Autoreferat - Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w

Autoreferat - Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w

Autoreferat 1. Imię i nazwisko Marta Fichna 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe 18 czerwca 2003 – Dyplom Lekarza – studia medyczne ukończone z wyróżnieniem na Wydziale Lekarskim I Akademii Medycznej (obecny Uniwersytet Medyczny) im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 11 grudnia 2008 – Dyplom Master of Science w zakresie diagnostyki molekularnej (studia podyplomowe ukończone z wyróżnieniem) na University of Nottingham w Wielkiej Brytanii 18 marca 2009 – Dyplom Doktora nauk medycznych (z wyróżnieniem) uzyskany na Wydziale Lekarskim II Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu na podstawie rozprawy zatytułowanej „Polimorfizm genu PTPN22 w wybranych chorobach autoimmunologicznych układu dokrewnego“ Promotor pracy: dr hab. med. Maria Gryczyńska Uzyskane specjalizacje: •
Choroby wewnętrzne (2011, Centrum Egzaminów Medycznych w Łodzi) •
Endokrynologia (2015, Centrum Egzaminów Medycznych w Łodzi) 3. Informacja o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych Katedra i Klinika Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu • studia doktoranckie (2004-­‐2009) • asystent (2009-­‐2013) – ½ etatu • adiunkt (2013 do dziś) – ½ etatu 1 Zakład Patologii Molekularnej Instytutu Genetyki Człowieka, Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu • biolog (2009-­‐2010) – ¾ etatu • adiunkt (2010 do dziś) – ¾ etatu Zakład Immunologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu -­‐ asystent (2014-­‐2015) – ½ etatu 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) Tytuł osiągnięcia naukowego: Kliniczne, immunologiczne i genetyczne aspekty pierwotnej niedoczynności kory nadnerczy (choroby Addisona) Osiągnięcie naukowe, które przedkładam ubiegając się o uzyskanie stopnia doktora habilitowanego nauk medycznych składa się z pięciu oryginalnych artykułów opublikowanych w recenzowanych czasopismach w latach 2012-­‐2016. Łączna wartość ich współczynnika Impact Factor (IF) wynosi 14,870 (130 punktów Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego, MNiSW). §
Marta Fichna, Magdalena Żurawek, Piotr Fichna, Maria Gryczyńska, Jerzy Nowak, Marek Ruchała. Increased serum osteoprotegerin in patients with primary adrenal insufficiency receiving conventional hydrocortisone substitution. Journal of Physiology and Pharmacology 2012; 63: 677-­‐82. IF 2,804; MNiSW 25 Mój wkład w powstanie tej publikacji obejmował zaprojektowanie badania, dobór odpowiednich pacjentów i zdrowych kontroli do badania, zebranie ich surowic do 2 oznaczeń krążącej osteoprotegeryny i sRANKL, rejestrację danych klinicznych, wykonanie analiz statystycznych oraz interpretację wyników, napisanie manuskryptu oraz jego poprawki zgodnie z zaleceniami recenzentów. Mój udział oceniam na 75%. §
Marta Fichna, Piotr Fichna, Maria Gryczyńska, Agata Czarnywojtek, Magdalena Żurawek, Marek Ruchała. Steroid replacement in primary adrenal failure does not appear to affect circulating adipokines. Endocrine 2015; 48(2): 677-­‐85. doi: 10.1007/s12020-­‐014-­‐0388-­‐6. IF 3,279; MNiSW 25 Mój udział w tej publikacji polegał na zaproponowaniu hipotezy badawczej, przygotowaniu bazy danych pacjentów, udziale w zebraniu surowic, na analizach statystycznych stężeń adipokin (leptyny, adiponektyny i rezystyny) w kontekście pozostałych danych klinicznych i biochemicznych, interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu manuskryptu, a następnie jego modyfikacji po recenzji. Mój wkład oceniam na 75%. §
Marta Fichna, Magdalena Żurawek, Maria Gryczyńska, Anna Sowińska, Jerzy Nowak, Marek Ruchała. Polymorphic variants of the HSD11B1 gene may be involved in adverse metabolic effects of glucocorticoid replacement therapy in Addison’s disease. European Journal of Internal Medicine 2016 Apr 13. pii: S0953-­‐
6205(16)30047-­‐4. doi: 10.1016/j.ejim.2016.03.027. IF 2,591; MNiSW 35 Mój wkład w powstanie tego artykułu obejmował przygotowanie projektu badania, zebranie danych oraz meteriału biologicznego od pacjentów, izolację DNA z komórek krwi obwodowej, udział w genotypowaniu polimorfizmów genu dehydrogenazy 11beta-­‐hydroksysteroidowej typu 1 (HSD11B1), interpretację wyników badania, napisanie manuskryptu i jego poprawki zgodnie z uwagami recenzentów. Swój udział oceniam na 80% nakładu pracy koniecznego do powstania tej publikacji. §
Marta Fichna, Anita Rogowicz-­‐Frontczak, Magdalena Żurawek, Piotr Fichna, Maria Gryczyńska, Dorota Zozulińska-­‐Ziółkiewicz, Marek Ruchała. Positive autoantibodies 3 to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison’s disease. Endocrine 2016; 53(1): 249-­‐57. DOI: 10.1007/s12020-­‐016-­‐
0916-­‐7. IF 3,279; MNiSW 25 Mój udział w powstaniu tego artykułu obejmował sformułowanie hipotezy badawczej, dobór pacjentów do badania, zebranie ich danych klinicznych oraz surowic do oceny obecności autoprzeciwciał, analizę przeciwciał ZnT8A w surowicy z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego zestawu ELISA, opracowanie statystyczne uzyskanych wyników oraz ich interpretację, przygotowanie manuskryptu i jego redakcję zgodnie z zaleceniami recenzentów. Swój udział oceniam na 80%. §
Marta Fichna, Magdalena Żurawek, Eirik Bratland, Eystein S Husebye, Anna Kasperlik-­‐Załuska, Barbara Czarnocka, Danuta Januszkiewicz-­‐Lewandowska, Jerzy Nowak. Interleukin-­‐2 and subunit alpha of its soluble receptor in autoimmune Addison’s disease – an association study and expression analysis. Autoimmunity 2015; 48(2): 100-­‐7. doi: 10.3109/08916934.2014.976628. IF 2,917, MNiSW 20 Mój wkład tę publikację polegał na zaprojektowaniu badania i przygotowaniu aplikacji grantowej, zainicjowaniu współpracy z Uniwersytetem w Bergen oraz Centrum Medycznym Kształcenia Podyplomowego w Warszawie, zebraniu próbek krwi od pacjentów, udziale w genotypowaniu wariantów genów IL2 i IL2RA, prowadzeniu krótkoterminowych hodowli komórkowych oraz analizie ekspresji obu genów w warunkach podstawowych i po stymulacji, opracowaniu statystycznym i interpretacji wyników, przygotowaniu manuskryptu oraz wprowadzeniu poprawek według wskazówek recenzentów. Swój udział oceniam na 75%. 4 Opis celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Pierwotna niedoczynność kory nadnerczy, zwana również chorobą Addisona (ang. Addison’s disease, AD), jest schorzeniem endokrynologicznym stwarzającym zagrożenie dla życia. Pierwotna niewydolność nadnerczy może mieć różną etiologię, m.in. związaną z czynnikami infekcyjnymi (w przebiegu gruźlicy, cytomegalii, grzybic), czy rzadkimi chorobami metabolicznymi (skrobiawica, hemochromatoza), etiologię nowotworową, albo uwarunkowaną genetycznie, jednak współcześnie najczęstszą przyczyną jest autoimmunologiczna destrukcja kory nadnerczy (adrenalitis) [1,2]. Objawy kliniczne AD ujawniają się gdy zniszczone jest ~90% kory nadnerczy. Obejmują one zmęczenie, uczucie wyczerpania, jadłowstręt, utratę masy ciała, nudności, wymioty, bóle brzucha, skurcze mięśni, hipotonię ortostatyczną, łaknienie słonych pokarmów, zaburzenia elektrolitowe (hiponatremię, hiperkaliemię z towarzyszącą kwasicą metaboliczną) oraz charakterystyczną hiperpigmentację skóry i błon śluzowych wywołaną nadprodukcją proopiomelanokortyny, prekursora dla hormonu adrenokortykotropowego (ACTH) oraz melanotropowego (MSH) [1,3]. Jedynym sposobem leczenia AD jest regularna substytucja hormonów kory nadnerczy: glikokortykosteroidów, mineralokortykosteroidów i opcjonalnie, androgenów nadnerczowych. Jednakże podawanie egzogennych steroidów nigdy nie jest fizjologiczne, a pacjenci mają krótszą przewidywaną długość życia i gorszą jego jakość [2,4,5]. Nawet biorąc pod uwagę niedawno wprowadzone preparaty hydrokortyzonu (HC) o zmodyfikowanym uwalnianiu, które pozwalają lepiej naśladować naturalny rytm dobowy wydzielania kortyzolu, zawsze pozostaje problem indywidualnego doboru odpowiedniej dawki dla utrzymania prawidłowej ekspozycji na kortyzol [6]. Jak oszacowano w oparciu o metodę rozcieńczeń stabilnego izotopu i spektrometrii masowej, fizjologiczna produkcja kortyzolu u osób zdrowych waha się między 5-­‐
