu z konwencjonalną chemioterapią (17). W przypadku
uzyskania CR2, utrzymywania się cech choroby resztkowej i braku dostępności
zgodnego dawcy rodzinnego, chorzy z tej grupy są kandydatami do allo-SCT od
w pełni zgodnego dawcy niespokrewnionego (18).
OBS WYSOKIEGO RYZYKA CYTOGENETYCZNEGO
Do grupy tej stratyfikowani są chorzy z rozpoznaniem OBS, u których
w momencie rozpoznania stwierdza się następujące zaburzenia cytogenetyczne:
-5/del5(q), -7/del7(q), inv(3q), t(3;3), 20q, 21q, del(9q), zaburzenia dotyczące Ilq23,
t(6;9), t(9;22) lub złożony kariotyp (15). Złożony kariotyp jest zdefiniowany jako
występowanie trzech lub więcej ilościowych i/lub strukturalnych aberracji chromosomalnych wyłączając obecność translokacji t(8;21), t(15;17) i inv(16). W grupie tej
niekorzystny przebieg kliniczny, z niskim odsetkiem remisji całkowitych i wysokim
ryzykiem wznowy choroby, determinuje bardziej agresywny sposób leczenia.
W przypadku dostępnego dawcy decyzje o allo-SCT podejmowane są często już
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
17
w momencie uzyskania pierwszej remisji po leczeniu indukującym (16, 18, 54).
Chorych nieposiadających dawcy rodzinnego kwalifikuje się do all-SCT od zgodnego dawcy niespokrewnionego (18). Należy jednak pamiętać, że odsetek wznowy
choroby po allotransplantacji jest wyższy niż w pozostałych dwóch grupach ryzyka
cytogenetycznego (2,16, 55). Rola auto-SCT w tej grupie chorych jest ograniczona ze
względu na duże ryzyko nawrotu choroby (17). W odróżnieniu od chorych z niskim
ryzykiem cytogenetycznym z obecnością t(8;21) lub inv(16), oraz z prawidłowym
kariotypem, nie wykazano w tej grupie chorych korzyści związanych ze stosowaniem
wysokich dawek AraC w leczeniu konsolidującym (16). Oporność na leczenie
cytostatyczne zwłaszcza chorych ze złożonym kariotypem, wydaje się mieć związek
z ekspresją genu oporności wielolekowej — mdrl (56). Wykazano również niską
aktywność proliferacyjną komórek białaczkowych wpływającą na złą odpowiedź na
leczenie indukujące, która wydaje się być wynikiem obniżonej produkcji cytokin
stymulujących linię granulocytarno-makrofagową (56, 57). Te obserwacje doprowadziły do nowych koncepcji terapeutycznych. Terapia z zastosowaniem GM-CSF lub
G-CSF jako „priming in vivo" wydaje się być obiecującą koncepcją, która może
doprowadzić do poprawy wyników leczenia w tej grupie chorych (16).
W przypadku niepowodzenia po zastosowaniu leczenia indukującego pierwszej
linii, sięga się często po nowe schematy wielolekowe, w tym TVTG (topotecan,
vinorelbina, thiotepa, dexamathazon, gemcytabina) (58), schematy z zastosowaniem
AraC, etopozydu, mitoxantronu, 2-CDA łącznie z G-CSF (59, 60), jak również
schematy, w których oprócz wielolekowej chemioterapii stosowane są przeciwciała
monoklonalne anty- CD33 (61, 62). W przypadku uzyskania CR po leczeniu drugiej
linii należy dążyć jak najszybciej do wykonania allo-SCT.
