spec model-II
Transkrypt
spec model-II
Polyclonal Rabbit Anti-Human Lysozyme EC 3.2.1.17/FITC nr kat. F 0372 Wydanie z 01.12.03 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Produkt o nr kat. F 0372, Polyclonal Rabbit Anti-Human Lysozyme EC 3.2.1.17/FITC, jest przeznaczony do badań cytometrii przepływowej. Produkt o nr kat. F 0372 został zoptymalizowany w zakresie znakowania lizozymu wewnątrzkomórkowego podczas stosowania wraz z zestawem Dako IntraStain Fixation and Permeabilization Kit, nr kat. K 2311. Interpretację wyników powinien przeprowadzić uprawniony pracownik w kontekście historii choroby pacjenta oraz innych testów diagnostycznych. Wstęp Lizozym, zidentyfikowany i nazwany przez Aleksandra Fleminga w 1922 r. oraz określony jako składnik tkanek niszczący bakterie, jest wszechobecny wśród organizmów żywych, a u człowieka jego obecność wykazano w kilku organach i płynach tkankowych (1). W zakresie układu krwiotwórczego, lizozym jest znany jako wewnątrzkomórkowa cząsteczka markera szpikowego z selektywną ekspresją przez komórki linii granulomonocytowej. Normalne prekursory monocytowe wydają się najpierw syntetyzować lizozym, a następnie mieloperoksydazę, podczas, gdy synteza mieloperoksydazy wydaje się poprzedzać lizozym w rozwoju neutrofili, odzwierciedlając w ten sposób schemat ekspresji w ostrej białaczce szpikowej (AML). Uważa się, że dojrzałe monocyty syntetyzują w sposób ciągły i wydzielają lizozym, podczas gdy granulocyty nie syntetyzują a jedynie wydzielają wstępnie utworzony enzym (2). Odczynnik dostarczony Produkt o nr kat. F 0372 jest oczyszczoną frakcją immunoglobulin z surowicy odpornościowej królika skoniugowanej z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Koniugat jest dostarczany w postaci płynnej w buforze zawierającym 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3 o pH 7,2. Każda fiolka zawiera 100 testów (10 µL koniugatu przeznaczone jest dla maksymalnie 10 6 leukocytów z normalnej ludzkiej krwi obwodowej). Stężenie immunoglobulin g/L: zob. informację podaną na etykiecie fiolki. Wskaźnik F/P: E495 nm/E278 nm = 1,00 ± 0,15 odpowiada molowemu stosunkowi FITC/białko 4. Immunogen: Lizozym wyizolowany z moczu pacjentów z białaczką monocytową. Swoistość Przeciwciało reaguje z ludzkim lizozymem. Ślady przeciwciał powodujących skażenie zostały usunięte przez absorpcję fazy stałej z plazmą ludzką i białkami moczu. Swoistość stwierdzono następująco: Immunoelektrofereza krzyżowa: Pojawia się wyłącznie łukowaty osad lizozymu, jeżeli użyje się 12,5 L nieskoniugowanego przeciwciała na cm kwadratowy powierzchni żelu względem 2 L stężonego moczu od pacjentów z białaczką monocytową. Nie pojawia się żaden łukowaty osad, jeżeli przeciwciało jest badane wobec 2 L normalnego ludzkiego osocza lub 2 L stężonego normalnego ludzkiego moczu. Barwienie: Barwnik Coomassie Briliant Blue. W badaniu immunocytochemicznym przeciwciało znakuje cytoplazmę w leukocytach wielojądrzastych i monocytach lecz rzadko w limfocytach (3). Przeciwciało jest zalecane jako część panelu przeciwciał stosowanych w immunofenotypowaniu ostrej białaczki w próbkach biopsji szpiku kostnego, ponieważ pomaga w odróżnieniu AML od przypadków ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL)(4). International Lymphoma Study Group (ILSG, Międzynarodowa Grupa Badań Chłoniaków) zaleca stosowanie przeciwciała jako część panelu przeciwciał dla immunocytochemicznego immunofenotypowania nowotworów komórek histiocytowych i dendrytycznych (5). Środki ostrożności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych należy stosować prawidłowe procedury postępowania. Przechowywanie Przechowywać w ciemnym miejscu w temp. 2-8 C. Nie używać po upływie daty ważności podanej na etykiecie fiolki. