Sposób wytwarzania wirusa oraz sposób wytwarzania

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
PL
214284
(13) B1
(11)
(21) Numer zgłoszenia: 374782
(22) Data zgłoszenia: 08.07.2003
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(54)
08.07.2003, PCT/EP03/007341
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
(51) Int.Cl.
C12N 7/00 (2006.01)
A61K 39/12 (2006.01)
C12N 5/07 (2010.01)
C12N 5/10 (2006.01)
C12N 5/00 (2006.01)
15.01.2004, WO04/005493
Sposób wytwarzania wirusa oraz sposób wytwarzania immunogennej kompozycji
zawierającej wirusa albo antygen wirusa
(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:
BAXTER INTERNATIONAL, INC., Deerfield, US
BAXTER HEALTHCARE S.A., Wallisellen, CH
09.07.2002, US, 60/394,243
(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
31.10.2005 BUP 22/05
MANFRED REITER, Wiedeń, AT
WOLFGANG MUNDT, Wiedeń, AT
LEOPOLD GRILLBERGER, Wiedeń, AT
BARBARA KRAUS, Wiedeń, AT
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.07.2013 WUP 07/13
(74) Pełnomocnik:
PL 214284 B1
rzecz. pat. Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk
2
PL 214 284 B1
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania wirusa oraz sposobu wytwarzania immunogennej kompozycji zawierającej wirusa albo antygen wirusa z wykorzystaniem pożywki wolnej od białka zwierzęcego obejmującej kombinację hydrolizatu soi i hydrolizatu drożdży. Sposoby te umożliwiają
prowadzenie hodowli bez obecności białka zwierzęcego. Te sposoby są użyteczne w hodowli komórek, takich jak komórki rekombinowane lub komórki zakażone wirusem i do wytwarzania produktów
biologicznych w trakcie hodowli komórkowych.
Tło wynalazku f
Dla prowadzenia hodowli komórek, w szczególności komórek eukariotyczych, a bardziej konkretnie komórek ssaków, istnieje potrzeba stosowania specjalnych pożywek hodowlanych, które zapewniają substancje odżywcze i odżywcze substancje wzrostowe niezbędne dla wydajnego wzrostu
komórek oraz do wytwarzania pożądanych białek lub wirusów. Pożywki do hodowli komórek uzupełnia
się rozmaitymi dodatkami, włączając w to składniki niezdefiniowane, takie jak płodowa surowica cielęca (FCS), szereg białek pochodzenia zwierzęcego i/lub hydrolizaty pochodzenia bydlęcego.
Zasadniczo, surowica i substancje pochodzące z surowicy, takie jak albumina, transferyna lub
insulina, mogą zawierać niepożądane czynniki, które mogą zanieczyszczać hodowle oraz otrzymywane z tych hodowli produkty biologiczne. Ponadto, dodatki ludzkiej surowicy muszą być każdorazowo
poddawane badaniu pod kątem wszystkich znanych wirusów, włączając w to wirus zapalenia wątroby
i HIV, które mogą być przenoszone przez surowicę. Surowica bydlęca i substancje z niej pochodzące,
na przykład trypsyna, niosą ryzyko wystąpienia zanieczyszczenia BSE. Dodatkowo, wszystkie produkty pochodzące z surowicy mogą być zanieczyszczone nieznanymi czynnikami. W przypadku surowicy
albo dodatków białkowych, które pochodzą od człowieka albo z innych źródeł zwierzęcych w hodowli
komórkowej, istnieją liczne problemy (np. zróżnicowana jakość i skład różnych partii i ryzyko zanieczyszczenia mykoplazmą, wirusami lub BSE), szczególnie, jeżeli komórki są stosowane do wytwarzania czynników medycznych albo szczepionek do podawania ludziom.
Mając powyższe na uwadze dokładano licznych starań, aby dostarczyć wydajny system gospodarza i warunki hodowania, które nie wymagają obecności surowicy lub innych składników pochodzących z białek zwierzęcych. Prosta, wolna od surowicy pożywka zawiera zazwyczaj pożywkę podstawową, witaminy, aminokwasy, sole organiczne i nieorganiczne, lecz może zawierać również dodatkowe składniki do wytwarzania złożonej pożywki odżywczej. Takie pożywki są jednak niejednokrotnie
odżywczo niewystarczające i muszą być uzupełniane różnymi dodatkami białkowymi pochodzenia
zwierzęcego albo zrekombinowaną wersją białek stosowanych w hodowli komórkowej, takimi jak insulina, insulino-podobny czynnik wzrostu i inne czynniki wzrostu.
Dla uniknięcia stosowania zwierzęcych dodatków białkowych w pożywce hodowlanej wolnej od
surowicy, podjęto kilka prób opracowania pożywek użytecznych do hodowli komórek, które są całkowicie wolne od białek.
Cinatl i wsp., Cell Biology International 17:885-895 (1993) ujawnili opracowanie pożywki (PFK-1)
specyficznej dla ciągłego namnażania komórek VERO w hodowli powierzchniowej na poliwinyloformalu (PVF, od ang. polyvinyl formal).
W opisie WO 96/15231 ujawniono wolną od surowicy pożywkę składającą się z syntetycznej
minimalnej niezbędnej pożywki i ekstraktu drożdży do hodowli komórek kręgowców i procesu wytwarzania wirusów.
Wytwarzanie pożywki składającej się z podstawowej pożywki do hodowli komórek zawierającej
peptyd z ryżu i ekstrakt z drożdży albo produkt jego trawienia enzymatycznego i/lub lipid roślinny do
hodowli komórek zwierzęcych opisano w publikacji WO 98/15614.
Pożywka zawierająca oczyszczony hydrolizat soi do hodowli komórek zrekombinowanych jest
ujawniona w opisie WO 01/23527.
Publikacja WO 00/03000 opisuje pożywkę, która zawiera hydrolizat soi i ekstrakt drożdżowy,
lecz wymaga dodatkowo obecności zrekombinowanych postaci białek zwierzęcych, takich jak czynniki
wzrostu.
Dla zapewnienia wydajnego wytwarzania produktów biologicznych, takich jak wirusy lub zrekombinowane białka, ważne jest, żeby osiągnięta została optymalna gęstość hodowli w celu uzyskania maksymalnej wydajności produktu.
A zatem, wciąż istnieje w dziedzinie zapotrzebowanie na opracowanie sposobów hodowli zapewniających zwiększenie wzrostu, aktywności metabolicznej i gęstości komórek oraz na dostarczenia
PL 214 284 B1
3
optymalnej pożywki hodowlanej, wolnej od białek zwierzęcych, użytecznej do wytwarzania produktów
biologicznych, takich jak te wykorzystywane w produkcji leków lub szczepionek do stosowania u ludzi.
