Diagnostyka molekularna w OIT

Diagnostyka molekularna
w OIT
BARBARA ADAMIK
KATEDRA I KLINIKA ANESTEZJOLOGII I
INTENSYWNEJ TERAPII
UNIWERSYTET MEDYCZNY WE WROCŁAWIU
DNA
RNA
Białko
Diagnostyka molekularna w OIT
 Niska czułość metod mikrobiologicznych - brak identyfikacji
patogenu krwi w 50-70% przypadków ciężkiej sepsy.
 Długi czas oczekiwania na wynik badania mikrobiologicznego .
 Przedłużona/niewłaściwa
antybiotykoterapia empiryczna jest
związana z rozwojem szczepów opornych oraz ze zwiększoną
śmiertelnością.
Diagnostyka molekularna w OIT wymagająca hodowli patogenów
Metoda
diagnostyczna
Liczba patogenów
identyfikowanych
PNA FISH
Fluorescencja + hybrydyzacja
10
ACCU PROBE
chemiluminescencja + sondy DNA
5
HYPLEX
PCR + hybrydyzacja
10
Prove-it Sepsis
PCR + mikromacierze
64
PLEX-ID BAC
PCR +spektroskopia
> 300
MALDI-TOF
PCR +spektroskopia
> 300
Verigene
mikromacierze
Gram(+) / Gram (-)
Diagnostyka molekularna w OIT wymagająca hodowli patogenów
Metoda
diagnostyczna
Liczba patogenów
identyfikowanych
PNA FISH
Fluorescencja + hybrydyzacja
10
ACCU PROBE
chemiluminescencja + sondy DNA
5
HYPLEX
PCR + hybrydyzacja
10
Prove-it Sepsis
PCR + mikromacierze
64
PLEX-ID BAC
PCR +spektroskopia
> 300
MALDI-TOF
PCR +spektroskopia
> 300
Verigene
mikromacierze
Gram(+) / Gram (-)
Diagnostyka molekularna z pominięciem etapu hodowli patogenów
Metoda diagnostyczna
Liczba patogenów
możliwych do identyfikacji
System GeneExpert
RT-PCR
1-2 / 1 godz.
LightCycler SeptiFast
RT-PCR
25 / 6 godz
VYOO
PCR + elektroforeza
34 / 7 godz.
MagicplexTM Sepsis
RT-PCR
91 / 8 godz.
SepsiTest
PCR + elektroforeza
+ sekwencjonowanie
>300 / 8 godz
Standardowa hodowla i identyfikacja
Verigene
HYPLEX
Prove-it Sepsis
PLEX-ID BAC
MALDI-TOF
PNA FISH
SepsiTest
MagicplexTM Sepsis
VYOO
LightCycler SeptiFast
GeneExpert
0
10
20
30
czas [godz.]
40
50
60
Diagnostyka molekularna w OIT
Żywe komórki bakterii/grzybów
Komórki bakterii/grzybów w fagocytach
Martwe komórki bakterii/grzybów
Wolne DNA bakterii i grzybów
tętnica/żyła
Diagnostyka molekularna w OIT
Badanie molekularne składa się z trzech etapów:
1.
2.
3.
Ekstrakcja i oczyszczenie DNA
Amplifikacja lub hybrydyzacja fragmentu DNA
Identyfikacja fragmentu DNA
1. Ekstrakcja i oczyszczenie DNA
2. Amplifikacja lub hybrydyzacja fragmentu DNA
PCR (Polymerase Chain Reaction)
3. Identyfikacja fragmentu DNA
Diagnostyka molekularna w OIT
System GeneExpert

