Obsługa programu Data Analysis

Transkrypt

ANALIZA WIDM MASOWYCH
OBSŁUGA PROGRAMU DATA ANALYSIS
(Bruker Daltonics)
W ramach przedmiotu: Metody fizykochemiczne (L)
I rok Mgr Chemia biologiczna
Prowadzący mgr Karolina Radziszewska
Prowadzący:
mgr Karolina Radziszewska
© 2012 Karolina Radziszewska
1
DATA ANALYSIS 3.4 (Bruker Daltonics)
Oprogramowanie kompatybilne ze spektrometrami masowymi firmy
Oprogramowanie kompatybilne ze spektrometrami masowymi firmy Bruker Daltonics
Wymagana licencja użytkownika
Dostęp z komputerów Laboratorium Spektrometrii Mas Wydziału Chemii UWr
(LW‐07)
Po wala na anali ę widm masowych apisanych w formacie .baf
Pozwala na analizę widm masowych zapisanych w formacie *.baf
2
IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF
Każdy folder zawierający widma masowe oznaczony jest rozszerzeniem *.d
Wewnątrz możemy znaleźć następujące pliki:
Zawiera dane dotyczące metody pomiaru
Główny plik zawierający widmo masowe
Pliki pomocnicze
3
Aby otworzyć widmo masowe należy dwukrotnie kliknąć LP myszy na ikonie:
lub zaimportować dane bezpośrednio z poziomu programu uruchamiając go z Paska programów:
z Paska programów:
pojawi się okno startowe
pojawi się okno startowe…
4
…a następnie główne okno programu
5
…lub w wersji 4.0
6
Aby zaimportować widmo masowe klikamy FILE na pasku głównym:
Następnie OPEN:
I z odpowiedniego folderu wybieramy
Interesujące nas widmo masowe:
7
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
Zaimportowane widmo masowe zarejestrowane na aparacie micrOTOF‐Q zapisane jest w formie chromatogramu:
Zależność prądu jonowego TIC (ang total ion current) current)
Zależność prądu jonowego TIC (ang. total
od czasu trwania pomiaru
8
Aby przekształcić chromatogram na uśrednione widmo masowe należy kursor myszy ustawić na początku osi czasu w obszarze chromatogramu, a następnie trzymając wciśnięty PP myszy przeciągnąć kursor do końca linii chromatogramu:
droga kursora myszy
droga kursora myszy
Miejsce ustawienia kursora i wciśnięcia PP myszy
i wciśnięcia PP myszy
Miejsce zwolnienia y y
PP myszy
9
Pojawia się dodatkowe okno, w którym znajduje się uśrednione przez nas widmo masowe:
10
Aby móc przeprowadzić analizę na danym widmie masowym należy najpierw je skopiować.
W tym celu klikamy PP myszy w obszarze widma – pojawia się okno, w którym LP myszy klikamy COPY TO COMPOUND MASS SPECTRA:
11
Nasze uśrednione widmo masowe zostało skopiowane:
12
W tej chwili w programie mamy otwarte cztery okna:
Chromatogram
Lista otwartych plików wraz ze składowymi
Uśrednione widmo masowe
Skopiowane widmo k i
id
masowe
13
Do dalszej pracy zamykamy Chromatogram i Uśrednione widmo masowe:
KLIK
14
Tak powinno prezentować się główne okno programu:
15
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Widmo masowe przedstawia zależność m/z czyli masy związku do jego ładunku (oś X) wraz z intensywnością danego sygnału dla odpowiedniej wartości m/z (oś Y):
Intensywność
Wartości m/z
16
Na widmie obserwujemy wiele sygnałów (pików) pochodzących od jonów związków o określonej wartości m/z:
Wartość m/z
17
Jednak obserwujemy również sygnały o niskiej intensywności, dla których nie ma przypisanych wartości m/z. Aby je dokładnie obejrzeć musimy powiększyć obszary widma:
Sygnały o niskich yg y
intensywnościach
18
W tym celu możemy skorzystać z narzędzia powiększania na dwa sposoby.
Kliknąć LP myszy w ikonę LUPY na pasku narzędzi – zmiana kursora na krzyżyk z lupą:
19
Przy pomocy tak zmienionego kursora z wciśniętym LP myszy otaczamy sygnał bądź obszar, który chcemy powiększyć:
20
Po czym puszczamy LP myszy i otrzymujemy widmo powiększone w wybranym przez nas zakresie:
21
Powiększanie możemy powtarzać wielokrotnie do odpowiadającej nam skali, jednak za każdym razem należy na nowo uruchomić narzędzie LUPY przez jego zaznaczenie:
Wskazówka:
Narzędzie lupy uruchomić można również poprzez przytrzymanie lewego klawisza Shift poprzez przytrzymanie lewego klawisza Shift
na klawiaturze. W momencie kiedy go trzymamy narzędzie działa i pozwala na wielokrotne powiększanie.