OBS ZE ZŁOŻONYM KARIOTYPEM
Częstość występowania złożonego kariotypu u chorych z rozpoznaną de novo
OBS ocenia się na około 10% (16). Znacznie częściej tego rodzaju zaburzenia dotyczą
starszej grupy wiekowej (16). Niekorzystny przebieg kliniczny, niski odsetek uzyskiwanych CR niezależnie od rodzaju stosowanego leczenia i krótki czas przeżycia,
wykazano w tej grupie chorych w wielu niezależnych badaniach (16). Współistnienie
złożonego kariotypu z innymi zmianami określanymi jako niekorzystne np. — 5/5qlub — 7/7q —, dodatkowo pogarsza rokowanie. Nie wykazano istotnych różnic
w przebiegu klinicznym i rokowaniu w młodszej i starszej grupie wiekowej chorych ze
złożonym kariotypem (16). Pozostaje to w sprzeczności z wynikami badania Dastugue
i wsp. (47), którzy wykazali, że złożone zaburzenia cytogenetyczne determinują
niekorzystny przebieg choroby tylko w starszej grupie wiekowej.
OBS z aberracjami chromosomu 5 i 7
Monosomia lub delecja krótkich ramion chromosomów 5 lub 7 [ —5/del(5q),
— 7/del(7q)] są najczęściej związane z OBS w grupie powyżej 60 roku życia oraz
z białaczką wtórną do MDS (9). W grupie chorych, u których zaburzenia dotyczące
18
A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
chromosomów 5 lub 7 występują jako izolowana aberracja przebieg kliniczny jest
korzystniejszy, niż gdy zmianom tym towarzyszy złożony kariotyp (4, 9).
Na powierzchni komórek białaczkowych chorych z aberracjami chromosomów
5 i 7 zwykle wykrywa się jeden z antygenów charakterystycznych dla linii
mieloidalnej, w tym CD13, CD15 lub CD33. Zarówno w pierwotnych jak i wtórnych
postaciach białaczek stwierdza się wysoką ekspresję antygenu CD34. Antygen CD 14
występuje znacznie częściej w grupie chorych z aberracjami chromosomu 5 niż 7 (9).
Monosomia chromosomu 7 była opisywana także w OBS M7 u chorych z zespołem
Downa. Białaczki, którym towarzyszą zmiany dotyczące chromosomu 5 wykazują
znacznie częściej ekspresję antygenów charakterystycznych dla komórek wywodzących się z linii limfoidalnej T, takich jak CD2 lub CD7. Wykazano również, że
ekspresja TdT i antygenu CD7 na powierzchni komórek białaczkowych chorych
z aberracjami chromosomu 5 lub 7 koreluje z obecnością wielolekowej oporności (9).
OBS Z TRANSLOKACJAMI Z UDZIAŁEM Ilq23
Translokacje z udziałem Ilq23 spotyka się u około 6% chorych z OBS (63).
Zmiany mogą pojawić się w każdym wieku, jednak najczęściej dotyczą dzieci
w wieku niemowlęcym. Występują zarówno we wtórnych jak i de novo OBS, a także
w ostrych białaczkach limfoblastycznych (63, 64). U chorych z delecjami lub
translokacjami obejmującymi chromosom Ilq23, najczęściej rozpoznaje się podtypy
M5a wg FAB (50%) oraz M4 (20%) (63). Drugą grupę chorych, u których często
stwierdza się aberracje z Ilq23, stanowią chorzy z wtórnymi OBS, szczególnie
w przypadkach uprzedniego leczenia inhibitorami topoizomerazy typu II, lekami
alkilującymi lub po radioterapii (63, 64, 65).
Wzajemna translokacja z udziałem Ilq23 w rejonie kodującym gen MLL
i innymi chromosomami prowadzi do powstania wielu genów fuzyjnych. Znanych
jest obecnie kilkadziesiąt translokacji z ponad 30 typami genów fuzyjnych (64, 65).
Z tego powodu metodą z wyboru w rozpoznawaniu aberracji Ilq23 jest split FISH.
Około 10% aberracji Ilq23 stanowią translokacje z udziałem innych niż gen MLL.
OBS z aberracjami Ilq23 wiąże się z występowaniem charakterystycznego
immunofenotypu komórek białaczkowych. Występują antygeny typowe dla linii
mieloidalnej oraz dodatkowo markery charakterystyczne dla linii monocytoidalnej
w tym CD 14, CDllb, CD lic, CD64, CD36 (63, 65). U chorych często stwierdza się
hepatosplenomegalię, nacieki białaczkowe w ośrodkowym układzie nerwowym
i wysoką leukocytozę (63).