Ponadto, późniejsza obróbka, np. oczyszczanie pożądanego produktu z pożywki hodowlanej może
być bardziej wydajne pod względem kosztów i czasu, jeżeli białka zwierzęce nie są obecne w pożywce. Dodatkowo, niepożądane immunogenne białka zwierzęce mogą wywoływać szkodliwe reakcje
immunologiczne, których unika się przy wykonywaniu niniejszego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wirusa, obejmujący:
dostarczanie hodowli komórek VERO, które były hodowane w wolnej od białka zwierzęcego pożywce obejmującej hydrolizat soi w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 0,3% (wag./obj.),
zakażanie komórek wirusem, i
inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa.
Korzystnie wirus jest wybrany z grupy obejmującej wirus grypy, wirus krowianki i ospy krowiej,
wirus ospy drobiu, wirus ospy krów, wirus kleszczowego zapalenia mózgu (TBE, od ang. tick-borne
encephalitis), wirus polio, wirus zapalenia wątroby A, wirus Ross River, wirus żółtej gorączki i pochodzące od niego wirusy chimerowe, wirus zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus różyczki, wirus zapalenia wątroby C (HCV), wirus świnki, wirus odry, wirus oddechowy (RSV od ang. respiratory syncytial virus), wirus opryszczki pospolitej (HSV, od ang. herpes
simplex virus), cytomegalowirus (CMV), wirus Epsteina-Barra (EBV), rotawirus, wirus pryszczycy
(FMDV, od ang. foot and mouth disease virus).
Korzystnie, komórkami są komórki VERO, a wirus jest wybrany z grupy wirusa grypy, wirusa
TBE, wirusa krowianki, wirusa polio, wirusa zapalenia wątroby A, wirusa Ross River, wirusa żółtej
gorączki i pochodzących od niego wirusów chimerowych, wirusa zapalenia mózgu zachodniego Nilu,
wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa różyczki, HCV, wirusa świnki, wirusa odry, wirusa oddechowego, HSV, CMV, EBV, rotawirusa.
W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku hydrolizat soi i hydrolizat drożdży
jest poddawany oczyszczaniu, szczególnie korzystnie na drodze ultrafiltracji.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania kompozycji immunogennej zawierającej wirusa albo antygen wirusa obejmującego:
dostarczanie hodowli komórek VERO, które były hodowane w wolnej od białka zwierzęcego pożywce zawierającej hydrolizat soi i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 1% (wag./obj.)
i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 0,3% (wag./obj.),
zakażanie komórek wirusem,
inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa, zebranie wytworzonego wirusa
albo antygenu wirusa,
wytworzenie kompozycji immunogennej z zebranego wirusa albo antygenu wirusa.
Korzystnie, zebrany wirus albo antygen wirusa jest poddawany oczyszczaniu.
W korzystnej postaci sposób według wynalazku obejmuje: zakażanie komórek wirusem wybranym z grupy ortomiksowirusów, paramiksowirusów, reowirusów, pikornawirusów, flawiwirusów, arenawirusów, wirusów opryszczki, wirusów ospy, koronawirusów i adenowirusów,
inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa, zebranie wytworzonego w ten
sposób wirusa albo antygenu wirusa, i
wytworzenie kompozycji immunogennej z zebranego wirusa albo antygenu wirusa.
W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku hydrolizat soi i hydrolizat drożdży
jest poddawany oczyszczaniu, szczególnie korzystnie na drodze ultrafiltracji.
Te i inne aspekty niniejszego wynalazku będą oczywiste dla specjalisty w dziedzinie w świetle
zamieszczonego poniżej opisu.
Termin „pożywka wolna od białka zwierzęcego” w jego różnych formach gramatycznych, dotyczy pożywki, która nie jest uzupełniona białkami i składnikami białkowymi z wyższych wielokomórkowych Eukaryota innych niż rośliny (tj. kręgowców), które posiadają struktury drugorzędowe, trzeciorzędowe i czwartorzędowe charakterystyczne dla białek występujących w naturze. Typowe białka,
których obecności w pożywce unika się, to te znajdujące się w surowicy i substancjach pochodzących
z surowicy, takich jak albumina, transferyna, insulina i inne czynniki wzrostu. Według wynalazku unika
się również wersji białek zwierzęcych wytwarzanych przez rekombinowanie DNA, które mogą zawierać immunogenne składniki bakteryjne i nie są one obecne w pożywce wolnej od białka zwierzęcego
według wynalazku. Zwierzęce białka i składniki białkowe odróżnia się od białek niezwierzęcych, małych
4
PL 214 284 B1
polipeptydów i oligopeptydów, które można otrzymać z roślin (zwykle o długości około 10-30 aminokwasów), takich jak soja, oraz niższych Eucaryota, takich jak drożdże. Oczywiście po doprowadzeniu
do kontaktu albo zaszczepieniu pożywki komórkami, które mają być namnażane, pożywka będzie
zawierała białka zwierzęce wydalane albo wydzielane przez te komórki, włączając w to dowolne zrekombinowane białka wyrażane przez zmodyfikowane genetycznie komórki, jeżeli takie komórki są
hodowane. A zatem nie traktuje się terminu pożywka wolna od białka zwierzęcego oraz wytwarzanych
przy jej użyciu materiałów i preparatów jako wymaganie nieobecności białek wydalanych albo wydzielanych przez komórki namnażanie w pożywce, a dotyczy on natomiast braku bezpośredniego uzupełnienia pożywki zwierzęcymi białkami i składnikami białkowymi otrzymanymi ze źródeł zwierzęcych lub
temu podobnych wytwarzanych przez rekombinowanie DNA.
Termin „pożywka podstawowa”, w jego różnych formach gramatycznych, to pożywka syntetyczna, taka jak DMEM, HAM's F12, Medium 199 lub RPMI albo ich kombinacje oraz inne, które są znane
z piśmiennictwa albo są dostępne handlowo. Według wynalazku, każda pożywka syntetyczna, która
nie zawiera białek zwierzęcych może być zastosowana w połączeniu z hydrolizatem soi i w połączeniu
z hydrolizatem drożdży. Pożywka podstawowa może zawierać wiele składników, włączając w to aminokwasy, witaminy, sole organiczne i nieorganiczne, źródła węglowodanu, gdzie każdy składnik jest
obecny w ilości, która podtrzymuje hodowlę komórek in vitro. Przykładowo, jako pożywkę podstawową
można użyć pożywki DMEM/HAM's F12 (1:1). Pożywka może zawierać dodatkowe substancje, takie
jak substancje buforowe, jak biwęglan sodowy, stabilizatory utleniania, stabilizatory przeciwdziałające
stresowi mechanicznemu albo inhibitory proteaz. Jeżeli trzeba, do pożywki można dodawać niejonowe
środki powierzchniowo czynne (surfaktanty), takie jak glikol polipropylenowy, (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 lub PLURONIC F-108) jako czynniki przeciw
pienieniu. Czynniki te stosuje się zwykle w celu ochrony komórek przed negatywnymi efektami napowietrzania, ponieważ bez dodawania środka powierzchniowo czynnego wznoszące się i rozrywające
pęcherzyki powietrza mogą prowadzić do uszkodzenia tych komórek, które znajdują się na powierzchni tych pęcherzyków powietrza (ang. „sparging”). Korzystne jest, jeżeli ilość niejonowego środka powierzchniowo czynnego wynosi około 0,05 i około 10 g/l, typowo pomiędzy około 0,1 i około
5 g/l. Dodatkowo, pożywka może również zawierać cyklodekstrynę lub jej pochodne, typowo pomiędzy
około 0,001 g/l i około 1 g/l.