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pacjenta należy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. Nie przechowywać rozcieńczonych koniugatów. Jeśli wystąpi nieoczekiwany wzór barwienia, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, że przyczyną może być problem z przeciwciałem, należy niezwłocznie skontaktować się z Działem Pomocy Technicznej naszej firmy. Procedura barwienia (107144-002) 1. Przenieść 50 L (do 106 komórek) zawiesiny komórek badanych (komórki pełnej krwi lub szpiku kostnego) do probówki. F 0372/PL/MTH/01.12.03 p.1/2 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17 2. Dodać 100 L odczynnika Dako IntraStain Reagent A (Fixation), nr kat. K 2311. Delikatnie wymieszać używając wytrząsarki, aby zapewnić powstanie jednorodnej zawiesiny komórek. 3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. 4. Dodać 2 mL zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS) i delikatnie wymieszać przy pomocy wytrząsarki. 5. Wirować 300 x g przez 5 minut następnie zassać supernatant pozostawiając około 50 L płynu. 6. Dokładnie wymieszać stosując wytrząsarkę, aby uzyskać zawiesinę komórek i dodać 100 L odczynnika Dako IntraStain Reagent B (Permeabilization), nr kat. K 2311. Dodać 10 L F 0372. Delikatnie wymieszać stosując wytrząsarkę, aby uzyskać zawiesinę komórek. 7. Jako kontrolę ujemną stosować niereaktywne poliklonalne przeciwciało królicze skoniugowane z FITC. 8. Inkubować w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej przez 15 minut. 9. Powtórzyć etapy 4 i 5. 10. Ponownie wykonać zawiesinę peletek w płynie odpowiednim dla analizy cytometrycznej, np. w 0,3 mL 1 % paraformaldehydzie (utrwalacz) w 0,01 mol/L PBS o pH 7,4. 11. Analizować na cytometrze przepływowym. Dla zapewnienia kontroli odczynników i przygotowania próbek zalecane jest stosowanie podczas każdego testu odpowiednich próbek kontroli dodatniej i ujemnej. Należy pamiętać, że Koniugaty fluorochromu są wrażliwe na działanie światła, dlatego podczas procedury barwienia i do chwili wykonania analizy należy chronić próbki przed działaniem światła. Piśmiennictwo 1. Aström M, Bodin L, Hörnsten P, Wahlin A, Tidefelt U. Evidence for a bimodal relation between serum lysozyme and prognosis in 232 patients with acute myeloid leukaemia. Eur J Haematol 2003;70:26-33. 2. Scheinecker C, Strobl H, Fritsch G, Csmarits B, Krieger O, Majdic O, et al. Granulomonocyte-associated lysosomal protein expression during in vitro expansion and differentiation of CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood 1995;86:4115-23. 3. Krugliak L, Meyer PR, Taylor CR. The distribution of lysozyme, alpha-1-antitrypsin, and alpha-1antichymotrypsin in normal hematopoietic cells and in myeloid leukemias: an immunoperoxidase study on cytocentrifuge preparations, smears, and paraffin sections. Am J Hematol 1986;21:99-109. 4. Toth B, Wehrmann M, Kaiserling E, Horny H-P. Immunophenotyping of acute lymphoblastic leukaemia in routinely processed bone marrow biopsy specimens. J Clin Pathol 1999;52:688-92. 5. Pileri SA, Grogan TM, Harris NL, Banks P, Campo E, Chan JKC, et al. Tumours of histiocytes and accessory dendritic cells: an immunohistochemical approach to classification from the International Lymphoma Study Group based on 61 cases (review). Histopathol 2002;41:1-29. Objaśnienia symboli (107144-002) Numer katalogowy Temperatura przechowywania Zużyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Chronić przed światłem Producent Sprawdzić w instrukcji stosowania Numer serii F 0372/PL/MTH/01.12.03 p.2/2 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17