22
Innym sposobem zmiany zakresu na widmie jest przesuwanie osi X.
Gdy będziemy przesuwali skalę z wciśniętym LP myszy przesuwać się będzie cały zakres:
23
Gdy będziemy przesuwali skalę z wciśniętym PP myszy będziemy rozszerzać dany zakres:
24
Aby powrócić do wcześniejszego widoku całego widma wystarczy w jego obszarze dwukrotnie kliknąć LP myszy lub po wciśnięciu PP myszy wybrać z listy AUTO‐SCALING:
25
Wartości m/z podane są z dokładnością do miejsc dziesiętnych. Na takim sygnale ciężko jest określić wartość ładunku, dlatego należy zwiększyć dokładność m/z. W tym celu klikając PP myszy wybieramy DISPLAY PARAMATERS a następnie zwiększamy
W tym celu klikając PP myszy wybieramy DISPLAY PARAMATERS…, a następnie zwiększamy wartość w polu MASS PRECISION. Wskazówka:
ją
j
Podając 3 miejsca po przecinku możemy poprawnie określić wartość ładunku w danym sygnale y yg
na widmie.
26
Na widmie masowym pojawiają się wartości z dokładnością do 3 miejsc po przecinku:
27
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Wybierzmy jeden sygnał na widmie i przypiszmy mu ładunek:
28
Po powiększeniu danego piku obserwujemy:
Piki izotopowe
Piki izotopowe
Pierwszy pik:
yp
Pik monoizotopowy
29
Taki układ pików izotopowych, z których pierwszy pik monoizotopowy nie jest najbardziej intensywny, wskazuje na dużą cząsteczkę (najczęściej polipeptyd lub białko) bądź na układ zawierający dodatek izotopów pierwiastków, np. deuter.
Piki izotopowe
Pierwszy pik:
Pierwszy
pik:
Pik monoizotopowy
30
Na pierwszy rzut oka wydaje się, że kolejne piki izotopowe dzieli różnica 0,2. Aby to dokładnie sprawdzić wykorzystujemy narzędzie ANNOTATION >>> ANNOTATE.
Przy kursorze pojawia się litera „A”.
31
Po ustawieniu kursora – trójkąt poniżej kursora, na odpowiednim piku i trzymając wciśnięty LP myszy przesuwamy go na kolejny pik. Po zwolnieniu LP myszy pojawia się wartość –
różnica między kolejnymi pikami izotopowymi na widmie.
32
Wykonując tę czynność na wszystkich pikach uzyskujemy średnią wartość różnicy między pikami izotopowymi jako 0,200.
33
Aby wyłączyć narzędzie wchodzimy w ANNOTATION i odznaczamy ANNOTATE.
Innym sposobem na uruchamianie narzędzia ANNOTATE
y p
ę
w trakcie analizy widma y
masowego jest wykorzystanie klawisza Alt na klawiaturze. Wciśnięcie i przytrzymanie powoduje aktywność funkcji ANNOTATE. Gdy puścimy klawisz Alt nadal możemy analizować widmo przy użyciu normalnego kursora.
Aby przypisać ładunek musimy widzieć, że różnica między pikami izotopowymi jest od niego ściśle zależna. I tak dla ładunku:
+1 +2 +3 +4 +5 +6 +7 +8 +9 +10 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 1,000
różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,500
34
Zatem w naszym przypadku skoro różnica wynosi 0,200 to sygnał odpowiada cząsteczce o ładunku 5+.
35
Innym sposobem przypisania ładunków sygnałom na widmie masowym jest wykorzystanie odpowiedniego narzędzia, który przypisuje te wartości w sposób automatyczny.
W tym calu wchodzimy do zakładki DECONVOLUTE, a następnie PARAMETERS:
36
Wybieramy zakładkę MASS LIST a w niej typ Peak finder: SNAP
Narzędzie to pozwala na przypisanie ładunku dla cząsteczek o naturalnym rozkładzie izotopowym (bez dodatków innych izotopów, np. deuteru).
Pozostawiamy wartości ustawione Pozostawiamy
wartości ustawione
standardowo, jedynie w przypadku Maximum charge state jeśli spodziewamy się że widmo
jeśli spodziewamy się, że widmo masowe przedstawia dużą cząsteczkę wielokrotnie naładowaną, np. białko, warto zwiększyć tę wartość do np. 15.
warto zwiększyć tę wartość do np. 15.
