CZÊŒÆ PRAKTYCZNA ÆWICZENIA
Transkrypt
CZÊŒÆ PRAKTYCZNA ÆWICZENIA
ĆWICZENIE NR 1 Drożdże – część praktyczna A. Budowa komórki drożdżowej i fizjologia drożdży Cel ćwiczenia Poznanie budowy komórek drożdży i ich fizjologii. Wykonanie 1. Badania makroskopowe Rozróżnianie wybranych szczepów drożdży piwowarskich, gorzelniczych i piekarskich Na podłożu płynnym należy zwrócić uwagę na : • • • występowanie osadu na dnie pożywki, gazowanie (ostrożne wstrząśnięcie płynu), tworzenie się kożuszka, błonki lub pierścienia na powierzchni płynu. Na podłożu stałym po określonym czasie hodowli w temp. 200C należy zwrócić uwagę na: • • • rodzaj wzrostu (jednolity nalot lub pojedyncze kolonie), powierzchnię wzrostu (matowa, błyszcząca) i strukturę kolonii (zwarta, mazista), zabarwienie i kształt kolonii. 2. Badania mikroskopowe Obserwacje mikroskopowe: kształtu, wielkości, sposobu ułożenia oraz rozmnażania komórek. Preparaty wykonuje się z jedno dobowych kultur hodowanych na podłożu płynnym w temp. 300C. Preparaty mikroskopowe różnych ras drożdży: winiarskich, piwowarskich, gorzelniczych, piekarskich. 2.1.Badanie żywotności drożdży — polega na zabarwieniu ich wodnym roztworem błękitu metylenowego. Na szkiełku przedmiotowym do kropli badanych drożdży dodaje się roztworu barwnika, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i ogląda pod mikroskopem. Komórki martwe barwią się na niebiesko, natomiast żywe pozostają niezabarwione. 2.2.Badanie obecności glikogenu — przeprowadza się podobnie, jak badanie na żywotność z tym, że do barwienia używa się płynu Lugola. Komórki zawierające glikogen będą zabarwione na kolor ciemnobrunatny, natomiast pozostałe na jasnożółty. 3. Oznaczanie ilości komórek w 1 cm3 gęstwy drożdżowej Sporządza się szereg rozcieńczeń gęstwy drożdżowej (1:10, 1:50, 1:100) z udziałem wody destylowanej i KOH (7 cm3 H2O + 2 cm3 5 % KOH + 1 cm3 gęstwy drożdżowej). Materiał po dokładnym wymieszaniu nanosi się pipetą na komorę Thoma i liczy pod mikroskopem komórki drożdży przy powiększeniu 100-500 razy. 1 B. Drożdże piekarnicze Cel ćwiczenia Poznanie metod badań drożdży piekarskich prasowanych i suszonych, ocena technologiczna drożdży. Wykonanie 4. Sprawdzanie masy drożdży piekarskich suszonych Zawartość opakowania zważyć z dokładnością do 0,1 g – porównać z deklarowaną masą netto. 5. Określenie barwy Barwę badanej rozproszonym. próbki należy określać wzrokowo przy świetle dziennym 6. Określenie zapachu Należy przeprowadzić w pomieszczeniu pozbawionym obcych zapachów, zapach drożdży piekarskich prasowanych należy określić bezpośrednio po skrojeniu wierzchniej warstwy cegiełki, a zapach drożdży piekarskich suszonych, paszowych i piwowarskich — natychmiast po otwarciu opakowania. 7. Określenie konsystencji Cegiełkę drożdży należy nagnieść lekko palcem w środku bocznej powierzchni; konsystencja powinna być ścisła, dopuszcza się zewnętrzną mazistość, jeśli nie jest połączona z przykrym zapachem rozkładającego się białka. 8. Oznaczanie zawiesiny wodnej Do probówki szklanej wrzucić grudkę drożdży (około 1 g na 20 cm3) pobraną z wnętrza cegiełki, dodawać porcjami wodę do około połowy pojemności probówki z korkiem. Obserwować zawiesinę po całkowitym wymieszaniu — zawiesina powinna być jednorodna, w ciągu 5 min nie powinna wykazywać grudek ani kłaczków na dnie probówki. 