10mg/m2 powierzchni ciała [7]. Uwzględniając biodostępność oraz efekt pierwszego przejścia przez wątrobę, odpowiada to dawce substytucyjnej 10-­‐12mg HC/m2 (około 15-­‐25mg na dobę), a zatem znacznie mniejszej niż dawniej zalecane schematy substytucji steroidowej. Jednakże w przypadku niedostatecznego zaopatrzenia w steroidy pacjenci zagrożeni są potencjalnie śmiertelnym przełomem nadnerczowym, zwłaszcza w okolicznościach ostrych towarzyszących chorób, zabiegów chirurgicznych, 5 oraz innych zdarzeń związanych ze stresem. Ryzyko przełomu nadnerczowego jest szczególnie wysokie u osób z pierwotną niedoczynnością nadnerczy oraz współistniejącymi dodatkowymi schorzeniami [5,8]. Z drugiej strony nawet nieznaczny przewlekły nadmiar glikokortykosteroidów może prowadzić do poważnych objawów niepożądanych w postaci nietolerancji glukozy, dyslipidemii, otyłości trzewnej i przyspieszonej utraty masy kostnej [2,9,10]. Metaboliczne efekty nieadekwatnego leczenia steroidami przyczyniają się do zwiększonej chorobowości i śmiertelności z przyczyn naczyniowo-­‐sercowych wśród pacjentów z AD, opisywanej niedawno w oparciu o dane ze szwedzkich rejestrów medycznych [11,12]. Dodatkowo osoby z autoimmunologiczną AD prezentują wyjątkową skłonność do rozwoju kolejnych zaburzeń autoimmunologicznych, szczególnie chorób narządowo swoistych, jak autoimmunologiczna choroba tarczycy (ang. autoimmune thyroid disease, AITD), cukrzyca typu 1 (ang. type 1 diabetes, T1D), niedokrwistość złośliwa, czy przedwczesna niewydolność jajników (ang. premature ovarian failure, POI). Częstość współwystępowania schorzeń autoimmunologicznych przekracza 50% pacjentów z AD, a może nawet sięgać 80%, jeśli uwzględnić przypadki subkliniczne [13,14]. Typowe kombinacje chorób są klasyfikowane w odrębne autoimmunologiczne zespoły wielogruczołowe (ang. autoimmune polyendocrine syndrome, APS), stanowiące poważne wyzwanie podczas terapii AD [2,15]. Przykładowo, pacjenci z AD i nadczynnością tarczycy w przebiegu choroby Graves-­‐Basedowa są zagrożeni przełomem nadnerczowym z powodu nasilonego klirensu kortyzolu, zatem ich zapotrzebowanie na steroidy jest zwiększone [16]. AD nakładająca się na wcześniej istniejącą T1D manifestuje się nawracającymi epizodami hipoglikemii w związku z osłabieniem glukoneogenezy i nasileniem wrażliwości na insulinę w warunkach niedoboru glikokortykosteroidów[17]. Z kolei standardowa suplementacja glikokortykosteroidowa może zaburzać kontrolę glikemii w cukrzycy w okresach nadmiaru egzogennych steroidów [18]. Dane oparte na rejestrach wykazują zwiększoną śmiertelność pacjentów z AD i cukrzycą w porównaniu z osobami obarczonymi jedynie niewydolnością nadnerczy [11]. Ponadto u chorych z AD, objawy zaburzeń wchłaniania związane ze współistnieniem celiakii, bywają interpretowane jako gastroenterologiczne przejawy niedostatecznego dawkowania glikokortykosteroidów [19]. Z kolei pewne zaburzenia obserwowane na początku AD mogą być fałszywie przypisywane współistniejącym schorzeniom. Niewielki wzrost stężenia TSH w surowicy może po prostu odzwierciedlać 6 brak supresyjnego działania glikokortykosteroidów, a niekoniecznie świadczyć o rozwoju niedoczynności tarczycy spowodowanej przewlekłym autoimmunologicznym zapaleniem. Zaburzenia miesiączkowania u kobiet z nowo rozpoznaną AD mogą ustąpić po wprowadzeniu właściwej substytucji hormonów kory nadnerczy, nie dowodząc od razu współistnienia POI [1,3]. W końcu, dodatkowe zaburzenia autoimmunologiczne, jak dysfunkcja tarczycy, hipogonadyzm, czy choroba trzewna, mogą dodatkowo zwiększać ryzyko utraty gęstości mineralnej kości, co stanowi kolejny częsty problem u pacjentów z AD [20-­‐22]. W zgodzie z obserwowanym ogólnoświatowym zwiększeniem częstości schorzeń autoimmunologicznych, opisywano także wzrost częstości występowania AD [23,24]. Jednakże mechanizmy związane z patogenezą autoimmunizacji nadnerczowej pozostają w dużej mierze nieznane. Uważa się, że znaczenie mają sprzyjające tło genetyczne wraz z endogennymi czynnikami immunologicznymi oraz niezdefiniowanymi czynnikami spustowymi ze środowiska [25]. Istnieje kilkanaście rzadkich zespołów uwarunkowanych genetycznie, których obraz kliniczny zawiera pierwotną niedoczynność nadnerczy, jak np. adrenoleukodystrofia sprzężona z chromosomem X, wrodzony niedorozwój nadnerczy, choroba Wolmana, czy kilka postaci zespołów niewrażliwości na ACTH [26]. Ponadto różne formy wrodzonego przerostu nadnerczy spowodowane autosomalnymi recesywnymi blokami enzymatycznymi steroidogenezy, charakteryzują się niedostateczną syntezą kortyzolu. W przeciwieństwie do powyższych uwarunkowanych monogenowo schorzeń, autoimmunologiczna AD jest wyjątkowo dziedziczona zgodnie z wzorcami Mendlowskimi. Przykładem jest rzadki APS typu 1, wynikający z dziedziczonej autosomalnie recesywnie mutacji immunoregulatorowego genu AIRE i przejawiający się typowo AD w połączeniu z niedoczynnością przytarczyc i/lub nawracającą grzybicą skórno-­‐śluzówkową [27]. Większość przypadków autoimmunologicznej AD jest jednak unikalna w rodzinach, choć krewni tych osób często chorują na różne inne zaburzenia autoimmunologiczne. Opisana ostatnio analiza sprzężeń przeprowadzona w 23 wielopokoleniowych rodzinach z >1 przypadkiem AD zebranych w Wielkiej Brytanii i Norwegii wskazała prawdopodobne nowe locus podatności na ramieniu długim chromosomu 18, obejmujące gen NFATC1 (nuclear factor of activated T-­‐cells, cytoplasmic, calcineurin-­‐dependent 1), kodujący czynnik transkrypcyjny ulegający ekspresji w korze nadnerczy [28]. Jednakże większość genów zasocjowanych z AD 7 została zidentyfikowana poprzez badania funkcjonalnie prawdopodobnych kandydatów. Częstość występowania AD oceniana na 60-­‐140/milion, uniemożliwia prowadzenie liczebnych analiz w obrębie jednej populacji. Lokalne, czy nawet narodowe zbiory danych i próbek od pacjentów są zbyt małe, aby zapewnić moc badania wystarczającą do wykrycia wariantów genetycznych o mniejszym wpływie. Ostatnia próba skanowania całego genomu (ang. genome-­‐wide association scan, GWAS) w poszukiwaniu nowych loci związanych z AD nie powiodła się ze względu na genetyczną heterogenność grup badanych z kilku europejskich krajów, których nie można było połączyć w jedną serię [29]. Najsilniejszą znaną asocjacją z autoimmunologicznym AD pozostają haplotypy głównego układu zgodności tkankowej (ang. Major Histocompatibility Complex, MHC) DRB1*03-­‐