Zatwierdzamy parametry klikając OK.
yp
y
ją
37
Aby wykonać dekonwolucję widma w celu przypisania ładunku w zakładce DECONVOLUTE
klikamy w MASS SPECTRA lub wybieramy F4 na klawiaturze. Po chwili na widmie pojawią się wartości ładunków, jeśli nie wchodzimy w zakładkę MASS LIST klikamy CLEAR a następnie FIND. © 2012 Karolina Radziszewska
38
Narzędzie automatycznego przypisania ładunku pozwala na analizę całego widma masowego i oszacowanie ilości i rodzaju związków obecnych na widmie.
39
W tym przypadku mamy do czynienia z widmem masowym jednego związku o wysokiej masie cząsteczkowej ok. 4000 Da. Świadczy o tym charakterystyczna obwiednia, tj. seria sygnałów odpowiadających kolejnym ładunkom od 3+ do 7+.
Wskazówka:
Taki układ pików j
na widmie jest charakterystyczny dla widm ESI dużych peptydów lub białek.
40
ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU
Mając przypisane ładunki do odpowiednich sygnałów na widmie oraz wiedząc, które z nich pochodzą od jednego związku możemy obliczyć średnią masę cząsteczkową.
I tak dla wcześniej wyznaczonego ładunku 5+:
k dl
ś
ł d k
Wartość piku monoizotopowego m/z wynosi
Ładunek czyli z wynosi
5
Dla ogólnego równania: 824.043
m/z = (Mcz+z)/z
Mcz = m/z*z – z
Zatem:
Mcz = 824.043*5 – 5 = 4115.215 Da
Aby wyznaczyć średnią masę cząsteczkową należy obliczyć masy dla poszczególnych Aby
wyznaczyć średnią masę cząsteczkową należy obliczyć masy dla poszczególnych
ładunków, a następnie wyznaczyć średnią. I tak:
3+
4+
5+
6+
7+
4115.229 Da
4115.229
Da
4115.220 Da
4115.215 Da
4115.220 Da
4115.216 Da
Mśrednia = 4115.220 Da
41
Innym sposobem wyznaczania średnich mas cząsteczkowych, w przypadku widm ESI dla peptydów i białek, jest wykorzystanie wzoru:
p1 = (M + z)/z
p2 = (M + z‐1)/(z‐1)
(
)/( )
gdzie: p – oznacza wartość m/z piku danego związku dla kolejnych ładunków
p1
p2
42
Wyznaczenie średniej masy cząsteczkowej można wykonać automatycznie w programie wybierając metodę dekonwolucji. Powoduje ona przekształcenie widma masowego z zależności od m/z na zależność od masy.
Wchodzimy w zakładkę DECONVOLUTE
h d
kł dk
>>> PARAMETERS
Następnie zakładkę CHARGE DECONVOLUTION i bi
i wybieramy opcję MAXIMUM ENTROPY
j MAXIMUM ENTROPY
Ustalamy zakres mas
Wskazówka:
Wcześniejsze oszacowanie masy na podstawie ładunku pozwoli na wybranie węższego zakresu mas, a co za tym idzie szybszą dekonwolucję widma.
Zatwierdzamy OK.
Z t i d
OK
43
Aby uruchomić dekonwolucję widma klikamy DECONVOLUTE >>> MASS SPECTRA
Lub z klawiatury F4. Po przeliczeniu pojawia się nowe widmo masowe przedstawiające zależność od masy cząsteczkowej:
d
l
ść d
k
44
Po powiększeniu najwyższego sygnału możemy odczytać wartość masy cząsteczkowej:
Jednak wciąż mamy wiele wartości mas, które należy uśrednić.
45
Aby to zrobić wchodzimy w zakładkę PROCESS >>> SMOOTH MASS SPECTRUM
Narzędzie to służy do wygładzania widma tak, aby tworzyło ono jeden pik o uśrednionej wartości
b
ł
d
k
ś d
ś
masy cząsteczkowej.
Należy zmienić parametr SMOOTHING WIDTH
d t ki j
do takiej wartości, aby na widmie mieć tylko jeden t ś i b
id i
i ć t lk j d
poszerzony sygnał.
Zwykle wystarczy już wartość 0.5.
Po zatwierdzeniu OK
otrzymujemy wygładzone widmo.
46
Odczytujemy uśrednioną masę cząsteczkową:
47
ANALIZA WIDM MASOWYCH – DODATKOWE INFORMACJE
Na widmie masowym oprócz sygnałów pochodzących od głównego związku obserwuje się także piki pochodzące od innych składników mieszaniny. Często są to zanieczyszczenia wynikające z użytych rozpuszczalników, bądź produkty uboczne wcześniejszych reakcji. Zwykle charakteryzują się one niższą intensywnością sygnałów na widmie –
kl h k
ś
łó
d
ich zawartość h
ść
w analizowanej próbce jest mniejsza, bądź mają mniejszą zdolność do jonizacji.