Przypadki OBS z zaburzeniami Ilq23 charakteryzują się złym przebiegiem
klinicznym i rokowaniem. Różnicę w klinicznym przebiegu choroby oraz odpowiedź
na leczenie determinuje rodzaj translokacji, immunofenotyp komórek białaczkowych, wiek chorego, rozpoznanie de novo lub wtórnej OBS (63). Warto w tym
miejscu przypomnieć o różnicach w stratyfikacji do grup ryzyka cytogenetycznego
pomiędzy grupami badawczymi. Według MRC (Tabela 2), chorzy z zaburzeniami
Ilq23 są stratyfikowani do grupy pośredniego ryzyka cytogenetycznego, natomiast
SWOG/ECOG klasyfikuje tę grupę chorych do wysokiego ryzyka cytogenetycznego.
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
19
OBS z inv(3)/t(3;3) Z UDZIAŁEM GENU EVI1
inv(3)/t(3;3)(q21;q26) występuje w różnych podtypach OBS w starszej grupie
wiekowej (66, 67). Często towarzyszy OBS wtórnej do zespołów mielodysplastycznych i może pojawić się jako dodatkowe zaburzenie genetyczne u chorych z PBS
w fazie kryzy blastycznej i w innych przewlekłych zespołach mieloproliferacyjnych
(66, 68). inv(3)/t(3;3) często towarzyszą strukturalne lub ilościowe zaburzenia
chromosomu 7 i 5 (—7/7q, 5/5q—), jak również złożony kariotyp. Cechą charakterystyczną dla tego zaburzenia jest prawidłowa lub podwyższona liczba płytek (67,
69, 70). W badaniu szpiku stwierdza się cechy dysplazji w obrębie linii czerwonokrwinkowej i płytkotwórczej. Komórki białaczkowe chorych z aberracjami dotyczącymi chromosomu 3, często wykazują koekspresję antygenu CD7, charakterystycznego dla linii limfoidalnej T komórkowej (67).
U 20% chorych z inv(3) można stwierdzić także t(9;22)(q34;qll) z obecnością
genu fuzyjnego BCR/ABL (67). Przypadki OBS z zaburzeniami dotyczącymi
chromosomu 3 charakteryzują się wielolekową opornością. Mediana czasu przeżycia
w tej grupie chorych wynosi tylko 4 miesiące (67, 71, 72). Trudno jest jednoznacznie
ocenić rolę allo-SCT, ze względu na małą liczbę tak leczonych chorych.
OBS z t(6;9) Z OBECNOŚCIĄ GENU DEK/CAN
t(6;9)(p23;q34) występuje u około 1% chorych z OBS (najczęściej w podtypie M2),
często w przypadkach OBS wtórnych do MDS oraz w ostrej mielofibrozie (73, 74).
Może dotyczyć każdej grupy wiekowej (75). Translokacja ta zwykle występuje jako
izolowane zaburzenie, rzadko z towarzyszącymi trisomiami chromosomów 8,12 i 21
(73). Jest rzadko wykrywana w badaniu kariotypowym. Rokowanie w grupie
chorych z OBS i t(6;9) jest niepomyślne.
PODSUMOWANIE
Udoskonalenie metod cytogenetycznych i wprowadzenie badań molekularnych,
spowodowało szybki wzrost znaczenia tych technik w diagnostyce, ustaleniu
rokowania oraz monitorowaniu choroby resztkowej u chorych z OBS. Analiza
cytogenetyczna i molekularna są metodami komplementarnymi, rutynowo wykorzystywanymi w klinicznej praktyce hematologicznej. Zidentyfikowanie zaburzeń cytogenetycznych i molekularnych na początku choroby, ma decydujące znaczenie dla
ustalenia właściwego rozpoznania OBS wg klasyfikacji WHO, oraz dla podjęcia
właściwego leczenia.