Prosty i szybki w użyciu
system diagnostyczny
POCT

Test oparty na metodzie
RT-PCR

Pozwala na identyfikację
pojedynczych patogenów
System GeneXpert
Detekcja MRSA i SA (wymaz z nosa)
Detekcja MRSA i SA (+BC)
Detekcja MRSA i SA (wymaz ze skóry i z tkanek miękkich)
Detekcja RNA Enterowirusów (PMR)
Detekcja DNA Streptococcus grupy B (wymaz z pochwy, odbytu)
Detekcja C. difficile (kał)
Detekcja Mycobacterium tuberculosis , wrażliwość na rifampicynę
(plwocina)
Detekcja wirusa grypy (plwocina)
System GeneXpert
Zalety
Wady
POCT
ograniczone menu
prosty w użyciu, w pełni
zautomatyzowany
brak możliwości jednoczesnej analizy
wielu patogenów
Diagnostyka gruźlicy, grypy,
Detekcja C. difficile
brak możliwości określania
antybiotykooporności
szybki
koszt
Diagnostyka molekularna w OIT
System MagicplexTM Sepsis
Pathogen DNA extraction
from whole blood
2h
Amplification on PCR
2, 5 h
Screening
30 min
Identification
30 min
Gram (+) bacteria screening for:
40 Streptococcus spp.
3 Enterococcus spp.
30 Staphylococcus spp.
Drug resistance screening for
mecA, vanA, vanB
Gram (-) bacteria screening for
12 pathogens
Fungi screening for 6 pathogens
Charakterystyka pacjentów (N=117)
Wiek [lata]
60 ± 17 (18-92)
Płeć M/K (%)
81 / 36 (70/30)
APACHE II przy przyjęciu
26 ± 8 (9-40)
Diagnoza przy przyjęciu na OIT
Zapalenie otrzewnej
44
Ostre zapalenie trzustki
3
Niewydolność oddechowa
36
Niewydolność nerek
12
Po przeszczepieniu wątroby
5
Uraz komunikacyjny
6
Neuroinfekcja
2
Infekcja wewnątrzmaciczna
1
Inne
8
Ciężka sepsa n(%)
29 (25)
Wstrząs septyczny n(%)
88 (75)
Długość pobytu w OIT [dni]
Śmiertelność [%]
24 ± 24 (2-107)
40
Magicplex PCR
Hodowla
dodatni
16%
dodatni
49%
ujemny
51%
ujemny
51%
ujemny
33%
System MagicplexTM Sepsis
Zalety
Wady
pozwala na jednoczesną identyfikację 91 tylko 91 patogenów w menu
różnych patogenów oraz mecA, VanA, VanB
identyfikacja patogenów grzybiczych
częściowo zautomatyzowany
lista patogenów odpowiada warunkom
epidemiologicznym OIT
wymaga 3 oddzielnych pomieszczeń
identyfikacja patogenów bezpośrednio z
krwi pobranej od pacjenta
brak możliwości określania
antybiotykooporności
test dokładny i czuły
koszt
szybki, badanie trwa 8 godz.
Diagnostyka molekularna w OIT
 SepsiTest - możliwość jednoczesnej detekcji i identyfikacji ponad 300
patogenów bakteryjnych i grzybiczych.
 Badanie jest wykonywane w materiale pobranym bezpośrednio od
pacjenta.
 Test
oparty na reakcji PCR, sekwencjonowaniu
identyfikacji patogenu za pomocą baz danych on line.
amplikonu
i
SepsiTest - materiał do badań
Krew pobrana bezpośrednio od pacjenta
Krew z hodowli
PMR, BAL, mocz
Wymazy z ran
Wydzielina z drenu
Tkanki
1. Pobranie krwi
2. Ekstrakcja
3. PCR
Bazy danych genów
dostępne on line
(BLAST/FASTA)
5. Sekwencjonowanie
6. Identyfikacja patogenu
4. Elektroforeza
8 godzin
System SepsiTest
Zalety
Wady
pozwala na jednoczesną identyfikację > 300 koszt
patogenów
identyfikacja patogenów grzybiczych
duże wymogi sprzętowe
identyfikacja patogenów bezpośrednio z
materiału pobranego od pacjenta
wymaga oddzielnych pomieszczeń
test dokładny i czuły
brak możliwości określania
antybiotykooporności
szybki, badanie trwa 8 godz.
Badania przesiewowe Stosowane u pacjentów
Nosicielstwo MRSA
wysokiego ryzyka
Diagnoza
Do potwierdzenia diagnozy
TB, grypa, sepsa
Prognozowanie
Do oceny ciężkości stanu lub
ryzyka nawrotu choroby
(OncoType Dx)
Wybór i
monitorowanie
terapii
Monitorowanie skuteczności
terapii
Gram +/ Gram –
Sepsa, nawrót choroby,
sepsa grzybicza
Ocena ryzyka
Badania molekularne
wspomagają tradycyjne
czynniki ryzyka
GenOSept - badanie
genetycznych
predyspozycji na sepsę
GENOSEPT (Genetics of Sepsis and septic shock in Europe)
badanie genetycznych predyspozycji na sepsę
1. genetyczne predyspozycje na sepsę / zachorowalność
2. genetyczne predyspozycje na sepsę / śmiertelność
3. genetyczne predyspozycje na sepsę / zróżnicowanie odpowiedzi na leczenie
sepsy
4. genetyczne predyspozycje na sepsę / płeć
5. ustalenie standardów postępowania dla genotypowania w kier. predyspozycji
na sepsę
Start Date / End Date:
2005-01-01 / 2008-12-31
Project Cost:
3114228 euro
Project Status:
Completed
www.genosept.eu
Liesenfeld et al. Eur J Microbiol Immunol. 2014; 4(1): 1–25