48
ANALIZA WIDM MASOWYCH – DODATKOWE INFORMACJE
Często obok pików, odpowiadających głównemu produktowi, znajdują się dodatkowe sygnały pochodzące od adduktów jonów sodu lub potasu do cząsteczki.
Na+
23 Da
K+
39 Da
Należy pamiętać, że dodanie jonu metalu powoduje jonizację związku bez udziału H+.
49
ANALIZA WIDM MASOWYCH – INFORMACJE STRUKTURALNE
Typowe widmo ESI‐MS dostarcza informacji o rodzaju, wzorze sumarycznym i masie cząsteczkowej związku. Aby uzyskać informacje na temat jego struktury należy wykonać widma fragmentacyjne MS/MS. Podstawowym typem są widma CID
d
d
(
(ang. collision
ll
induced
d d dissociation) –
d
) fragmentacji f
wywołanej zderzeniowo. W wyniku zderzeń obojętnego gazu z cząsteczkami analizowanej substancji, do których dochodzi w komorze kolizyjnej spektrometru mas, otrzymujemy charakterystyczne widmo masowe.
h kt
t
id
50
Fragmentacja związków metodą CID prowadzi do powstania jonów fragmentacyjnych z wcześniej wybranego przez nas jonu obserwowanego na widmie masowym.
W wyniku fragmentacji dochodzi do rozerwania wiązań w cząsteczce z utworzeniem y
g
j
ą
ą
odpowiednich jonów potomnych – fragmentów cząsteczki.
W przypadku peptydów i białek otrzymuje się następujące rodzaje fragmentów:
51
W przypadku peptydów i białek fragmentacja CID prowadzi do powstania jonów fragmentacyjnych określonego typu. W ich skład wchodzą reszty aminokwasowe o następujących masach monoizotopowych: © 2012 Karolina Radziszewska
52
ANALIZA WIDM MASOWYCH – WIDMA FRAGMENTACYJNE
Na widmie masowym ESI‐MS zaobserwowaliśmy sygnał pochodzący od głównego produktu. Chcąc określić strukturę związku możemy poddać go fragmentacji typu MS/MS:
Jon prekursorowy
53
Na widmie masowym ESI‐MS zaobserwowaliśmy sygnał pochodzący od głównego produktu. Chcąc określić strukturę związku możemy poddać go fragmentacji typu MS/MS:
Jony fragmentacyjne
54
Możemy wyznaczyć ładunki dla odpowiednich fragmentów stosując wcześniej opisaną procedurę SNAP:
55
Wykorzystując narzędzie ANNOTATION możemy wyznaczyć rodzaje reszt aminokwasowych znajdujących się w łańcuchu. Wystarczy zmienić typ na:
Korzystając z wartości różnic odległości między sygnałami
możemy wyciągać wnioski odnośnie budowy cząsteczki
d ś i b d
ki
poddanej fragmentacji:
Obecne straty neutralne Ob
t t
t l
17 Da oraz 18 Da.
Obecność reszt Obecność
reszt
aminokwasowych
Ala oraz Lys.
56
Przeprowadzenie analizy fragmentacyjnej pozwala na wyciągnięcie wielu wniosków odnośnie budowy cząsteczki. Umożliwia m.in.:
określenie sekwencji aminokwasowej w peptydzie,
wskazanie miejsc modyfikacji,
potwierdzenie struktury związku,
d
k
k
wykrycie produktów ubocznych reakcji i ich zidentyfikowanie.
W zależności od rodzaju związku poddanego analizie otrzymuje się różnego rodzaju jony fragmentacyjne często charakterystyczne dla danej grupy
fragmentacyjne, często charakterystyczne dla danej grupy. Analiza fragmentacyjna powinno zatem być indywidualnie dobrana do rodzaju
Analiza fragmentacyjna powinno zatem być indywidualnie dobrana do rodzaju analizowanego związku.
57
WARUNKI ZALICZENIA
Wykonanie analizy widma masowego dla nieznanej próbki przy pomocy Wykonanie
analizy widma masowego dla nieznanej próbki przy pomocy
programu Data Analysis przedstawione w formie sprawozdania pisemnego.
T
Termin oddania sprawozdań –
i dd i
d ń 7 dni od daty zajęć laboratoryjnych
7d i dd t
j ćl b t j h
POWODZENIA POWODZENIA
☺
58

Obsługa programu Data Analysis

Transkrypt

Podobne dokumenty

Analiza syntetycznych dopalaczy metodami FT-IR - Spectro-Lab