Istotne znaczenie w powodzeniu leczenia chorych na OBS ma również monitorowanie choroby resztkowej. Należy podkreślić szczególną rolę jaką odgrywają w tym
zakresie badania molekularne. Klasyczne metody cytogenetyczne są mniej czułe,
czasem występują także trudności w uzyskaniu hodowli komórek szpiku kostnego.
Tych ograniczeń nie mają metody biologii molekularnej, jednak tylko nieliczne
zaburzenia chromosomalne można wykrywać przy ich wykorzystaniu. U chorych,
20
A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
u których stwierdzono obecność genu fuzyjnego w badaniu RT-PCR w trakcie
diagnostyki białaczki, możliwe jest monitorowanie ilości komórek białaczkowych
i uchwycenie wznowy molekularnej choroby stosując real time PCR lub gniazdowy
PCR. Interwencja terapeutyczna na tym etapie choroby może decydować o przyszłym powodzeniu leczenia.
PIŚMIENNICTWO
1. Burkę J.M. Dx/Rx:Leukemia. Jones and Bartlett Publisher 2006 p 18.
2. Mrozek K, Heerema NA, Bloomfield CD. Cytogentics in acute leukemia. Blood Rev. 2004; 18:
115-136.
3. Mrozek K, Prior TW, Edwards C i wsp. Comparison of cytogenetic and molecular genetic
detection of t(8;21) and inv(16) in a prospective series of adults with de novo acute myeloid leukemia:
a cancer and leukemia group B study. J Clin Oncol. 2001; 19: 2482-2492.
4. Penaux P, Predhomme C, Lay JL, Morel P, Beuscart R, Bauters F. Cytogenetics and their
prognostic value in de novo acute myeloid leukaemia: a report on 283 cases. Br J Haematol. 1989; 73:
61-67.
5. Grimwade D, Walker H, Harrison G. i wsp. The predictive value of hierarchical cytogenetic
classification in older adults with acute myeloid leukemia (AML): analysis of 1065 patients entered into
the United Kingdom Medical Research Council AML 11 trial. Blood 2001; 98: 1312-1320.
6. Schoch C, Schnittger S, Kern W, Dugas M, Hiddemann W, Haferlach T. Acute myeloid leukemia
with recurring chromosome abnormalities, FAB subtypes and age distribution in an unselected series of
1897 patients with acute myeloid leukemia. Haematologjca 2003; 88: 351-352.
7. Haferlach T, Kern W, Schoch C. i wsp. A new prognostic score for patients with acute myeloid
leukemia based on cytogenetics and early blast clearance in trials of the German AML Cooperative
Group. Haematologica 2004; 89: 498-418.
8. Wolman SR, Gundacker H, Appelbaum FR, Slovak ML. Impact of trisomy 8 ( + 8) on clinical
presentation, treatment response, and survival in acute myeloid leukemia: a Southwest Oncology Group
study. Blood 2002; 100: 29-35.
9. Hrusak O, Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute
leukemias. Leukemia 2002; 16: 1233-1258.
10. Rossi G, Pelizzari AM, Bellotti D, Tonelli M, Barlati S. Cytogenetic analogy between myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia of elderly patients. Leukaemia 2000; 14: 636 — 641.
11. Byrd JC, Mrozek K, Dodge RK. i wsp. Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of
induction success, cumulative incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute
myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B (CALBG 8461). Blood 2002; 100:
4325-4336.
12. Schoch C, Haase D, Haferlach T. i wsp. Fifty one patients with acute myeloid leukemia and
translocation t(8;21)(q22;q22) an additional deletion in 9q is an adverse prognostic factor. Leukemia 1996;
10: 1288-1295.
13. Marcucci G, Mrozek K, Ruppert A. i wsp. Abnormal cytogenetics at datę of morphologic
complete remission predicts short overall and disease-free survival, and higher relapse ratę in adult acute
myeloid leukemia: results from cancer and leukemia group B study 8461. J Clin Oncol. 2004; 22:
2410-2418.