DQA1*0501-­‐DQB1*0201 (DR3/DQ2) oraz DRB1*0404-­‐DQA1*0301-­‐DQB1*0302 (DR4.4/DQ8) potwierdzone w wielu populacjach [30-­‐32]. W obrębie kompleksu MHC wykazano też związek pomiędzy AD i allelem 5.1 nieklasycznej cząsteczki MHC, MIC-­‐A (ang. MHC class I chain-­‐related A) [31,32]. Pozostałe poznane geny zasocjowane z AD obejmują CIITA, CTLA4, PTPN22, CYP27B1, CLEC16A, NLRP1, STAT4, GATA3 oraz PD-­‐L1 (CD274) i wszystkie są zaangażowane w odpowiedź immunologiczną [29,33-­‐41]. Większość z tych genów jest związana z czynnością komórek T (CTLA4, PTPN22, STAT4, GATA3, PD-­‐L1), a część z nich odgrywa rolę w mechanizmach odporności nieswoistej (CLEC16A, NLRP1). Ich polimorficzne warianty przyczyniają się do zwiększonego ryzyka AD, ale niektóre -­‐ CTLA4, PTPN22, CYP27B1 i PD-­‐L1 – wiążą się również z podatnością na inne choroby autoimmunologiczne układu dokrewnego, także w populacji polskiej [37,41,42,43]. Pomimo postępu badań genetycznych, które wskazują na związek genów regulacji immunologicznej z AD, bardzo mało wiadomo o procesie immunologicznej destrukcji kory nadnerczy. Podczas rozwoju autoimmunologicznej AD komórki produkujące hormony steroidowe są stopniowo zastępowane przez tkankę łączną, co prowadzi do zaniku gruczołów i ich czynnościowego regresu. W początkowych etapach obraz histologiczny jest zdominowany przez rozlane nacieki zapalne złożone z limfocytów, komórek plazmatycznych oraz makrofagów [44]. W testach migracji i proliferacji obwodowe limfocyty T pacjentów z AD wykazują reaktywność względem homogenatów kory nadnerczy [45,46]. Donoszono również o zaburzonej aktywności supresorowej komórek T regulatorowych CD4+CD25+ u osób z APS typu 2, natomiast nie 8 obserwowano tego zjawiska u pacjentów z izolowaną AD [47]. Nieuprawnione przeżycie autoreaktywnych limfocytów T w APS typu 2 może być również promowane poprzez obniżoną ekspresję kaspazy-­‐3, mediatora indukowanej aktywacją śmierci komórek [48]. Ponadto w AD wykazano zjawisko reaktywności komórkowej skierowanej przeciwko 21-­‐hydroksylazie, potwierdzonej proliferacją komórek T oraz wydzielaniem interferonu gamma w odpowiedzi na peptydy pochodne tego antygenu nadnerczowego [49,50]. W przeciwieństwie do nadal słabo poznanej autoimmunizacji komórkowej, autoreaktywna odpowiedź humoralna w AD została dobrze zbadana. Autoprzeciwciała przeciwko ekstraktom kory nadnerczy były po raz pierwszy wykryte za pomocą testu wiązania dopełniacza sześćdziesiąt lat temu [51]. Następnie technika immunofluorescencji pośredniej na skrawkach nadnerczy potwierdziła obecność w surowicy autoprzeciwciał przeciwko antygenom mikrosomalnym wspólnym dla trzech warstw kory nadnerczy [52]. Współcześnie oznaczenia przeciwciał przeciwko komórkom kory nadnerczy (ang. adrenal cortex autoantibodes, ACA) oraz enzymom swoistym dla tkanek steroidogennych, 21-­‐hydroksylazie i rzadziej, 17alfa-­‐hydroksylazie oraz enzymowi odcinającemu łańcuch boczny cholesterolu znajdują zastosowanie w diagnostyce AD i są uznawane za wczesną oznakę choroby [53,54]. Najprawdopodobniej autoprzeciwciała nie odgrywają bezpośredniej roli w patogenezie schorzenia i są zjawiskiem wtórnym do działania limfocytów T zaangażowanych w niszczenie komórek kory nadnerczy, które uwalniają swoje antygeny wewnąrzkomórkowe, w tym enzymy steroidogenezy. Autoprzeciwciała stanowią natomiast cenny marker, wskazujący osoby o podwyższonym ryzyku rozwoju niewydolności nadnerczy, zwłaszcza wśród dzieci [55,56]. U seropozytywnych dorosłych progresja do AD jest szczególnie częsta u pacjentów z subkliniczną niewydolnością nadnerczy, wysokimi mianami ACA oraz stężeniami przeciwciał przeciwko 21-­‐hydroksylazie, ACA wiążącymi dopełniacz oraz HLA-­‐DR3 [56]. W okresie przedklinicznym stężenia przeciwciał przeciw nadnerczowych korelują z ciężkością upośledzenia czynności nadnerczy, choć opisywano także przypadki zaniku przeciwciał i remisji w wczesnych stadiach choroby [57]. Określenie porannego stężenia ACTH, kortyzolu, aldosteronu oraz aktywności reninowej osocza wraz z oceną wydzielania kortyzolu po stymulacji ACTH umożliwia zakwalifikowanie osób seropozytywnych do jednego z pięciu stadiów dysfunkcji kory nadnerczy [58]. Pomimo efektu hamującego steroidogenezę wykazanego w badaniach in vitro, nie udowodniono klinicznie swoistego bloku 21-­‐hydroksylazy przez autoprzeciwciała ani 9 gromadzenia się 17alfa-­‐hydroksyprogesteronu u osób seropozytywnych, w warunkach podstawowych, ani po stymulacji ACTH [59,60]. Większość autoprzeciwciał przeciwko enzymom steroidogenezy należy do izotypu IgG1, co dodatkowo potwierdza dominującą rolę komórek T CD4+ subpopulacji Th1 w destrukcji kory nadnerczy [61]. Komórki CD4+ Th1 są typowymi efektorami podczas infekcji bakteryjnych i wirusowych, wydzielającymi interleukinę-­‐2 (IL2), interferon gamma i TNFbeta, co stymuluje produkcję IgG1 i IgG3 u ludzi. Donoszono również o wyższych stężeniach chemokin CXCL10 i CXCL11, związanych z odpowiedzią typu Th1, u pacjentów z AD, podczas gdy poziomy chemokin charakterystycznych dla odpowiedzi Th2 były podobne jak u kontroli [62]. W przeciwieństwie do wielu innych schorzeń autoimmunologicznych, brak jest danych o czynnikach środowiskowych sprzyjających wystąpieniu AD. Obserwacje, iż terapia przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby interferonem alfa może indukować występowanie przeciwciał przeciw 21-­‐hydroksylazie nasunęły sugestię roli wirusów jako czynników spustowych autoimmunizacji nadnerczowej [63]. Dodatkowo, wykazano że interferony typu I i III uwalniane podczas infekcji wirusowych działają cytotoksycznie na komórki kory nadnerczy i nasilają wydzielanie przez nie chemokin oraz ekspresję cząsteczek MHC klasy I i 21-­‐hydroksylazy [64]. Jednakże badanie analizujące odpowiedź humoralną oraz reakcję komórek T CD8+ przeciwko cytomegalowirusowi (CMV) nie wykazało różnic między osobami z autoimmunologiczną AD i zdrowymi [65]. W rozwoju AD podejrzewano także znaczenie niedoboru witaminy D, ponieważ u pacjentów z APS stwierdzono jej niższe stężenia w surowicy, a polimorfizm genu 1alfa-­‐hydroksylazy (CYP27B1) wiąże się z występowaniem AD [66,37,38]. Dotąd nie badano innych potencjalnych czynników spustowych ze strony środowiska, które mogłyby przyczyniać się do AD. W podsumowaniu, w odniesieniu do AD szczególne znaczenie wydają się mieć trzy główne problemy badawczo-­‐kliniczne: 1. konieczność właściwego leczenia choroby, zapewniającego dostateczne zabezpieczenie steroidowe, a jednocześnie pozwalającego uniknąć jatrogennych efektów niepożądanych, 2. wczesne wykrywanie współistniejących schorzeń autoimmunologicznych, które powinny być właściwie diagnozowane i odpowiednio szybko leczone, 10 3. próby lepszego zrozumienia etiopatologii autoimmunologicznej AD, której dobre poznanie może wspomóc przyszłe projekty badań przesiewowych oraz dać później podstawę dla zaproponowania środków zapobiegawczych w populacjach wysokiego ryzyka. Powyższe problemy zostały podjęte przez mnie w serii pięciu oryginalnych publikacji badawczych, które