Zgodnie z wynalazkiem pożywka zawiera hydrolizat soi i hydrolizat drożdży, które mogą być
dodane do pożywki podstawowej. Termin „hydrolizat” obejmuje produkt trawienia enzymatycznego
peptonu sojowego albo ekstraktu drożdżowego. Hydrolizat można otrzymać z rozmaitych preparatów,
odpowiednio, peptonu sojowego albo ekstraktu drożdżowego, które mogą być dalej trawione enzymatycznie (na przykład przez papainę) i/lub wytwarzane przez autolizę, termolizę i/lub plazmolizę. Hydrolizaty można również nabyć na przykład jako Hy-Soy, Hy-Yeast 412 i Hi-Yeast 444, ze źródeł takich
jak Quest International, Norwich, New York, OrganoTechnic, S.A. France, lub Deutsche Hefewerke
GmbH, Germany. Źródła ekstraktów drożdżowych zostały ujawnione również w opisie WO 98/15614.
Źródła ekstraktów drożdży i hydrolizatów soi są opisane także w publikacji WO 00/03000.
Korzystne jest, jeżeli hydrolizaty stosowane w pożywce według wynalazku są oczyszczone
z surowej frakcji, ponieważ korzystne jest wyeliminowanie w trakcie oczyszczania zanieczyszczeń,
które mogłyby przeszkadzać w wydajnej hodowli, co poprawia jakość hydrolizatu. Oczyszczania można dokonywać przez ultrafiltrację albo chromatografię na złożu Sephadex na przykład Sephadex G25
lub Sephadex G10 albo równoważnych materiałach, chromatografię jonowymienną, chromatografię
powinowactwa, sączenie molekularne albo chromatografię z „odwróconymi fazami”. Te procesy są
znane w tej dziedzinie. Przy zastosowaniu tych sposobów można wybrać frakcje, które zawierają hydrolizat soi lub drożdży, o określonej masie cząsteczkowej, korzystnie ≤1000 Daltonów, korzystniej
≤500 Daltonów, jeszcze korzystniej ≤350 Daltonów. Korzystne jest, jeżeli co najmniej 90% hydrolizatu
ma masę cząsteczkową ≤1000 Daltonów. Korzystne jest, jeżeli średnie masy cząsteczkowe hydrolizatów soi i drożdży wynoszą między około 220 i 375 Daltonów. Wartość pH hydrolizatu soi i hydrolizatu
drożdży powinna być między około 6,5 i 7,5. Zawartość azotu powinna wynosić, odpowiednio, między
około 8 i 11%, korzystnie między 9,0 i 10,0% a zawartość popiołu ≤18%. Korzystny hydrolizat charakteryzuje się taką właściwością, że ma zawartość wolnych aminokwasów pomiędzy 5 i 30%. Zawartość
endotoksyny, jeśli w ogóle taka jest, powinna być <500 jedn./g.
Jedna z pożywek użytecznych w praktycznej realizacji wynalazku ma następujący skład: syntetyczna pożywka minimalna (pożywka DMEM/HAM's F12 (1:1) (1-25 g/l), hydrolizat soi (0,5-10 g/l)
PL 214 284 B1
5
i hydrolizat drożdży (0,5-3 g/l), L-glutamina (0,05-1 g/l), NaHCO3 (0,1-10 g/l). pH pożywki wynosi pH
6,8 i 7,6, korzystnie między pH 7,0 i 7,3.
Dla specjalisty w dziedzinie będzie oczywistym, że termin „około” w kontekście wartości liczbowych i zakresów dotyczy wartości lub zakresów, które dążą lub są zbliżone do przytoczonych wartości
lub zakresów, tak, że wynalazek można wykonywać zgodnie z zamierzeniem, na przykład aby uzyskać pożądany stopień wzrostu, co jest oczywiste z zawartych tu wskazówek i ma zastosowanie do
wszystkich wartości. A zatem termin ten obejmuje wartości poza nimi, będące wynikiem systematycznego błędu.
Twórcy niniejszego wynalazku niespodziewanie stwierdzili, że pożywka podstawowa wolna od
białka zwierzęcego uzupełniona hydrolizatem drożdży i hydrolizatem soi jest bardziej korzystna dla
tempa wzrostu komórek, komórkowej aktywności metabolicznej i ostatecznej gęstości komórek
w porównaniu z pożywkami opisanymi uprzednio. Było to tym bardziej zadziwiające w świetle ujawnienia z WO 98/15614 pokazującego, że wyższe stężenia peptydu roślinnego są mniej optymalne.
W pożywce wolnej od białka zwierzęcego według wynalazku zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi jak tu opisano, komórki wykazywały wyższe tempo wzrostu, większą ostateczną gęstość komórek w biomasie i zwiększoną aktywność metaboliczną (wyrażaną jako zużycie tlenu w % na min.)
w porównaniu z pożywką zawierającą bądź sam hydrolizat soi bądź hydrolizat drożdży, nawet jeżeli
końcowe stężenie hydrolizatu drożdży lub hydrolizat soi dodawanego osobno do pożywki było równoważne sumie stężenia łącznego hydrolizatu. Przykładowo, stężenie końcowe około 0,4% (wag./obj.)
samego hydrolizatu drożdży w pożywce miało efekt hamujący na wzrost komórek i gęstość komórek.
Pożywka zawierająca 0,4% (wag./obj.) lub wyższe hydrolizatu soi nie osiągała wyższej gęstości niż
pożywka zawierająca 0,3% (wag./obj.). Jednakże pożywka zawierającą połączenie hydrolizatu soi
i hydrolizatu drożdży w końcowym całkowitym stężeniu hydrolizatu 0,4% (wag./obj.) wykazywała znaczący wzrost w aktywności metabolicznej komórek, wzroście komórek i ostatecznej gęstości komórek.
Suma ilości hydrolizatu soi i hydrolizatu drożdży w pożywce powinna wynosić zgodnie z wynalazkiem pomiędzy około 0,2% (wag./obj.) i około 0,6% (wag./obj.) z wyższym stosunkiem hydrolizatu
soi w pożywce w porównaniu z hydrolizatem drożdży. Optymalny stosunek pomiędzy hydrolizatem soi
i hydrolizatem drożdży wynosi około 3:1 (soja/drożdże), odpowiednio.