14. Delaunay J, Vey N, Leblanc T. i wsp. Prognosis of inv(16)/t(16;16) acute myeloid leukemia (AML):
a survey of 110 cases from the French AML Intergroup. Blood 2003; 102: 462-469.
15. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gaber JA. i wsp. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene
transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease.
Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia.
Leukemia 1999; 13: 1901-1928.
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
21
16. Schoch C, Heferlach T, Hasse D. i wsp. Patients with de novo acute myeloid leukaemia and
complex karyotype aberrations show a poor prognosis despite intensive treatment: study of 90 patients. Br
J Haematol. 2001; 112: 118-126.
17. Linker CA. Autologous stem celi transplantation for acute rayloid leukemia. Bonę Marrow
Transplant. 2003; 31: 731-738.
18. Cornelissen JJ, Lówenberg B. Role of Allogeneic Stem Celi Transplantation in Current Treatment
of Acute Myeloid Leukemia. Haematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2005; 151 — 155.
19. Tosi P, Visani G, Ottaviani E, Testoni N, Pallacani A, Tura S. Inv (16) acute myeloid leukemia
cells show an increased sensitivity to cytosine arabinoside in vitro. Eur. J Haematol. 1998; 60:161 — 165.
20. Kocki J, Constantinau M, Cioch M. i wsp. Molecular diagnostic of promyelocytic leukaemia.
J Appl Genet. 2003; 44: 553-556.
21. Lo Coco F, Diverio D, Awisati G. i wsp. Therapy of molecular relapse in acute promyelocytic
leukemia. Blood 1999; 94: 2225-2229.
22. Braess J, Jahns-Streubel C, Schoch D. i wsp. Proliferative activity of leukaemic blasts and cytosine
arabinoside pharmacodynamics are associated with cytogeneticaly defined prognostic subgroups in acute
myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2001; 113: 975-982.
23. Byrd J.C, Ruppert A.S, Mrozek K. i wsp. Repetitive cycles of high-dose cytarabine benefit patients
with acute myeloid leukemia and inv(16)(pl3q22) or t(16;16) (pl3;q22): results from CALGB 8461. J Clin
Oncol. 2004; 21 1087-1094.
24. Guerrasio A, Pilatrino C, De Micheli D. i wsp. Assessment of minimal residual disease (MRD) in
CBFbeta/MYHll-positive acute myeloid leukemias by qualitative and quantitative RT-PCR amplification of fusion transcripts. Leukemia 2002; 16: 1176-1181.
25. Fleischman EW, Baturina J.A, Sokova OJ. i wsp. Letter to the Editor: Prognostic significance of
AML1-ETO fusion transcript expression in children and young adults with t(8;21) acute myeloid
leukemia. Haematologica 2003; 8& 1078-1079.
26. Krauter J, Gvrlich K, Ottmann O. i wsp. Prognostic value of minimal residual disease
quantification by real-time reverse trascriptase polymerase chain reaction in patients with core binding
factor lukemias. J Clin Oncol. 2003; 21: 4413-4422.
27. Reading CL, Estey EH, Huh YO. i wsp. Expresion of unusual immunophenotype combination in
acute myelogenous leukaemia. Blood 1993; 81: 3083-3090.
28. Andrieu V, Radford Weiss J, Troussard X. i wsp. Molecular detection of t(8;21)/AMLl-ETO in
AML M1/M2: correlation with cytogenetics, morphology and immunophenotype. Br J Haemtol. 1996; 92:
885-865.
29. Graf M, Reif S, Hecht K. i wsp. High expression of costimulatory molecules correlates with Iow
relapse-free survival probability in acute myeloid leukemia (AML). Ann Hematol. 2005; 84: 287—297.
30. Minucci S, Maccarana M, Cioce M. i wsp. Oligomerization of RAR and AML1 transcription
factors as a no vel mechanism of oncogenic activation. Mol Celi. 2000; 5: 811 — 820.