zgłaszam łącznie jako osiągnięcie naukowe stanowiące podstawę do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego. Jak wspomniano powyżej, terapia substytucyjna glikokortykosteroidami budzi wiele niepokoju związanego z możliwymi efektami ubocznymi w przypadku zastosowania ich nieodpowiednich dawek. Jednym z najlepiej znanych niepożądanych skutków nadmiaru glikokortykosteroidów jest pogorszenie gęstości mineralnej kości (ang. bone mineral density, BMD) prowadzące do osteoporozy, szczególnie w obrębie kości beleczkowej. Badania BMD u leczonych pacjentów z niedoczynnością kory nadnerczy przynoszą jednak sporne wyniki, a ocena markerów obrotu kostnego nie potwierdziła jednoznacznie szkodliwego działania substytucyjnych dawek glikokortykosteroidów, które są znacznie niższe od tych, stosowanych w celach przeciwzapalnych [20-­‐22,67]. Biorąc pod uwagę te kontrowersje, postanowiliśmy zbadać kolejnego uczestnika remodelingu kostnego, jakim jest układ Receptor Activator of Nuclear factor κB (RANK) -­‐ RANK Ligand (RANKL) -­‐ Osteoprotegeryna (OPG), który nie był nigdy wcześniej oceniany u pacjentów podczas terapii AD. Obserwacje z tego badania zawarliśmy w artykule zatytułowanym “Increased serum osteoprotegerin in patients with primary adrenal insufficiency receiving conventional hydrocortisone substitution”, który został opublikowany w Journal of Physiology and Pharmacology 2012; 63: 677-­‐82. Cząsteczki RANK ulegają ekspresji na powierzchni prekursorów osteoklastów [68]. RANK jest aktywowany przez ligand RANKL, cytokinę produkowaną przez osteoblasty, śródbłonek oraz aktywowane limfocyty T [69]. Interakcja RANK-­‐RANKL nasila różnicowanie osteoklastów, ich dojrzewanie i przeżycie [68,70]. Efekty biologiczne RANKL są równoważone przez OPG – syntetyzowany przez osteoblasty rozpuszczalny receptor, który kompetycyjnie blokuje dostęp RANKL do jego receptora, RANK [70]. Podczas gdy RANKL pozostaje związany przez OPG, upośledzone są fuzja, czynność i przeżycie osteoklastów. Dlatego OPG pozostaje endogennym regulatorem sygnalizacji RANK-­‐RANKL. Według badań in vitro, nierównowaga pomiędzy RANKL i OPG może 11 stanowić kluczowy mechanizm w indukowanej glikokortykosteroidami utracie masy kostnej [71]. Celem naszego projektu była ocena wpływu standardowego leczenia substytucyjnego z użyciem HC na stężenia OPG i RANKL w surowicy chorych z niewydolnością kory nadnerczy w relacji do ich BMD. Badaniem objęto 80 pacjentów oraz 63 zdrowe osoby. U chorych i zdrowych oceniono stężenie OPG, rozpuszczalnego RANKL oraz wykonano analizy biochemiczne. BMD badano u chorych z użyciem techniki dwuwiązkowej absorpcjometrii rentgenowskiej (ang. dual-­‐energy X-­‐ray absorptiometry, DEXA), a jej interpretację oparto na kryteriach WHO dotyczących wskaźnika T. Osteoporoza i osteopenia w odcinku lędźwiowym kręgosłupa zostały stwierdzone odpowiednio u 15,0% i 38,7% pacjentów, podczas gdy w szyjce kości udowej – u 6,3% oraz 41,2%. Stężenie OPG w surowicy chorych (3,03 ±0,86 pmol/l) okazało się istotnie wyższe niż u kontroli (2,47 ±1,05 pmol/l, p=0,002). Natomiast stężenia rozpuszczalnego RANKL były zbliżone w obu grupach (502 ±489 vs. 478 ±358 pmol/l, p=0,430). Stężenie OPG rosło wraz z wiekiem (p<0,001) oraz czasem trwania choroby (p=0,001). Nie wykryto natomiast jego związku z dobową dawką HC. Poziom OPG korelował negatywnie z DHEA-­‐S w surowicy (p=0,008), a także z BMD w kręgosłupie lędźwiowym (p<0,001) oraz w szyjce kości udowej (p=0,003). W modelu wielorakiej regresji wiek pacjenta i DHEA-­‐S okazały się najlepszymi predyktorami stężenia OPG (p<0,001), podczas gdy wpływ czasu trwania choroby oraz BMI przestały być istotne statystycznie. Stężenia rozpuszczalnego RANKL korelowały negatywnie z czasem trwania choroby (p=0,029), a pozytywnie – jedynie z dawką HC (p=0,018). Doświadczenia na osteoblastach, jak również dane kliniczne z krótkoterminowej terapii systemowej glikokortykosteroidami sugerują ich supresyjny wpływ na OPG [71,72]. Z kolei u pacjentów z zespołem Cushinga donoszono o podwyższonych stężeniach OPG w surowicy [73,74]. Niektórzy autorzy sugerują zatem bimodalne zachowanie OPG w odpowiedzi na nadmiar glikokortykosteroidów: początkowy gwałtowny spadek, który odzwierciedla efekt supresyjny względem osteoblastów, a następnie długotrwały wzrost syntezy OPG dla ochrony kości przed szkodliwym działaniem steroidów [74]. Rzeczywiście, wyższe stężenia OPG są stwierdzane u pacjentów z osteoporozą jako efekt nasilonego obrotu kostnego oraz jako prawdopodobna reakcja kompensująca nadmierną aktywność osteoklastów [75,76]. Dlatego możliwe jest, że to upośledzona BMD u znacznej części naszych chorych z AD przyczynia się do podwyższonych stężeń 12 OPG w tej grupie. Jednakże korelacja między OPG i BMD znikała w modelu regresji wieloczynnikowej oraz po uwzględnieniu wieku. Warto podkreślić, iż w naszym badaniu OPG korelowała negatywnie ze stężeniem DHEA-­‐S w surowicy. Działanie androgenów obniżające poziom OPG było wcześniej wykazywane in vitro oraz potwierdzone klinicznie u mężczyzn z jatrogennym hipogonadyzmem oraz u kobiet z zespołem policystycznych jajników [77-­‐79]. Zatem podwyższone stężenia OPG u naszych chorych mogły także wiązać się z niedoborem androgenów nadnerczowych. Uważa się, że androgeny nadnerczowe odgrywają rolę ochronną względem kości, a niedobór DHEA przyczynia się do zwiększonego ryzyka osteoporozy w przebiegu AD [80]. W przeciwieństwie do OPG, analizy in vitro wskazują iż glikokortykosteroidy nasilają ekspresję RANKL w osteoblastach [71]. Zgodnie z tymi obserwacjami stężenia RANKL w naszym badaniu korelowały z dzienną dawką HC. Ponieważ jest to główny czynnik dojrzewania osteoklastów, można było spodziewać się, że RANKL będzie korelował z nasileniem resorpcji kostnej. Jednakże, pomimo wcześniejszych doniesień, nasze badanie nie wykazało korelacji RANKL z BMD [76,81]. W podsumowaniu, powyższe badanie jest pierwszą próbą oceny efektów terapii substytucyjnej z zastosowaniem HC na stężenie OPG i rozpuszczalnego RANKL w surowicy oraz skorelowania ich z BMD. Podwyższone stężenia OPG wykryte u pacjentów z AD mogą odzwierciedlać kompensacyjną odpowiedź na nasilenie resorpcji kostnej związanej z nadmiarem egzogennych steroidów i/lub wynikać z niedoboru androgenów nadnerczowych. Podczas leczenia substytucyjnego glikokortykosteroidami stężenia RANKL pozostają w zakresie normy i korelują z dobową dawką HC. Moje kolejne badanie w pierwotnej niedoczynności kory nadnerczy, także dotyczące możliwych niepożądanych efektów substytucji glikokortykosteroidowej, miało na celu ocenę stężenia adipokin – leptyny, adiponektyny oraz rezystyny – w surowicy chorych z AD w trakcie przewlekłej terapii. Niedawne doniesienia szwedzkie oparte o dane z rejestrów systemu opieki zdrowotnej, sugerowały zwiększoną śmiertelność wśród leczonych pacjentów z AD [11,12]. Wzrost śmiertelności wiązał się nie tylko z przypadkami przełomów nadnerczowych, ale również wydawał się mieć statystyczny związek z chorobą niedokrwienną serca oraz udarem mózgu [11,12,82]. Kilka badań u osób z niedoczynnością kory nadnerczy 13 udokumentowało następnie wyższą częstość występowania czynników ryzyka kardiometabolicznego, takich