Pożywka stosowana w sposobie według wynalazku, jak opisano niniejszym, może być przydatna do hodowania komórek. Termin „komórki” oznacza ogólne pojęcie i obejmuje hodowanie pojedynczych komórek, tkanek, narządów, komórek owadów, komórek ptaków, komórek ssaków, komórek
naczelnych, ciągłych linii komórkowych, komórek macierzystych i/lub komórek zmodyfikowanych genetycznie, takich jak komórki zrekombinowane wyrażające heterologiczny polipeptyd albo białko. Zrekombinowane komórki obejmują na przykład komórki CHO lub komórki BHK wyrażające heterologiczne polipeptydy albo białka, takie jak czynnik wzrostu albo czynnik krwi. Komórki stosowane niejednokrotnie do hodowania wirusa obejmują komórki VERO i komórki CV-1.
Komórki ssaków przydatne do hodowania w pożywce do hodowli komórek określonej w niniejszym opisie obejmują te pochodzenia ludzkiego, które mogą być komórkami pierwotnymi pochodzącymi z próbki tkanki, szczepami komórek diploidalnych, komórkami stransformowanymi albo wyprowadzonymi liniami komórkowymi. Komórki ssaków mogą obejmować komórki ludzkie, a także inne niż
ludzkie. Komórkami ssaków pochodzenia innego niż ludzkie mogą być komórki nerki małpy, komórki
nerki wołu, komórki nerki psa, komórki nerki świni, komórki nerki myszy, komórki nerki szczura, komórki nerki owcy, komórki nerki chomika, komórki nerki chomika chińskiego i lub komórki zwierzęce
pochodzące z dowolnej tkanki. Konkretnie, komórkami ssaków, które można hodować w takiej pożywce hodowlanej mogą być komórki BSC-1, komórki LLC-MK, komórki CV-1, komórki COS, komórki
COS-1, komórki COS-3, komórki COS-7, komórki VERO, komórki MDBK, komórki MDCK, komórki CRFK, komórki RAF, komórki RK, komórki TCMK-1, komórki LLC-PK, komórki PK15, komórki LLC-RK, komórki MDOK, komórki BHK-21, komórki CHO, komórki 293, komórki NS-1 komórki MRC-5,
komórki WI-38, komórki BHK, komórki 293 i komórki RK. Przykłady komórek zrekombinowanych
obejmują komórki CHO wyrażające na przykład czynnik VIII, FII, FIX, FX, vWF, wszystkie dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie.
Terminy „komórki ciągłe” lub „ciągłe linie komórkowe” (CCL, od ang. continuous cell line), w ich
różnych formach gramatycznych, oznaczają hodowane komórki, które mogą replikować się w nieskończoność i są zdolne do wzrostu w hodowli zawiesinowej lub hodowli na dużą skalę w bioreaktorze. Nieograniczony wzrost CCL umożliwia długotrwałą hodowlę z wystandaryzowanego substratu
komórkowego i niższe koszty. Linie komórek ssaków można wybrać z grupy składającej się z komórek
6
PL 214 284 B1
CHO, komórek COS, komórek VERO, komórek LLC-MK2, komórek NS-1, komórek MDBK, komórek
MDCK, komórek MRC-5, komórek WI-38, komórek BHK, komórek CV-1, komórek nerki szczura (RK)
i innych linii komórkowych ujawnionych w Butler i wsp. BIOS Scientific Publisher str. 1-24 (1992), co
jest tu włączone jako odniesienie. Korzystne jest, jeżeli CCL są przetestowane pod kątem nieobecności szkodliwych czynników, takich jak bakterie, grzyby, mykoplazma, pierwotniaki i wirusy.
Termin „hodowla komórek”, w jego różnych formach gramatycznych, dotyczy komórek hodowanych w zawiesinie, obrotowych butelkach, kolbach i temu podobnych. Terminem tym są również objęte podejścia realizowane na dużą skalę, takie jak bioreaktory, włączając w to hodowle komórek przylegających rosnących w postaci przyczepionej do mikronośników w fermentorach z mieszaniem. Ponadto, możliwe jest również nie tylko hodowanie komórek zależnych od powierzchni, ale również zastosowanie technik hodowli zawiesinowych z wykorzystaniem pożywki jak zdefiniowana w sposobie
według wynalazku. Jeżeli komórki hoduje się na mikronośnikach, mikronośnik można wybrać z grupy
mikronośników w oparciu o dekstran, kolagen, plastik, żelatynę i celulozę oraz inne, jak odpisano
w Butler, Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-303 (1988). Odpowiednie są nośniki porowate, takie jak np. Cytoline® lub Cytopore©, jak również nośniki w oparciu o dekstran, takie jak DEAE-dekstran (Cytodex 1®), dekstran powleczony czwartorzędową aminą (Cytodex 2®) lub nośniki
w oparciu o żelatynę, takie jak dekstran powleczony żelatyną (Cytodex 3®). Nośniki te można otrzymać z Pharmacia.
Pożądane jest, jeżeli hodowla komórek od ampułki do biomasy przebiega w pożywce wolnej od
białka zwierzęcego i utrzymuje się w warunkach pożywki do hodowli w czasie wzrostu komórek i procesie wytwarzania produktu. Zalecane jest użycie komórek, które już zostały przystosowane do pożywki. Stwierdzono, że przy użyciu takich wstępnie przystosowanych komórek można uzyskać nie
tylko zwiększoną wydajność, ale ich stabilność w hodowli jest również wyraźnie zwiększona przez
zastosowanie pożywki określonej w sposobie według wynalazku.
Termin „hodowanie”, w jego różnych formach gramatycznych, dotyczy utrzymywania komórek
in vitro w warunkach umożliwiających wzrost i stałą żywotność. Komórki ssaków hoduje się typowo
w inkubatorze do komórek w temperaturze około 37°C, przy czym pożywka hodowlana ma optymalne
pH w zakresie około 6,8 do 7,6, korzystnie między 7,0 a 7,3. Komórki w hodowli stałej mogłyby mieć
całkowitą wymianę pożywki, co około 2 do 3 dni albo mniej lub bardziej często, jeśli trzeba. Komórki
w hodowli z przepływem (np. w bioreaktorach lub fermentorach) mogą mieć wymianę na świeżą pożywkę ma bazie ciągłego obiegu. Podejścia hodowlane mogą obejmować, w zależności od kontekstu
i potrzeby, rozhodowywanie, pasażowanie i namnażanie komórek.