31. Liu Yin JA. Minimal residual disease in acute myeloid leukaemia. Best Pract Res Clin Haematol.
2002; 15: 119-135.
3Z Tobal K, Liu Yin JA. Monitoring of minimal residual disease by quantitative reverse transcriptase
polymerase chain reaction for AML- MTG8 transcripts in AML M2 with t(8;21). Blood 1996; 88: 37043709.
33. Tobal K, Newton M, Macheta M. i wsp. Molecular quantification of minimal residual disease in
acute myeloid leukemia with t(8;21) can identify patients in durable remission and predict clinical relapse.
Blood 2000; 95: 815-819.
34. Morschhauser F, Cayela JM, Martini S. Evaluation of minimal residual disease using reverse
transcription polymerase chain reaction in t(8;21) acute myeloid leukemia: a multicenter study of 51
patients. J Clin Oncol. 2000; 18: 788-792.
35. Marcucci G, Caligiuri MA, Bloomfield CD. Core binding factor (CBF) acute myeloid leukemia: is
molecular monitoring by RT-PCR useful clinically?. Eur. J. Haematol. 2003; 71: 143-154.
36. Ravandi F, Kadkol SS, Bruno A, Dodge C, Lindgren V. Molecular identification of CBFBMYH11 fusion transcripts in an AML M4Eo patient in absence of invl6 or other abnormality of
cytogenetic and FISH analyses - a rare occurrence. Leukemia 2003; 17: 1907-1910.
22
A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
37. Buonamici S, Ottaviani E, Testoni N. i wsp. Real time quantitation of minimal residual disease in
inv (16)-positive acute myeloid leukemia may indicate risk for clinical relapse and may identify patients in
a curable state. Blood 2002; 99: 443-449.
38. Pandolfi PP. Oncogenes and tumor suppressors in the molecular pathogenesis of acute
promyelocytic leukemia. Hum Mol Genet. 2001; 10: 769-775.
39. Diveiro D, Rossi V, Awisati G. i wsp. Early detection of relapse by prospective reverse
transcriptase-polymerase chain reaction analysis of the PML/RARa fusion gene in patients with acute
promyelocytic leukemia enrolled in the GIMEMA-AIEOP multicenter „AIDA" trial. Blood 1998; 92:
784-789.
40. Soignet SL, Maślak P, Wang ZG. i wsp. Complete remission after treatment of acute promylocytic
leukemia with arsenie trioxide. N Engl J Med. 1998; 339: 1341-1348.
41. Lo-Coco F, Romano A, Mengarelli A. i wsp. Allogeneic stem celi transplantation for advanced
acute promyelocytic leukemia: results in patients treated in second molecular remission or with
moleculary persistent disease. Leukemia 2003; 17: 1930-1933.
42. Meloni G, Diverio D, Vignetti G i wsp. Autologous bonę marrow transplantation for acute
promyelocytic leukemia in second remision: prognostic relevance of pretransplant minimal residual
disease assesment by reverse-transcription polymerase chain reaction of the PML/RAR alpha fusion gene.
Blood 1997; 90: 1321-1325.
43. de Botton S, Fawz A, Chevret S. i wsp. Autologous and allogeneic stem-cell transplantation
as salvage treatment of acute promyelocytic leukemia initially treated with all-trans-retinoic acid:
a retrospective analysis of the European acute promyelocytic leukemia group. J Clin Oncol. 2005; 23:
120-126.
44. Sainty D, Liso V, Cantu-Rajnoldi A. i wsp. A new morphologic classification system for acute
promyelocytic leukemia distinguishes cases with underlying PLZF/RARA gene rearrangements. Blood
2000; 96: 1287-1296.
45. Behm F.G. Classification of Acute Leukemias. Ching-Hon P (red). Treatment of Acute Leukemia.
New Directions for Clinical Research. Humana Press, New Jersey 2003; p52.