jak otyłość brzuszna, dyslipidemia, czy upośledzona tolerancja glukozy, a zaburzenia te były przypisywane prawdopodobnemu nadmiarowi pobieranych steroidów [9,10]. Powyższe obserwacje zainspirowały mnie do analizy krążących adipokin u pacjentów z AD oraz oceny ich związku z parametrami antropometrycznymi, biochemicznymi i hormonalnymi. Adipokiny są peptydami syntetyzowanymi przez tkankę tłuszczową, które w sposób auto-­‐, para-­‐ oraz endokrynny integrują równowagę energetyczną, pobór pożywienia i metabolizm glukozowo-­‐lipidowy. Zaburzone stężenia adopokin są często uznawane za markery chorób kardiometabolicznych [83-­‐85]. Do naszej analizy wybraliśmy leptynę, adiponektynę oraz rezystynę, które podlegają wpływowi glikokortykosteroidów. W skrócie, produkcja leptyny, działającej jako centralny sygnał lipostatyczny, jest stymulowana przez glikokortykosteroidy [86-­‐88]. Większość danych dotyczących adiponektyny, zwiększającego przeciwzapalnym i wrażliwość przeciwaterogennym, na insulinę dowodzi białka o hamującego działaniu efektu glikokortykosteroidów na jej syntezę [88,89]. Z kolei ekspresja rezystyny, prozapalnej adipokiny nazwanej z uwagi na zdolność indukowania insulinooporności u gryzoni, jest nasilana pod wpływem deksametazonu, a jej podwyższone stężenia w surowicy występują w zespole Cushinga, także w przypadkach subklinicznego hiperkortyzolizmu [88,90]. Nasza analiza obejmowała 63 pacjentów oraz 63 zdrowe osoby dobrane płcią, wiekiem i BMI. Średni czas trwania terapii substytucyjnej wynosił 11,0 ±10,4 lat, natomiast średnia dobowa dawka HC wynosiła 24,1 ±5,8mg. Większość pacjentów (81%) otrzymywała też fludrokortyzon, a 19 z nich pobierało dodatkowo 10-­‐25mg DHEA dziennie przez ostatnie ≥6 miesięcy. Stężenia adipokin w surowicy, profil lipidowy oraz glikemia były oceniane w obu badanych grupach. ACTH, insulina, wskaźnik HOMA-­‐IR, DHEA-­‐S, kortyzolemia oraz 24h wydalanie kortyzolu z moczem określano w grupie chorych. Ponadto, metodą DEXA badano skład masy ciała. Stężenia leptyny i adiponektyny w surowicy były podobne u pacjentów i osób zdrowych (odpowiednio p=0,749 i p=0,389), podczas gdy poziom rezystyny był istotnie niższy u chorych (982 ±386 vs. 1169 ±286 pg/ml, p=0,0002). Jej stężenia słabo korelowały ze współczynnikiem HOMA-­‐IR (ang. Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance) (p=0,048) i okazały się niezależne od innych czynników. Krążąca leptyna pozytywnie 14 korelowała z insulinemią na czczo, HOMA-­‐IR, BMI oraz zawartością tkanki tłuszczowej (p<0,001). W modelu regresji wieloczynnikowej jedynie masa ciała (p=0,017), cholesterol całkowity oraz HDL (p<0,001) okazały się istotnymi predyktorami stężenia adiponektyny. Nie wykryto korelacji pomiędzy badanymi adipokinami a stężeniami kortyzolu ani dobową dawką HC. Zarówno leptyna jak i adiponektyna były negatywnie skorelowane ze stężeniami DHEA-­‐
S, jednak żadna z tych korelacji nie przetrwała w analizie regresji wieloczynnikowej. Jakkolwiek analiza post-­‐hoc wykazała, że pacjenci otrzymujący substytucję DHEA prezentowali niższe stężenia obu adipokin (p=0,040 dla leptyny i p=0,017 dla adiponektyny). Supresyjny efekt androgenów, pozostający w zgodzie z danymi z badań in vitro, mógłby również tłumaczyć istotnie wyższe stężenia tych adipokin obserwowane u kobiet zarówno w grupie osób z AD, jak i zdrowych [91]. Podsumowując, nasz badanie nie wykazało patologicznego profilu adipokin u pacjentów z AD leczonych substytucyjnie. Stężenia adipokin u osób chorych prezentowały podobne korelacje do tych opisywanych u zdrowych. Dalsze badania są konieczne dla potwierdzenia i wyjaśnienia zwiększonej śmiertelności z przyczyn naczyniowo-­‐
sercowych w przebiegu pierwotnej niewydolności nadnerczy. Substytucja DHEA może obniżać stężenia leptyny i adiponektyny w surowicy, co powinno być brane pod uwagę w aktualnej dyskusji nad możliwymi korzyściami uzupełniania androgenów nadnerczowych u chorych z AD. Artykuł przygotowany na podstawie powyższego badania, zatytułowany “Steroid replacement in primary adrenal failure does not appear to affect circulating adipokines” opublikowany został w czasopiśmie Endocrine 2015; 48(2): 677-­‐85. doi: 10.1007/s12020-­‐014-­‐0388-­‐6. Problematykę terapii AD podjęłam także w artykule zatytułowanym „Polymorphic variants of the HSD11B1 gene may be involved in adverse metabolic effects of glucocorticoid replacement therapy in Addison’s disease” i opublikowanym w European Journal of Internal Medicine, 2016; 31: 99-­‐104. doi: 10.1016/j.ejim.2016.03.027. W doniesieniach o zwiększonej częstości zaburzeń tolerancji glukozy, dyslipidemii i otyłości trzewnej u osób leczonych z powodu niedoczynności kory nadnerczy sugerowano związek tych zaburzeń z nieadekwatnym dawkowaniem glikokortykosteroidów [9,10]. Niestety, brak jest sprawdzonych markerów, które 15 ułatwiałyby optymalizację substytucji steroidowej, a dawka glikokortykosteroidów jest zwykle ustalana na podstawie danych klinicznych, obejmujących m.in. informacje o samopoczuciu pacjenta, zmianach jego masy ciała, wartości ciśnienia tętniczego krwi oraz stężeń sodu i potasu w surowicy [92]. Przesłanką do naszego badania były obserwacje, iż pacjenci z AD prezentują zróżnicowane zapotrzebowanie substytucyjne. Dawki HC odpowiednie dla części z nich mogą wywoływać objawy niepożądane u innych, pomimo zbliżonej masy ciała i natężenia codziennej aktywności. To zjawisko można by wyjaśnić faktem, że działanie glikokortykosteroidów w tkankach docelowych jest modulowane poprzez lokalną dostępność aktywnego kortyzolu, uwarunkowaną aktywnością dehydrogenazy 11β-­‐hydroksysteroidowej (11βHSD). Enzym ten występuje w dwóch izoformach, 11βHSD typu 1 i typu 2, kodowanych przez odrębne geny – HSD11B1 oraz HSD11B2. Typ 1 11βHSD jest rozpowszechniony w tkankach ssaków, szczególnie w wątrobie, tkance tłuszczowej i ośrodkowym układzie nerwowym, gdzie działa głównie jako ketoreduktaza, odpowiedzialna za regenerację nieaktywnego kortyzonu do kortyzolu [93]. Rzadkie mutacje inaktywujące HSD11B1 są przyczyną niedoboru reduktazy kortyzonu, który objawia się zwiększeniem klirensu kortyzolu i ACTH-­‐zależnym hiperandrogenizmem nadnerczowym [94]. Powszechne polimorficzne warianty HSD11B1 są wiązane z występowaniem składowych zespołu metabolicznego: nadciśnienia, otyłości, insulinooporności oraz cukrzycy typu 2 [95-­‐97]. Wyniki badań czynnościowych wskazują, że polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (ang. single nucleotide polymorphism, SNP) genu HSD11B1 mogą wpływać na aktywność transkrypcyjną, a w konsekwencji – na ekspresję i aktywność enzymu in vitro oraz in vivo [97,98]. Transgeniczne myszy z nadekspresją Hsd11b1 rozwijają otyłość trzewną, insulinooporną cukrzycę oraz dyslipidemię [99]. W tkance tłuszczowej osób otyłych stwierdzono zwiększoną ekspresję 11βHSD typu 1, skorelowaną ze stopniem otyłości i insulinooporności [100]. Nasze badanie zostało zaplanowane dla oceny wpływu polimorfizmów HSD11B1 na indywidualne zapotrzebowanie na glikokortykosteroidy w leczeniu substytucyjnym oraz na metaboliczne efekty tej terapii. Gdyby warianty HSD11B1 okazały się klinicznie istotne, ich analiza mogłaby wspomagać rutynową opiekę nad chorymi