Wynalazek dostarcza, zatem sposobów hodowania komórek obejmujących etapy hodowania
komórek w pożywce podstawowej zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do
około 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3%
(wag./obj.). Zgodnie z przedmiotem niniejszego wynalazku, komórki hoduje się zarówno małej skali jak
i dużej skali biomasy w pożywce wolnej od białka zwierzęcego. Korzystne jest przeprowadzanie pasażowania i rozhodowywania komórek z wytworzeniem biomasy hodowlanej z wykorzystaniem proteazy
pochodzenia niezwierzęcego, takiej jak Pronaza albo jej oczyszczona frakcja. Jedną z proteaz jest
oczyszczona, trypsyno-podobna frakcja ze Streptomyces griseus (SGT), jak opisano w zgłoszeniu
patentowym USA nr 10/006, 223, włączonym w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy. W celu uniknięcia materiału pochodzenia zwierzęcego w czasie hodowli komórek, a w szczególności w czasie hodowania komórek przylegających, które rosną jako związane z nośnikiem, korzystne
jest, jeżeli nośnikiem jest nośnik syntetyczny albo mikronośnik powleczony materiałem pochodzenia
niezwierzęcego. Na przykład mikronośnik DEAE-dekstran lub dekstran powleczony czwartorzędową
aminą.
Wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania pożywki do hodowli komórek wolnej od
białka zwierzęcego, gdzie komórki hoduje się, rozhodowywuje i pasażuje w warunkach pozbawionych
białek zwierzęcych. Sposób obejmuje etapy dostarczenia wolnej od białka zwierzęcego pożywki zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, hodowania komórek w takiej pożywce, pasażowania
i rozhodowywania takich komórek rosnących w tej pożywce stosując proteazę pochodzenia niezwierzęcego dla uzyskania konfluentnej gęstości komórek i powtarzania etapów rozhodowywania i wzrostu
komórek aż osiągnięta zostanie pożądana ostateczna biomasa hodowli komórek. Sposób obejmuje
hodowlę komórek w pożywce wolnej od białka zwierzęcego, rozhodowywania i pasażowania komórek
stosując proteazę pochodzenia niezwierzęcego, korzystnie oczyszczoną trypsyno-podobną frakcję ze
PL 214 284 B1
7
Streptomyces griseus (SGT). W trakcie hodowania komórek przylegających, które rosną jako związane z nośnikiem, korzystne jest, jeżeli nośnikiem jest nośnik syntetyczny albo mikronośnik powlekany
materiałem pochodzenia niezwierzęcego. Przez połączenie tych etapów można uniknąć stosowania
białek zwierzęcych.
Komórki odpowiednie do hodowli w pożywce wolnej od białka zwierzęcego użytecznej w sposobie wynalazku obejmują między innymi komórki BSC-1, komórki LLC-MK, komórki CV-1, komórki
VERO, komórki MDBK, komórki MDCK, komórki CRFK, komórki RAF, komórki TCMK-1, komórki LLC-PK, komórki PK15, komórki LLC-RK, komórki MDOK, komórki RK, komórki BHK-21, komórki WI- 38,
komórki 293 i komórki MRC-5, lecz nie są do nich ograniczone. Te komórki mogą być zakażone wirusami, takimi jak ortomiksowirus, paramiksowirus, reowirus, pikornawirus, flawiwirus, arenawirus, wirus
opryszczki, wirus ospy, koronawirus, adenowirus i innymi wirusami znanymi specjaliście w dziedzinie.
Konkretnie, wirusem stosowanym do zakażania hodowli komórek może być wirus grypy, wirus krowianki i ospy krowiej, wirus ospy drobiu, wirus ospy krów, wirus kleszczowego zapalenia mózgu (TBE,
od ang. tick-borne encephalitis), wirus polio, wirus zapalenia wątroby A, wirus Ross River, wirus żółtej
gorączki i pochodzące od niego wirusy chimerowe, wirus zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirus
japońskiego zapalenia mózgu, wirus różyczki, wirus zapalenia wątroby C (HCV), wirus świnki, wirus
odry, wirus oddechowy (RSV od ang. respiratory syncytial virus), wirus opryszczki pospolitej (HSV, od
ang. herpes simplex virus), cytomegalowirus (CMV), wirus Epsteina-Barra (EBV), rotawirus, wirus
pryszczycy (FMDV, od ang. foot and mouth disease virus). Jest w zakresie wiedzy specjalisty dziedzinie wybór wirusa i komórek, na których wirusa można namnażać. Komórki można hodować w pożywce i prowadzić hodowlę do osiągnięcia optymalnej gęstości przed zakażeniem odpowiednim wirusem.
Ku zaskoczeniu, hodowla komórek prowadzona i namnażana w pożywce do hodowli komórek wolnej
od białka zwierzęcego według wynalazku wykazuje znaczący wzrost wydajności wytwarzania wirusa.
Przykłady różnych wirusów namnażanych na komórkach hodowanych i utrzymywanych na pożywce
pokazały 2 do 5-krotny wzrost uzysku wirusa w porównaniu z pożywką zawierającą jedynie ekstrakt
drożdżowy. Sprawia to, że taki system hodowli jest bardziej korzystny dla sposobów hodowli komórek
i wytwarzania wirusa niż sposoby znane i opisane uprzednio w stanie techniki.
W korzystnym wykonania wynalazku, komórkami są komórki VERO, a wirus jest wybrany z grupy wybranej spośród wirusa grypy, wirusa TBE, wirusa krowianki, wirusa polio, wirusa zapalenia wątroby A, wirusa Ross River, wirusa żółtej gorączki i pochodzących od niego wirusów chimerowych,
wirusa zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa różyczki,
HCV, wirusa świnki, wirusa odry, wirusa oddechowego, HSV, CMV, EBV, rotawirusa. Można również
stosować inne wirusy, o których wiadomo, że rosną na komórkach VERO.
Wynalazek dostarcza również sposobu użytecznego do wytwarzania wirusa krowianki poprzez
dostarczenie hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek wirusem krowianki i inkubowanie hodowli komórek w celu namnożenia wirusa krowianki. Korzystne jest hodowanie komórek
w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.)
i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Według tego
aspektu wynalazku komórkami mogą być komórki VERO, komórki CV-1, komórki RK, komórki BHK-21, komórki MRC-5 lub dowolna komórka, na której wirus krowianki może rosnąć. Wirusem krowianki
może być naturalnie występujący wirus krowianki, szczepionkowy wirus ospy, wirulentne wirusy krowianki, atenuowane wirusy krowianki i zrekombinowane wirusy krowianki.
Dzięki sposobowi według wynalazku można otrzymywać ortomiksowirus dzięki dostarczeniu
hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej
hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek ortomiksowirusem i inkubowanie hodowli
komórek w celu namnożenia ortomiksowirusa. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Komórkami mogą być komórki
BSC-1, komórki CV-1, komórki VERO, komórki MDBK, komórki MDCK komórki MDOK, komórki BHK-21, komórki WI-38, komórki MRC-5 lub dowolna komórka, na której ortomiksowirus może być namnażany. Ortomiksowirusem może być wirus grypy, takiej jak grypa typu A, B i C.