9. Oznaczanie zawartości suchej masy W naczyńku wagowym, wysuszonym w temp. 1050 C do stałej masy i uprzednio zważonym, odważyć około 1g drożdży z dokładnością do 0,001 g. Naczyńko otwarte wraz z przykrywką umieścić w suszarce na 1,5–2h, w temp. 55– 600C lub pod lampą promiennikową. Następnie otwarte naczyńko ponownie umieścić w suszarce, w temp.1050C na 1h. Oznaczenie uważa się za zakończone, jeśli różnica masy po kolejnym dosuszeniu nie przekracza 0,001g. 10. Kwasowość drożdży Rozpuścić 10g drożdży w 50 cm3 wody destylowanej i otrzymaną zawiesinę miareczkować 0,1 M NaOH wobec fenoloftaleiny. Wynik podać w cm3 1 M NaOH na 100g drożdży. 2 11. Oznaczanie czasu podnoszenia ciasta 5g drożdży odważyć w zlewce, na wadze technicznej z dokładnością do 0,01 g. Sporządzić 160 cm3 roztworu soli kuchennej o stężeniu 2,5%. Przenieść odważone drożdże za pomocą przygotowanego roztworu (ogrzanego do temp. 350C) do 280 g mąki ogrzanej w cieplarce do temp. 350C, uprzednio wsypanej do miesiarki. Zanotować czas dodania drożdży do ciasta. Następnie miesić ciasto przez 5min po czym przenieść do foremki ogrzanej do temp. 350C, wysmarowanej wewnątrz olejem jadalnym. Ciasto rozłożyć równomiernie w foremce, zawiesić poprzeczkę i natychmiast wstawić foremkę do cieplarki. Ciasto pozostawić w cieplarce do chwili, gdy dotknie ono poprzeczki (1 pęd). Następnie wyjąć foremkę z cieplarki i w ciągu 1min ugniatać ciasto w miesiarce lub ręcznie, i ponownie umieścić w foremce. Zawiesić poprzeczkę i wstawić całość do cieplarki. Gdy ciasto dotknie poprzeczki, zanotować czas (2 pęd) i powtórzyć wykonane czynności dla trzeciego pędu. 12. Oznaczanie aktywności sacharolitycznej drożdży 0,5g drożdży prasowanych, rozprowadzić w 10 cm3 wody wodociągowej o temp. 350C. Do otrzymanej zawiesiny dodać 10cm3, 10% roztworu sacharozy ogrzanego do temp. 350C. Następnie postępować według metody A lub B, w zależności od dostępnego wyposażenia. A) Kolbę zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkę odprowadzającą CO2 do wyskalowanej biurety wypełnionej wodą i wstawić do termostatu (350C). Mierzyć czas wydzielenia 10cm3 CO2 Miarą aktywności sacharolitycznej jest ilość cm3 CO2 wydzielona przez 0,1 g s.s. drożdży w ciągu 1 godz. B) Kolbę zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkę fermentacyjną napełnioną gliceryną, zważyć całość z dokładnością 0,01g, a następnie wstawić do cieplarki (350C) na okres 1 godziny. Znając różnicę mas przed i po fermentacji obliczyć ilość wydzielonego CO2 [cm3]. Aktywność sacharolityczną podać jako ilość cm3 CO2 wydzielonych przez 0,1g s.s (suchej substancji) drożdży w ciągu 1 godz., wiedząc, że 1 mol CO2 = 44,0g odpowiada objętości 22,4 dm3. 3 13. Bezpośrednie liczenie komórek drożdży w zawiesinie. Liczenie przy użyciu komór. Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem mają postać szklanych płytek z wyciętym wgłębieniem podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni. Używane są komory Thoma (hemocytometr), Howarda, Bürkera, Fuch Rosenthala i inne. Różnią się one wymiarami powierzchni, na których liczy się drobnoustroje. Dane dotyczące powierzchni i głębokości podane są na komorach. W komorach można zasadniczo liczyć tylko większe komórki drobnoustrojów, takie jak drożdże, zarodniki i strzępki grzybów. Ograniczenia te wynikają po pierwsze stąd, że grubość i głębokość komory nie pozwalają na użycie obiektywów o dużej sile powiększenia, a więc tym samym o małej odległości roboczej i po drugie przy dużej głębokości komory (100 mikrometrów = 0,1 mm) małe drobnoustroje np. bakterie o średnicy 5 mikrometrów (µm), mogą układać się w wielu płaszczyznach i przy użyciu silniejszych obiektywów o małej głębi ostrości część komórek położona nad i pod płaszczyzną pola widzenia będzie niewidoczna. Komorę Thoma przedstawia rysunek 3. Jest to grube szkiełko przedmiotowe z wyciętymi wgłębieniami o głębokości 0,1 mm (100 µm). Wgłębienia te widoczne są gołym okiem po obydwu stronach środkowego kanalika jako równoramienne krzyże, powstałe z przecięcia linii wyznaczających regularne, kwadratowe i prostokątne powierzchnie. Bok kwadratu wynosi 1/20 mm (50 µm). Powierzchnia kwadracika wynosi więc 1/400 mm2 (2500 µm2). W każdej siatce znajduje się 400 kwadracików. Po przykryciu komory szkiełkiem przykrywkowym nad każdym kwadracikiem powstaje prostopadłościan o objętości 1/400 mm2 x 0,1mm = 1/4000 mm3 (2500 µm x 100 µm3 = 25 000 µm3). Co piąty kwadrat w obu kierunkach podzielony jest na pół dodatkową linią, w wyniku czego część kwadratów ma powierzchnię o połowę mniejszą, a cała komora podzielona jest w ten sposób na 16 dużych kwadratów, z których każdy składa się z 16 małych kwadracików. Na przecięciu dodatkowych linii powstają maleńkie kwadraciki o czterokrotnie mniejszej powierzchni równej 1/1600 mm2 . Na powierzchni komory Thoma wyżłobione są trzy kanaliki tworzące literę H, dwa poprzeczne i jeden środkowy, łączący je. Mają one za zadanie zatrzymywać nadmiar płynu naniesionego na komorę. Oznaczanie liczby drobnoustrojów przy użyciu komory Thoma wykonuje się następująco. Zawiesinę komórek drożdży mających tendencję do zlepiania się rozcieńcza się, biorąc 5 objętości zawiesiny i 1 objętość kwasu siarkowego rozcieńczonego wodą w stosunku 1:10, wytrząsa się kilka minut, przenosi szybko do komory Thoma, przykrywa szkiełkiem przykrywkowym i przystępuje do liczenia. Po ustawieniu oświetlenia, należy znaleźć siatkę komory najpierw przy obiektywie 10x, a następnie przy obiektywie 40x. Jeśli stwierdzi się zbyt duże zagęszczenie drobnoustrojów, to należy próbę rozcieńczyć ilościowo, np. 10-krotnie i powtórzyć oznaczenie. Oblicza się średnią liczbę drobnoustrojów z ok. 40 małych kwadracików (o pow. 1/400 mm2). W sumie należy policzyć ok. 700 komórek, by błąd nie przekroczył 10%. Komórki rozmieszczone są nierównomiernie, w jednych kwadracikach może być ich kilka, a w innych - kilkanaście. Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i rozcieńczeniu (n), zawartość komórek (L) w 1 cm3 wynosi: L = 4 • 106 • a • n Rysunek 3. Komora Thoma: a – widok z góry, b – widok z boku, c– wgłębienie z naciętymi kwadratami, c' – siatka kwadratów w powiększeniu 4