46. Schnittger S, Schoch C, Kern W. FLT3 length mutations as marker for follow-up studies in acute
myeloid leukaemia. Acta Haematol. 2004; 112: 68-78.
47. Dastugue N, Payen C, Laffage- Pochitaloff M. i wsp. Prognostic significance of karyotype in de
novo adult acute myeloid leukemia. Leukemia 1995; 9:1491-1498.
48. Ma ESK, Wan TSK. +6 or trisomy 6. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. June 2004 URL:
http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Anomalies/tri6ID1013.html
49. Jonveaux P, Fenaux P, Berger R. Trisomy 6 as the sole chromosome abnormality in myeloid
disorders. Cancer Genet Cytogenet 1994; 74: 150-152.
50. Van Dyke D.L. -Y,Y loss in leukemia. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol, 2001, URL
http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Anomalies/YlossID1089.html
51. Wiktor A, Rybicki BA, Piao ZS. Clinical significance of Y chromosome loss in hematologie
disease. Genes Chromosomes Cancer 2000; 27: 11 — 16.
52 Bilhou-Nabera C. 12p abnormalities in myeloid malignancies. Atlas Genet Cytogenet Oncol
Haematol. 1998. URL, http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Anomalies/12pmyelo.html
53. Streubel B, Sauerland C, Heil G. Corelation of cytogenties, molecular cytogentic, and clinical
findings in 59 patients with ANLL or MDS and abnormalities of the short arm of chromosome 12. Br
J Haemtol. 1998; 100: 521-533.
54. Drobyski WR. The role of allogeneic transplantation in high-risk acute myelogenous leukemia.
Leukemia 2004; 18: 1565-1568.
55. Visani G, Bernasconi P, Boni M. i wsp. The prognostic value of cytogeneties in reinforced by the
kind of induetion/consolidation therapy in influencing the outeome of acute myeloid leukemia analysis of
848 patients. Leukemia 2001; 15: 903-909.
Znaczenie prognostyczne aberracji genetycznych w OBS
23
56. Schaich M, Harbich-Brutscher E, Pascheberg U. i wsp. Association of specyfic cytogenetics
aberrations with mrdl gene expression in adult myloid leukemia and its implication in treatment
outcome. Haematologica 2002; 87: 455-464.
57. Braess J, Voss S, Jahns-Streubel G. i wsp. The pharmacodynamic basis for the increased
anti-leukaemic eflicacy of cytosine arabinoside-based treatment regimens in acute myeloid leukaemia with
a high endogenous proliferation ratę. Br J Haematol. 2000; 110: 170-179.
58. Kolb EA, Steinherz PG. A new multidrag reinduction protocol with topotecan, vinorelbina,
thiotepa, dexamethasone, and gemcytabine for relapsed or refractory acute leukemia. Leukemia 2003; 17:
1967-1972.
59. HofFman WK, Heil G, Zander C. i wsp. Intensive chemotherapy with idarubicin, cytarabine,
etoposide, and G-CSF priming in patients with advanced mylodysplastic syndrome and high-risk acute
myeloid leukemia. Ann Hematol. 2004; 83: 498-503.
60. Wrzesień-Kuś A, Robak T, Wierzbowska A. i wsp. A milticenter, open, noncomparative, phase II
study of the combination of cladribine (2-chlorodeoxyadenosine), cytarabine, granulocyte colonystimulating factor and mitoxantron as induction therapy in refractory acute myloid leukemia: a report of
the Polish Adult Leukemia Group. Ann Hematol. 2005; 84: 557-564.
61. Feldman EJ, Brandwein J, Stone R. i wsp. Phase III randomized multicenter study of humanized
ant CD33 monoclonal antibody, lintuzumab, in combination with chemotherapy, versus chemotherapy
alone in patients with refractory or first-relapsed acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 2005; 23:
4110-4116.
62. Chevallier P, Roland V, Mahe B.i wsp. Administration of mylotarg 4 days after beginning of
a chemotherapy including intermediate-dose aracytin and mitoxantron (MIDAM regimen) produces
a high ratę of complete hematologie remission in patients with CD33 4- primary resistant or relapsed
acute myeloid leukemia. Leuk Res. 2005; 29: 1003-1007.