Sposobem według wynalazku można także otrzymać wirusa Ross River poprzez dostarczenie
hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej
hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek wirusem Ross River i inkubowanie hodowli komórek w celu namnożenia wirusa Ross River. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce
8
PL 214 284 B1
zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat
drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Komórkami mogą być komórki BSC-1, komórki CV-1, komórki VERO, komórki MDBK, komórki MDCK, komórki CRFK, komórki
BHK-21, komórki WI-38, komórki MRC-5 lub dowolna komórka, na której wirus Ross River może być
namnażany.
Podobnie, sposobem według wynalazku można również wytwarzać flawiwirusa poprzez dostarczenie hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek flawiwirusem i inkubowanie
hodowli komórek w celu namnożenia flawiwirusa. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat
drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Flawiwirusem może być
wirus żółtej gorączki albo rekombinanty jego chimerowych pochodnych, wirus japońskiego zapalenia
mózgu, wirus kleszczowego zapalenia mózgu, wirus zapalenia mózgu zachodniego Nilu i wirus zapalenia wątroby C. Zidentyfikowane tu typy komórek można zastosować do namnażania flawiwirusa.
Sposób według wynalazku jest również użyteczny do wytwarzania pikornawirusa przez dostarczenie hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek pikornawirusem i inkubowanie
hodowli komórek w celu namnożenia pikornawirusa. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce
zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat
drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Pikornawirusem może być
wirus polio i wirus zapalenia wątroby A. Zidentyfikowane niniejszym typy komórek można zastosować
do namnażania pikornawirusa.
Wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania kompozycji immunogennych zawierających wirusa albo antygen wirusa obejmujących etapy dostarczenia hodowli komórek zwierzęcych,
gdzie komórki są wybrane z grupy składającej się z komórek nerki małpy, komórek nerki wołu, komórek nerki psa, komórek nerki świni, komórek nerki myszy, komórek nerki szczura, komórek nerki owcy,
komórek nerki królika, komórek nerki chomika i komórek ludzkich, które były hodowane w pożywce
według wynalazku, zakażania komórek wirusem wybranym z grupy składającej się z ortomiksowirusów, paramiksowirusów, reowirusów, pikornawirusów, flawiwirusów, arenawirusów, wirusów herpes,
wirusów ospy, koronawirusów i adenowirusów, inkubowania hodowli komórek w celu namnożenia
wirusa, zebrania wytworzonego wirusa i wytworzenia kompozycji immunogennej z zebranego wirusa.
Wytworzony i zebrany wirus może być oczyszczany przy zastosowaniu metody znanej w tej dziedzinie, takiej jak wymiana jonowa albo sączenie molekularne.
Opisany niniejszym wynalazek będzie lepiej zrozumiały dzięki odniesieniu do następujących,
nieograniczających jego zakresu przykładów, które zamieszczono w niniejszym opisie jedynie w celach ilustracji wynalazku.
Przykłady
Przykład 1
Wytwarzanie pożywki hodowlanej
Pożywkę wolną od białka zwierzęcego wytwarza się z pożywki podstawowej DMEM/HAM's F12
(1:1), która jest uzupełniona solami nieorganicznymi, aminokwasami, witaminami i innymi składnikami.
Dodawane są również biwęglan sodowy (1-3 g/l), L-glutamina (0,1 do 1 g/l) i różne stężenia hydrolizatu sol (Quest Technologies, New York) lub hydrolizatu drożdży (Deutsche Hefewerke, Germany) albo
ich kombinacja.
Przykład 2
Wytwarzanie komórek w pożywce wolnej od białka zwierzęcego
Komórki VERO w pożywce wolnej od białka zwierzęcego
Jako linię komórkową zastosowano komórki VERO (Zielona małpa afrykańska, Cercopthecus
aethiops, nerka). Komórki otrzymano z kolekcji American Type Cell Culture Collection, Rockville, Maryland jako pasaż numer 124 oznaczony jako ATCC CCL 81. Komórki hodowano w różnych pożywkach jak tu opisano.
Komórki z roboczego banku komórek namnażano w kolbach T oraz obrotowych butelkach i systemem mikronośnika przy stosunku rozsiewania 1:6-1:8. Komórki hodowano w 37°C przez 6-8 dni.
Utrzymywano stałe warunki hodowli: nasycenie tlenu 20% +/- 10% i pH 7,1 +/- 0,35. Na zakończenie
wytwarzania biomasy, kiedy komórki osiągnęły wzrost konfluentny, ustalano gęstość komórek i zużycie tlenu.
PL 214 284 B1
9
Liczbę komórek w biomasie hodowli komórkowej na zakończenie wytwarzania biomasy ustalono bądź przez trypsynizację komórek i liczenie przy zastosowaniu licznika komórek CASY® (metoda A), jak opisano w Schärfe i wsp. Biotechnologic in LaborPraxis 10:1096-1103 1988) albo przez
traktowanie kwasem cytrynowym i fioletem krystalicznym, a następnie liczenie w hemocytometrze
(metoda B), jak opisano w Sanford i wsp., J. Nat'I Cancer Inst. 11:773-795 (1951).
Komórki VERO namnażano i hodowano w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej
hydrolizat drożdży w stężeniu 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3% lub 0,4%, 0,5% (wag./obj.) albo hydrolizat soi
w stężeniu 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3% albo 0,4%, 0,5% (wag./obj.) albo hydrolizat soi i hydrolizat drożdży w stężeniu drożdże do soi (drożdże/soja) 0,05%/0,05% (wag./obj.), 0,1%/0,2% (wag./obj.),
0,1%/0,3% (wag./obj.), 0,2%/0,2% (wag./obj.), 0,3%/0,2% (wag./obj.) lub 0,2%/1,0% (wag./obj.). Gęstość komórek w hodowli komórkowej na zakończenie wytwarzania biomasy w pożywce wolnej od
białka zwierzęcego zawierającej różne stężenia hydrolizatu soi, hydrolizatu drożdży lub ich kombinacji
obliczano przy zastosowaniu metod A i B.