z AD. Badaniem objęliśmy 152 pacjentów z AD leczonych substytucyjnie przynajmniej od roku. Przeprowadziliśmy genotypowanie wybranych polimorfizmów HSD11B1 -­‐ rs846910 16 G/A, rs3753519 G/A i rs12086634 T/G – oraz oceniliśmy ich możliwy wpływ na parametry antropometryczne, hormonalne i metaboliczne. Stratyfikacja wg genotypów HSD11B1 nie wykazała różnic wieku, czasu trwania choroby, ani pobieranej dawki HC. W analizie porównawczej względem genotypów rs3753519 stwierdzono istotne różnice w BMI (p<0.001), glikemii na czczo (ang. fasting plasma glucose, FPG) (p<0.001) oraz HOMA-­‐IR (p=0.021) między homozygotami typu dzikiego a nosicielami rzadszego allelu, którzy prezentowali wyższe wartości BMI, FPG i HOMA-­‐IR. Jednakże związek z HOMA-­‐IR utracił istotność statystyczną w modelu regresji wieloczynnikowej uwzględniającym wiek, płeć, BMI oraz dawkę HC (p=0.300) oraz po zastosowaniu poprawki Bonferroniego dla testów wielokrotnych. Z kolei homozygoty allelu dzikiego rs12086634 prezentowały wyższe stężenia trójglicerydów (p=0.035), cholesterolu całkowitego (p=0.001) i LDL (p=0.003) w surowicy. Poprawka uwzględniająca wiek, płeć, BMI i stosowaną dawkę HC spowodowała utratę istotności związku rs12086634 z krążącymi trójglicerydami (p=0.061). Całkowity cholesterol okazał się jedyną zmienną, która pozostała istotnie związana z rs12086634 po poprawce Bonferroniego. Nie wykazaliśmy natomiast związku pomiędzy rs846910 a żadną z cech klinicznych ani biochemicznych. W podsumowaniu, wyniki naszego badania sugerują rolę regulatorową wariantów HSD11B1 względem indywidualnej reakcji na glikokortykosteroidy, a zatem ich możliwy wpływ na adekwatność dawek substytucyjnych HC. Na uwagę zasługuje fakt, iż podczas recenzowania naszego manuskryptu, pojawiły się nowe niezależne dane. HSD11B1 został przeanalizowany w niewielkiej grupie węgierskich pacjentów z AD, gdzie potwierdzono związek rs4844880, polimorfizmu który pozostaje w tym samym bloku haplotypowym co rs3753519, z BMI oraz wzrostem masy ciała podczas leczenia glikokrtykosteroidami [101]. Jakkolwiek wyniki węgierskie nie powielają dokładnie naszych obserwacji, powyższe dane dodatkowo wskazują na znaczenie wariantów enzymu w farmakogenetyce niewydolności kory nadnerczy. W przyszłości, molekularna analiza HSD11B1 wraz z genotypowaniem genu receptora glikokortykosteroidów (NR3C1) mogą wspomóc indywidualny dobór dawek substytucyjnych i wskazać pacjentów wymagających szczególnie ścisłego nadzoru. W pracy badawczej skupiałam się także na problemie współistniejących schorzeń autoimmunologicznych, które dotykają pacjentów z AD i mogą poważnie utrudnić ich 17 leczenie. Rozpoczęłam od ogólnej analizy oceniającej częstość występowania różnych chorób autoimmunologicznych oraz ich postaci subklinicznych w naszej grupie pacjentów (opublikowane w Endocrine, 2010). Natomiast ostatnio, we współpracy z Kolegami z Kliniki Chorób Wewnętrznych i Diabetologii oraz Kliniki Diabetologii i Otyłości Wieku Rozwojowego naszej Uczelni, badaliśmy częstość występowania T1D oraz autoprzeciwciał specyficznych dla komórek beta u osób z autoimmunologiczną AD. Badanie obejmowało nie tylko tradycyjne markery autoimmunizacji skierowanej przeciwko komórkom beta, czyli autoprzeciwciała przeciwko insulinie (ang. insulin autoantibodies, IAA), dekarboksylazie kwasu glutaminowego (ang. glutamic acid decarboxylase antibodies, GADA) oraz fosfatazie tyrozynowej (ang. insulinoma-­‐associated protein-­‐2, IA-­‐2), ale także niedawno zidentyfikowane przeciwciała przeciwko transporterowi cynkowemu 8 (ang. zinc transporter 8 autoantibodies, ZnT8A), nowemu swoistemu autoantygenowi w T1D [102]. ZnT8A nie były wcześniej badane w klinicznie dobrze zdefiniowanych grupach pacjentów z AD. Postanowiliśmy szczegółowo ocenić ich występowanie względem współistnienia cukrzycy, innych schorzeń autoimmunologicznych oraz innych autoprzeciwciał. Ponadto przeprowadziliśmy genotypowanie wariantu rs13266634 C/T genu SLC30A8 kodującego ZnT8 [103]. W badaniu wzięło udział 140 pacjentów z AD, w wieku 47,5 ±15,0 lat. T1D stwierdziliśmy u 10% z nich, co pokrywa się ze współczesnymi analizami wśród osób z AD z innych populacji europejskich [13]. Średni wiek w momencie rozpoznania T1D wynosił 41,6 ±15,8 lat, a średni czas trwania T1D w momencie badania 5,5 ±3,8 lat. ZnT8A były wykrywalne w surowicy u 8,5%, GADA u 20,0%, IA-­‐2A u 5,7%, IAA u 1,6% (pomijając pacjentów leczonych insuliną), przeciwciała przeciwko peroksydazie tarczycowej u 67,8%, przeciwko tyreoglobulinie u 45,0%, a przeciw receptorowi dla TSH u 7,1% badanych pacjentów z AD. Łącznie, obecność autoprzeciwciał przeciw antygenom komórek beta stwierdziliśmy u 37 (26,4%) pacjentów: u wszystkich osób z T1D, 2 osób z wcześniej rozpoznaną cukrzycą typu 2 (T2D) oraz 21 bez wywiadu obciążonego cukrzycą. GADA pozostawały najczęstszym znaleziskiem, wykrywane u 71,4% osób z T1D, 11,1% z T2D i 14,5% pacjentów z AD bez cukrzycy. ZnT8A okazały się drugim co do częstości markerem autoimmunizacji trzustkowej w T1D u osób z AD (57,1%), wykrywanym też u 3,4% pacjentów bez cukrzycy. 42,9% chorych z T1D wykazywało obecność dwóch swoistości autoprzeciwciał, a dwie osoby z T1D prezentowały reaktywność względem trzech autoantygenów komórek beta. Badanie 18 ZnT8A pozwoliło wykryć autoimmunizację u dwóch (14,3%) pacjentów z T1D, którzy w oparciu wyłącznie o ocenę wcześniej znanych markerów, byliby uznani za osoby z T1D bez autoprzeciwciał. Co ciekawe, pozytywne markery serologiczne autoimmunizacji skierowanej przeciwko komórkom beta stwierdziliśmy u 21 (17,9%) pacjentów z AD bez zdiagnozowanej wcześniejszej cukrzycy. Dalsza diagnostyka wykazała, że troje spośród nich prezentowało upośledzoną tolerancję glukozy, co potwierdziło wysokie ryzyko cukrzycy oraz konieczność ścisłego nadzoru. Podział pacjentów z AD ze względu na obecność lub brak ZnT8A wykazał istotnie wyższą liczbę dodatkowych schorzeń autoimmunologicznych u chorych seropozytywnych (p<0,001). Osoby ZnT8A-­‐pozytywne prezentowały wyższą częstość T1D oraz częstość występowania i stężenia przeciwciał przeciw innym antygenom komórek beta. Genotypowanie polimorfizmu rs13266634 genu SLC30A8 wykazało 66 (47,1%) homozygot CC, 62 (44,3%) heterozygoty oraz 12 (8,6%) homozygot TT wśród 140 chorych z AD. Homozygoty TT prezentowały najwyższą częstość oraz stężenia krążących ZnT8A w porównaniu z osobami o genotypie CT i CC (odpowiednio p=0,006 oraz p=0,002). Analogicznie do wcześniejszych doniesień w T1D, obecność allelu T była związana z wyższym ryzykiem rozwoju ZnT8A w AD (14,0% vs. 6,2%, OR 2,46 [95% CI 1,06-­‐5,72] p=0,032) [103,104]. W podsumowaniu, powyższe badanie wykazało wysoką częstość występowania ZnT8A u pacjentów z autoimmunologiczną AD. ZnT8A wiążą się ze współistnieniem T1D oraz, wspólnie z GADA, mogą wskazywać na ryzyko rozwoju zaburzeń glikemii u osób z AD bez rozpoznanej wcześniej cukrzycy. Ponadto, pozytywne oznaczenia ZnT8A w AD sugerują szczególnie zwiększone ryzyko występowania dodatkowych zaburzeń autoimmunologicznych. W wyniku naszego badania powstał manuskrypt zatytułowany “Positive autoantibodies to ZnT8 indicate elevated risk for additional autoimmune conditions in patients with Addison’s disease“, który opublikowano w czasopiśmie Endocrine 2016; 53(1): 249-­‐57. doi: 10.1007/s12020-­‐016-­‐0916-­‐7. Poza badaniami klinicznymi, byłam również aktywnie zaangażowana w analizy mające na celu zrozumienie patofizjologii zaburzeń prowadzących do autoimmunologicznej 19 niewydolności kory nadnerczy. W artykule zatytułowanym “Interleukin-­‐2 and subunit alpha of its soluble receptor in autoimmune Addison’s disease – an association study and expression analysis”, który został opublikowany w Autoimmunity 2015; 48(2): 100-­‐