63. Huret JL. Ilq23 rearrangements in leukaemia. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol, 2003.
URL: http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Anomalies/llq23ID1030.html
64. Schoch C, Schnittger S, Klaus M, Kem W, Hiddemann W, Haferlach T. AML with Ilq23/MLL
abnormalities as defined by the WHO elassification: incidence, partner chromosomes, FAB subtype, age
distribution, and prognostic impact in an unselected series of 1897 cytogenetically analyzed AML cases.
Blood; 101- 2395-2402.
65. Mitterbauer-Hohendanner G, Mannhalter C. The biological and clinical significance of MLL
abnormalities in haematological malignancies. Eur J Clin Invest. 2004; 34: 12—24.
66. Huret JL. inv(3Xq21q26),t(3;3)(q21;q26),ins(3;3)(q26;q21q26). Atlas Genet Cytogenet Oncol Hae
matol, 1997, URL: http://wwwinfobiogen.fr/services/chromcancer/Anomalies/inv3.html
67. Grigg A.P, Gascoyne R.D, Phillips G.L, Horsman D.E. Clinical, haematological and cytogenetic
features in 24 patients with structural rearrangments of the Q arm of chromosome 3. Br J Haematol. 1993;
83: 158-165.
68. Madahar CJ, Levin M, Roy J, Conti M. Translocation (3;3) in a patient with thrombocytopenia
and erythroid dysplasia. Cancer Genet Cytogent 1996; 87: 11-13.
69. Fonatasch C, Gudat H, Lengfelder E. i wsp. Correlation of cytogentic findings with clinical
faetures in 18 patients with inv (3)(q21;q26) or t(3;3)(q21;q26). Leukemia 1994; 8: 1318-1326.
70. Shi G, Weh HJ, Duhrsen U, Zeller W, Hossfeld DK. Chromosomal abnormality inv(3Xq21q26)
associated with multilineage hematopoietic progenitor cells in hematopoietic malignancies. Cancer Genet.
Cytogenet 1997; 96: 58-63.
71. Jenkins RB, Tefferi A, Solberg LA. Jr, Dewald GW. Acute leukemia with abnormal thrombopoiesis and inversion of chromosome 3. Cancer Genet Cytogenet. 1989; 39: 167 — 179.
72. Jotterand Bellomo M, Parlier V, Muhlematter D, Grób JP, Beris P. Three new cases of
chromosome 3 rearrangement in bands q21 and q26 with abnormal thrombopoiesis bring further evidence
to the existence of a 3q21q26 syndrome. Cancer Genet Cytogenet. 1992; 59: 138-60.
24
A. EJDUK, M. MAJEWSKI, K. WARZOCHA
73. Huret JL. t(6;9)(p23;q34). Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol, 1998. URL:
http://www.infobiogen.fr/services/chromccer/Anolalies/t0609.html
74. Lillington D.M, MacCallum P.K, Lister T.A, Gibbons B. Translocation t(6;9)(p23q34) in acute
leukemia without myelodysplasia or basophilia: two cases and review of the literaturę. Leukemia 1993; 74:
527-531.
75. Pearson MG, Vardiman JW, Le Beau MM. i wsp. Incresed numbers of marrow basophils may be
associated with a t(6;9) in ANLL. Am J Hematol. 1985; 18: 393-403.
76. Slovak ML, Kopecky KJ, Cassileth PA. i wsp. Karyotypic analysis predicts outcome of
preremission and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia: a Southwest Oncology
Group/Eastern Coopertive Oncology Group Study. Blood; 96: 4075—4083.
Praca wpłynęła do Redakcji 28.02.2006 r. i została zakwalifikowana do druku 24.03.2006 r.
Adres Autorów:
Klinika Hematologii
Instytut Hematologii i Transfuzjologii
ul. Chocimska 5
00-957 Warszawa