Wyniki pokazują, że sam hydrolizat drożdży i soi podtrzymywał wzrost komórek. W stężeniu
5
0,1% hydrolizatu drożdży osiągano gęstość komórek około 11,8 x 10 komórek/ml, jednakże wzrastające stężenie hydrolizatu drożdży do wyższego niż 0,3% (wag./obj.) miało negatywny wpływ na wzrost
komórek i w konsekwencji na gęstość komórek. Stężenia samego hydrolizatu soi między 0,1%
(wag./obj.) a 0,2% (wag./obj.) wykazywały mniejszy wzrost komórek i gęstość komórek, niż stężenia
soi 0,3% (wag./obj.) i 0,4% (wag./obj.). Jednakże gęstość komórek i zużycie tlenu komórek hodowanych w pożywce zawierającej 0,3% (wag./obj.) lub 0,4% (wag./obj.) hydrolizatu soi nie różniły się znacząco i wyższe stężenia do około 1% wag./obj. hydrolizatu soi nie miały dodatniego wpływu na wzrost
komórek. Optymalne stężenie samego hydrolizatu soi ustalono jako pomiędzy 0,2% wag./obj. do 1,0%
wag./obj. Przez uzupełnienie pożywki podstawowej kombinacją hydrolizatu soi i hydrolizatu drożdży
osiągnięta końcowa gęstość komórek była znacząco zwiększona w porównaniu z pożywką zawierającą sam hydrolizat soi lub hydrolizat drożdży. Osiągnięta gęstość komórek przy stężeniu 0,05%
5
(wag./obj.) soi i 0,05% (wag./obj.) drożdży wynosiła około 12,1 x 10 komórek/ml i miała wyższą gęstość komórek w hodowli komórkowej w porównaniu do komórek hodowanych w pożywce zawierają5
cej jedynie bądź 0,1% (wag./obj.) hydrolizatu soi (10 x 10 komórek/ml), bądź 0,1% (wag./obj.) hydroli5
zatu drożdży (11,8 x 10 komórek/ml). Gęstość komórek w hodowli komórkowej w porównaniu do
komórek hodowanych w pożywce zawierającej drożdże w stężeniu 0,2% (wag./obj.) i soję w stężeniu
1,0% (wag./obj.) była podobna do gęstości otrzymanej w pożywce zawierającej 0,05% (wag./obj.) soi
i 0,05% drożdży (wag./obj.).
Najbardziej znaczący wpływ na wzrost komórek miała pożywka, w której stężenie hydrolizatu
soi w porównaniu z hydrolizatem drożdży było około 2-3 razy wyższe. Komórki hodowane w pożywce
zawierającej hydrolizat soi w stężeniu około 0,3% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu około
5
0,1% (wag./obj.) osiągały gęstość komórek około 21,0 x 10 komórek/ml i wykazywały zatem około
2 razy wyższą gęstość komórek w porównaniu do komórek hodowanych w jedynie na hydrolizacie soi
w stężeniu około 0,4% (wag./obj.) i około 2,5 razy wyższą gęstość komórek w porównaniu do komórek
hodowanych w jedynie na hydrolizacie drożdży w stężeniu około 0,4% (wag./obj.). Aktywność metaboliczna komórek hodowanych w pożywce zawierającej hydrolizat drożdży i soi była również wyższa
w porównaniu do komórek hodowanych w pożywce zawierającej jedynie hydrolizat drożdży lub soi.
Tempo zużycia tlenu wynosiło 1,5 (% na min.) w pożywce zawierającej 0,1% (wag./obj.) hydrolizatu
drożdży i mniej niż 1,0 (% na min.) w pożywce zawierającej 0,4% (wag./obj.) samego hydrolizatu
drożdży lub hydrolizatu soi. W pożywce zawierającej 0,1% (wag./obj.) hydrolizatu drożdży i 0,3%
(wag./obj.) hydrolizatu soi zużycie tlenu wynosiło około 2,9 (% na min.), czyli było około 2 razy wyższe
niż komórek hodowanych w pożywce zawierającej jedynie hydrolizat soi lub drożdży.
Dodatkowo cykl komórkowy, który wynosi 7 dni w pożywce wolnej od białka zwierzęcego uzupełnionej samym hydrolizatem drożdży lub soi, jest zmniejszony do 6 dni w pożywce z kombinacją
hydrolizatów (soi i drożdży).
Przykład 3
Namnażanie komórek zrekombinowanych
Hodowlę komórkową zrekombinowanych komórek ssaków, takich jak komórki rFVIII-CHO, hoduje się w 10 I tanku z mieszaniem i przepływem. Pożywkę zgodną z przykładem 1 stosuje się jako
pożywkę do hodowli i wzrostu. Komórki są unieruchamiane na porowatym mikronośniku (Cytopore®,
Pharmacia) i hodowane, przez co najmniej 6 tygodni. Tempo przepływu wynosi 4 zmiany objętości na
10
PL 214 284 B1
dzień, pH wynosi 6,9 do 7,2, stężenie O2 wynosi około 20-50%, a temperatura to 37°C. Określa się
gęstość komórek.
Przykład 4
Porównanie wytwarzania antygenu wirusa na komórkach VERO hodowanych w pożywce uzupełnionej hydrolizatem drożdży i hydrolizatem soi.
a. Wytwarzanie biomasy hodowli komórkowej
Komórki VERO o określonej liczbie pasaży rozmrożono z ciekłego azotu i pasażowano w kolbie
Roux i butelkach obrotowych w celu wytworzenia dostatecznej liczby komórek do zaszczepienia
1,5 litrowego bioreaktora. Komórki hodowano bądź w pożywce podstawowej uzupełnionej albo hydrolizatem drożdży albo kombinacją hydrolizatu drożdży i soi, jak opisano w Przykładach 1 i 2. Po osią6
gnięciu konfluencji z końcową gęstością komórek 1,5 x 10 komórek/ml, komórki uwalniano z mikronośnika przy użyciu oczyszczonej frakcji Pronazy, trypsyny S. griseus (SGT), jak opisano w zgłoszeniu patentowym USA nr 10/006223 i przenoszono do 10-litrowego bioreaktora. To z kolei zastosowano jako inokulum 100-litrowego bioreaktora mającego stężenie mikronośnika 3,0 g/l. Rozpoczynając
7
od ampułki z roboczego banku zawierającej 10 komórek, potrzeba około 30 generacji dla osiągnięcia
ostatecznej konfluentnej biomasy komórek VERO w ostatnim fermentorze. Komórki hodowano
w 37°C. W czasie namnażania wirusa utrzymywano stałe warunki hodowli: nasycenie tlenu 20%
+/- 10% i pH 7,1 +/- 0,35.
Komórki z roboczego komórkowego banku komórek VERO namnażano w kolbach T i butelkach
obrotowych przy stosunku rozsiewania 1:6. Dalsze namnażanie komórek przeprowadzano w 1,5,
10 i 50 I fermentorze z mieszaniem jako bioreaktor, stosując mikronośnik Cytodex1® jako substrat do
przylegania. Komórki hodowano w 37°C. W czasie namnażania wirusa utrzymywano stałe warunki
hodowli: nasycenie tlenu 20% +/- 10% i pH 7,1 +/- 0,35.
b. Namnażanie wirusa grypy
Komórki VERO zakażano dwoma różnymi szczepami grypy, Nowa Kaledonia A/H1N1 i Panama
A/H3N2 i namnażano w odpowiedniej pożywce. Na zakończenie procesu namnażania wirusa, sklarowany supernatant zawierający wirusa oczyszczano przez ultrawirowanie. Uzysk z hodowli komórek
VERO jedynie z hydrolizatem drożdży albo z hydrolizatem drożdży i hydrolizatem soi porównywano na
podstawie objętościowej produktywności antygenu (całkowity SRD, pojedyncza promieniowa immunodyfuzja), a zawartością antygenu w supernatancie na zakończenie procesu (antygen oczyszczony
w gradiencie gęstości). Wydajności dla obydwu składów pożywek porównywano i zebrano w Tabeli 1.