7. doi: 10.3109/08916934.2014.976628, opisaliśmy badania dotyczące układu interleukiny-­‐2 (IL2) w AD. IL2 jest nie tylko czynnikiem wzrostowym dla komórek T, ale także ma krytyczne znaczenie dla rozwoju, proliferacji i homeostazy limfocytów T regulatorowych CD4+CD25+FOXP3 (Tregs), subpopulacji zdolnej do supresji autoreaktywnych komórek T, które uniknęły negatywnej selekcji w grasicy. Myszy z niedoborem IL2 rozwijają letalną uogólnioną autoimmunizację z masywnymi naciekami zapalnymi oraz obecnością wielu autoprzeciwciał [105]. IL2 działa poprzez heterotrimeryczny receptor błonowy, złożony z podjednostek beta i gamma wspólnych dla innych receptorów interleukin, oraz specyficznej podjednostki alfa (IL2Ra, znanej równej jako CD25) nadającej wysokie powinowactwo dla IL2 [106]. Łańcuch alfa ulega konstytutywnej ekspresji na Tregs i pojawia się na aktywowanych komórkach T efektorowych. Podczas aktywacji limfocytów T, rozpuszczalne IL2Ra (sIL2Ra) są uwalnianie do krążenia z powierzchni komórek na drodze proteolizy. Rzadkie mutacje genu IL2RA u ludzi prowadzą do ciężkiego niedoboru odporności z obfitymi naciekami komórek T oraz objawami autoimmunizacji [107]. Polimorficzne warianty genów IL2 oraz IL2RA są związane z wieloma schorzeniami autoimmunologicznymi, w tym T1D, chorobą Graves-­‐
Basedowa, celiakią, stwardnieniem rozsianym i reumatoidalnym zapaleniem stawów [108-­‐111]. Nasze badanie zostało zaprojektowane celem analizy asocjacji między AD a polimorfizmami genów IL2 i IL2RA, oraz jako próba skorelowania genotypów z danymi funkcjonalnymi. U 223 polskich pacjentów z AD rekrutowanych w klinikach endokrynologicznych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu oraz w Centrum Medycznym Kształcenia Podyplomowego w Warszawie oraz u 672 zdrowych dawców krwi genotypowaliśmy 6 wariantów: rs6822844 G/T, rs2069762 T/G i rs3136534 A/C w genie IL2, oraz rs11594656 T/A, rs3118470 T/C i rs2104286 A/G w genie IL2RA. Badania czynnościowe obejmowały analizę ekspresji obu genów na poziomie mRNA oraz białka w eksponowanych na działanie 21-­‐hydroksylazy hodowanych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (ang. peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 20 pochodzących od 24 pacjentów oraz 18 kontroli, oraz ocenę stężenia interleukin w surowicy 85 chorych i 76 zdrowych kontroli dobranych płcią i wiekiem. Częstość rzadszego allelu C rs3136534 była istotnie niższa wśród pacjentów z AD w porównaniu z kontrolami (30,7% vs. 38,6%; OR 0,71; 95%CI 0,561-­‐0,887; p=0,003). Analogicznie różnił się rozkład genotypów w obu grupach (p=0,005). Nie wykazano natomiast różnic w częstościach genotypów i alleli pozostałych badanych wariantów IL2 ani IL2RA. Jedynie komórki osób z AD reagowały na 21-­‐hydroksylazę zwiększeniem mRNA dla IL2 oraz IL2RA (odpowiednio p=0,004 oraz p=0,009 względem kontroli), któremu odpowiadał wzrost stężenia obu cytokin z supernatancie (p=0,031 oraz p=0,001 względem kontroli). Poziom mRNA IL2 w PBMCs od osób z AD stymulowanych 21-­‐
hydroksylazą korelował negatywnie z wiekiem pacjentów (p=0,036) oraz pozytywnie ze stężeniem autoprzeciwciał przeciw 21-­‐hydroksylazie w ich surowicy (p=0,006). Nie stwierdzono różnic w ekspresji IL2 mRNA po stratyfikacji względem SNP tego genu, natomiast nosiciele genotypu AA wariantu rs2104286 genu IL2RA demonstrowali wyższe poziomy mRNA IL2RA po stymulacji 21-­‐hydroksylazą niż heterozygoty AG (509 ±209 vs. 256 ±169, p=0,022). W zgodzie z powyższym, podstawowe wydzielanie sIL2Ra przez PBMCs od osób z AD było zasocjowane z genotypem rs2104286 (197 ±103 u nosicieli AA vs. 106 ±67pg/mL u heterozygot AG, p=0,046), a związek ten był jeszcze wyraźniejszy w przypadku wydzielania sIL2Ra stymulowanego 21-­‐hydroksylazą (293 ±129 vs. 170 ±77 pg/mL, p=0,029). Stężenia IL2 w surowicy chorych z AD były istotnie podwyższone w porównaniu do zdrowych kontroli (4,61 ±4,3 vs. 1,71 ±3,2pg/mL, p<0,001), a osoby z APS prezentowały wyższe stężenia IL2 niż pacjenci z izolowanym AD (4,86 ±4,6 vs. 2,74 ±2,1 pg/mL, p=0,027). Podział według genotypów IL2 rs3136534 nie wykazał różnic w stężeniach IL2. Stężenia sIL2Ra w surowicy okazały się zbliżone u osób chorych i zdrowych (p=0,885) i nie były związane z genotypami IL2RA. Podsumowując, w powyższym badaniu wykazaliśmy asocjację pomiędzy locus IL2 a autoimmunologiczną AD. Polimorfizm rs313653 był pierwotnie wskazany w badaniu replikacyjnym pierwszego GWAS, gdzie wykryto jego umiarkowany związek z T1D [112]. Jednakże, pomimo poszlak in silico o jego możliwym znaczeniu funkcjonalnym, nasza analiza nie wykryła związku pomiędzy genotypami rs3136534 i syntezą IL2. Z kolei sugerowany wcześniej związek pomiędzy AD oraz IL2RA nie został potwierdzony 21 w naszym badaniu [33]. Wykazaliśmy natomiast korelację między genotypem rs2104286 oraz ekspresją IL2RA, szczególnie w warunkach stymulacji, co pozostaje w zgodzie z doniesieniami dotyczącymi sIL2Ra w T1D i stwardnieniu rozsianym [109]. Nowsze dane wskazują, iż homozygotyczni nosiciele wariantu ryzyka rs2104286 prezentują upośledzoną odpowiedź na IL2 pomimo normalnej lub nasilonej ekspresji CD25 na naiwnych Tregs [113]. W badaniu potwierdziliśmy, że limfocyty obwodowe osób z autoimmunologicznym AD zawierają komórki wrażliwe na 21-­‐hydroksylazę, zdolne do odpowiedzi zwiększoną syntezą IL2 oraz łańcucha alfa jej receptora, co jest wykrywalne zarówno na poziomie mRNA jak i białka. Te obserwacje uzupełniają się z wcześniejszym raportem, opisującym zwiększone uwalnianie interferonu gamma oraz IL2 w odpowiedzi na 21-­‐hydroksylazę i jej pochodne peptydy [114]. Negatywna korelacja między wiekiem dawców PBMCs a intensywnością transkrypcji genu IL2 może być wyjaśniona naturalnym osłabieniem aktywności układu immunologicznego i stopniowym spadkiem syntezy IL2 u osób starszych [115]. Ponadto poziom mRNA IL2 w stymulowanych PBMCs istotnie korelował ze stężeniem przeciwciał przeciw 21-­‐hydroksylazie w surowicy chorych. Wcześniej opisywano podobny związek z pomiędzy nasileniem proliferacji PBMCs stymulowanych 21-­‐hydroksylazą a przeciwciałami w surowicy [114]. Nasza analiza wskazuje zasadność prób przekładu wyników badań asocjacyjnych na mechanizmy mogące przyczyniać się do rozwoju choroby, jak na przykład nieprawidłowa sygnalizacja IL2/IL2R, która może prowadzić do zaburzeń czynności limfocytów oraz sprzyjać autoimmunizacji. Pełniejsze badania, obejmujące poszczególne subpopulacje komórkowe, są wskazane celem wyjaśnienia związku pomiędzy zaburzeniem ścieżki IL2/IL2RA a autoimmunizacją nadnerczową. Oryginalne osiągnięcie naukowe oraz możliwe implikacje kliniczne przedstawionej serii artykułów obejmują następujące odkrycia: I.