T a b e l a 1.
Porównanie wydajności produktu przy wytwarzaniu wirusa grypy z VERO dla różnego składu pożywki
SRD
(µg/ml)
Szczep
1 g/l hydrolizatu drożdży + 3 g/l hydrolizatu soi
1 g/l hydrolizatu drożdży
Białko
(µg/ml)
1 g/l hydrolizatu drożdży
Dawka/Litr
(na szczep)
Nowa Kaledonia A/H1N1
130
341
0,38
146
51
147
0,35
57
Szczep
1 g/l hydrolizatu drożdży + 3 g/l hydrolizatu soi
SRD/Białko
Panama A/H3N2
130
233
0,56
103
44
117
0,38
35
Połączenie hydrolizatu drożdży i hydrolizatu soi wykazuje znaczące polepszenie w stosunku do
samego hydrolizatu drożdży.
c. Wytwarzanie wirusa ospy
Komórki VERO zakażano szczepem do wytwarzania szczepionki przeciw ospie (Dryvax, Wyeth
Vaccines, otrzymany z Acam-bis, Inc., szczepionkowy szczep z limfy cielęcej zaadaptowany do wzrostu w ciągłej linii komórkowej) przystosowany do komórek VERO wolnych od białka zwierzęcego przez
serię pasaży przy wielokrotności namnażania (m.o.i., od ang. multiplicity of infection) 0,1-0,3. Po czasie inkubacji 2-4 dni w 37°C komórki zbierano i z komórek odzyskiwano wirusa.
Tabela 2 pokazuje wyniki uzysku wirusa otrzymanego z komórek hodowanych w pożywce podstawowej uzupełnionej samym hydrolizatem drożdży albo hydrolizatem drożdży i soi.
PL 214 284 B1
11
T a b e l a 2:
Określenie miana wirusa krowianki na zakończenie cyklu wytwarzania w systemie bioreaktora.
Uzupełnienie pożywki
Końcowe miano (pfu)
m.o.i
1 g/l hydrolizatu drożdży
0,1 - 0,3
1 g/l hydrolizatu drożdży + 3 g/l hydrolizatu soi
Pfu/komórkę
7
14
7
69
1,42 x 10 /ml
0,1 - 0,3
16,00 x 10 /ml
Połączenie hydrolizatu drożdży i hydrolizatu soi wykazuje znaczące polepszenie w stosunku do
samego hydrolizatu drożdży.
d. Wytwarzanie wirusa Ross River
Hodowlę komórek VERO, otrzymaną jak opisano, zakażano wirusem Ross River przy wielokrotności namnażania (m.o.i) 0,1-0,3. Po czasie inkubacji 2-4 dni w 37°C komórki zbierano i z komórek odzyskiwano wirusa. Tabela 3 pokazuje wyniki uzysku wirusa otrzymanego z komórek hodowanych w pożywce podstawowej uzupełnionej samym hydrolizatem drożdży albo hydrolizatem drożdży
i soi.
T a b e l a 3:
Określenie miana wirusa Ross River na zakończenie cyklu wytwarzania w systemie bioreaktora.
Uzupełnienie pożywki
Końcowe miano (pfu/ml)
1 g/l hydrolizatu drożdży
1 g/l hydrolizatu drożdży + 3 g/l hydrolizatu soi
Względna wydajność (%)
1,5 x 10
7
100
2,5 x 10
7
167
Połączenie hydrolizatu drożdży i hydrolizatu soi wykazuje znaczące polepszenie w stosunku do
samego hydrolizatu.
Jest zrozumiałe, że opis, konkretne przykłady i dane, jakkolwiek wskazują na przykładowe wykonania, są podane w celu ilustracji i nie jest ich zamiarem ograniczanie wynalazku. Rozmaite zmiany
i modyfikacje w obrębie niniejszego wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie
z dyskusji, ujawnienia i zawartych tu danych, a zatem są uważane za część wynalazku.
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób wytwarzania wirusa, znamienny tym, że obejmuje:
dostarczanie hodowli komórek VERO, które były hodowane w wolnej od białka zwierzęcego pożywce obejmującej hydrolizat soi w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 0,3% (wag./obj.),
zakażanie komórek wirusem, i
inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa.
2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że wirus jest wybrany z grupy wirus grypy,
wirus krowianki i ospy krowiej, wirus ospy drobiu, wirus ospy krów, wirus kleszczowego zapalenia
mózgu (TBE, od ang. tick-borne encephalitis), wirus polio, wirus zapalenia wątroby A, wirus Ross
River, wirus żółtej gorączki i pochodzące od niego wirusy chimerowe, wirus zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus różyczki, wirus zapalenia wątroby C (HCV),
wirus świnki, wirus odry, wirus oddechowy (RSV od ang. respiratory syncytial virus), wirus opryszczki
pospolite] (HSV, od ang. herpes simplex virus), cytomegalowirus (CMV), wirus Epsteina-Barra (EBV),
rotawirus, wirus pryszczycy (FMDV, od ang. foot and mouth disease virus).
3. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że komórkami są komórki VERO, a wirus
jest wybrany z grupy wirusa grypy, wirusa TBE, wirusa krowianki, wirusa polio, wirusa zapalenia wątroby A, wirusa Ross River, wirusa żółtej gorączki i pochodzących od niego wirusów chimerowych,
wirusa zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa różyczki,
HCV, wirusa świnki, wirusa odry, wirusa oddechowego, HSV, CMV, EBV, rotawirusa.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany oczyszczaniu.
5. Sposób według zastrzeżenia 4, znamienny tym, że hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest
poddawany ultrafiltracji.
12
PL 214 284 B1
6. Sposób wytwarzania kompozycji immunogennej zawierającej wirusa albo antygen wirusa,
znamienny tym, że obejmuje:
dostarczanie hodowli komórek VERO, które były hodowane w wolnej od białka zwierzęcego
pożywce zawierającej hydrolizat soi i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 1% (wag./obj.)
i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 0,3% (wag./obj.),
zakażanie komórek wirusem,
inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa, zebranie wytworzonego wirusa
albo antygenu wirusa,
wytworzenie kompozycji immunogennej z zebranego wirusa albo antygenu wirusa.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że zebrany wirus albo antygen wirusa jest poddawany oczyszczaniu.
8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że obejmuje: zakażanie komórek wirusem wybranym z grupy ortomiksowirusów, paramiksowirusów, reowirusów, pikornawirusów, flawiwirusów,
arenawirusów, wirusów opryszczki, wirusów ospy, koronawirusów i adenowirusów,
inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa, zebranie wytworzonego w ten
sposób wirusa albo antygenu wirusa, i
wytworzenie kompozycji immunogennej z zebranego wirusa albo antygenu wirusa.
9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany oczyszczaniu.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany ultrafiltracji.
Departament Wydawnictw UP RP
Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)