Pacjenci z niewydolnością kory nadnerczy otrzymujący standardową substytucję steroidową wykazują zwiększone stężenie krążącej OPG, które może odzwierciedlać łagodny nadmiar glikokortykosteroidów i związaną z tym nasiloną resorpcję kostną i/lub może wynikać z niedoboru androgenów nadnerczowych, który także stanowi czynnik ryzyka osteoporozy. Chociaż stężenia RANKL rosną proporcjonalnie do dawki HC, pozostają w normalnym zakresie podczas 22 stosowania typowych schematów substytucyjnych. Pomiary OPG/RANKL w surowicy nie wydają się dogodnym narzędziem do rutynowej oceny klinicznej jako markery zwiększonej resorpcji kostnej u pacjentów stosujących substytucyjnie egzogenne glikokortykosteroidy. II.
Substytucja steroidowa w pierwotnej niedoczynności kory nadnerczy nie wydaje się wpływać niekorzystnie na profil adipokin w surowicy Stężenia leptyny i adiponektyny są zbliżone do osób zdrowych, a poziom rezystyny jest istotnie niższy u leczonych pacjentów z AD niż u kontroli. Ponadto krążące adipokiny wykazują podobny wzorzec korelacji z parametrami antropometrycznymi i biochemicznymi do zależności obserwowanych u osób zdrowych. Zatem zwiększenie śmiertelności naczyniowo-­‐sercowej sugerowane w przebiegu AD, nie może być jednoznacznie wyjaśnione jako efekt nadmiernych dawek glikokortykosteroidów, wywołujących zmiany metaboliczne odzwierciedlane zaburzonymi stężenia adipokin. III.
Warianty czynnościowe genów, które są zaangażowane w lokalną dostępność i działanie kortyzolu, mogą nasilać (lub łagodzić) niepożądane efekty nadmiernej substytucji glikokortykosteroidowej. Polimorfizmy genu HSD11B1 wykazują związek z BMI, glikemią na czczo i stężeniem cholesterolu u pacjentów leczonych z powodu AD. W przyszłości genotypowanie HSD11B1 mogłoby wspomóc ustalanie indywidualnych dawek substytucyjnych i ułatwiać selekcję pacjentów o większej skłonności do rozwoju niekorzystnego profilu metabolicznego, wymagających ściślejszej kontroli. IV.
Pozytywne wyniki oznaczeń ZnT8A są częstym znaleziskiem w przebiegu autoimmunologicznego AD, szczególnie u homozygotycznych nosicieli allelu T rs13266634 w genie SLC30A8. Włączenie ZnT8A to panelu wcześniej znanych markerów autoimmunizacji skierowanej przeciwko komórkom beta poprawia wykrywalność etiologii autoimmunologicznej cukrzycy i umożliwia identyfikację osób zagrożonych zaburzeniami glikemii wśród pacjentów z AD. Ponadto, dodatnie ZnT8A u chorych z AD wskazują na wyższe ryzyko dodatkowych schorzeń autoimmunologicznych. Biorąc pod uwagę częste współwystępowanie T1D i AD, przeciwciała przeciwko antygenom komórek beta, w tym ZnT8, powinny być uwzględnione w panelach badań kontrolnych wykonywanych w tej populacji wysokiego ryzyka. 23 V.
Stwierdzono związek między locus IL2 a autoimmunologiczną AD w populacji polskiej. Pomimo braku asocjacji niewydolności nadnerczy z polimorfizmem IL2RA, wykryto korelację między genotypami rs2104286 a ekspresją IL2RA, szczególnie w warunkach swoistej stymulacji 21-­‐hydroksylazą. Badanie dowodzi, że obwodowe limfocyty osób z AD zawierają komórki uczulone na 21-­‐
hydroksylazę, zdolne do odpowiedzi zwiększoną syntezą interleukiny-­‐2 oraz łańcucha alfa jej receptora. Poziom mRNA dla IL2 w komórkach od pacjentów z AD stymulowanych 21-­‐hydroksylazą koreluje negatywnie ze stężeniem autoprzeciwciał przeciw temu enzymowi. Stężenia IL2 w surowicy chorych z AD są podwyższone w porównaniu ze zdrowymi kontrolami, a osoby z APS wykazują wyższe stężenia tej cytokiny w porównaniu z pacjentami z izolowaną AD. Zaburzenia sygnalizacji IL2/IL2R w AD mogą wpływać na czynność limfocytów i przyczyniać się do rozwoju autoimmunizacji. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-­‐badawczych Analiza bibliometryczna dorobku naukowego Poza serią pięciu oryginalnych artykułów, które przedkładam jako osiągnięcie naukowe, ubiegając się o uzyskanie stopnia doktora habilitowanego nauk medycznych, jestem również autorką 36 innych publikacji, o łącznym wskaźniku Impact Factor 60,433 oraz punktacji MNiSW 662,5. W moim dorobku znajdują się: •
24 publikacje oryginalne, z czego 22 artykuły ze współczynnikiem IF (łączny IF 57,569; MNiSW 585) •
9 prac poglądowych i kazuistycznych (łączny IF 2,864; MNiSW 66,5) •
3 rozdziały w podręcznikach (łączna punktacja MNiSW 11) •
25 komunikatów naukowych z konferencji krajowych (13 doniesień, z czego 3 prezentacje ustne) i zjazdów zagranicznych (12 doniesień, w tym 1 prezentacja ustna) •
Indeks Hirscha (wg Web of Science): 7 •
133 cytowania (bez autocytowań, wg Web of Science – dotyczy prac zgłoszonych do osiągnięcia naukowego i dorobku) 24 Poza osiągnięciem naukowym, jestem pierwszą autorką 11 publikacji, a drugą – kolejnych 10. Pełna lista moich publikacji, które nie zostały ujęte w osiągnięciu naukowym przedłożonym w celu obiegania się o stopień doktora habilitowanego jest umieszczona w osobnym załączniku do mojego wniosku. Pozostałe kierunki prowadzonych przeze mnie badań, poza osiągnięciem wynikającym z art. 16 ustawy z dnia 14 marca 2003r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) można pogrupować w pięć głównych obszarów zainteresowań: A. Etiopatogeneza choroby Addisona (AD) oraz leczenie chorych z pierwotną niedoczynnością kory nadnerczy Niedoczynność kory nadnerczy pozostaje jednym z moich głównych zainteresowań klinicznych i naukowych. Obok publikacji zgłoszonych jako podstawa do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego, jestem również współautorką większej liczby prac dotyczących tego schorzenia. Już od okresu studiów doktoranckich, prowadziłam badania nad wpływem genów biorących udział w czynności układu immunologicznego na ryzyko rozwoju autoimmunizacyjnej AD. Analizy asocjacyjne prowadzone wspólnie z dr Magdaleną Żurawek z Zakładu Patologii Molekularnej Instytutu Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu obejmowały zarówno warianty genów związanych z czynnością limfocytów (PTPN22, PDCD1), jak i genów zaangażowanych w nieswoistą odpowiedź układu odpornościowego (NLRP1, IFIH1, TLR3). Wyniki naszych badań potwierdziły związek choroby z allelem 1858T genu PTPN22 (Clinical Endocrinology 2009, IF 3,201) oraz wariantem rs12150220 genu NLRP1 (Human Immunology 2010, IF 2,872). Nie udało się natomiast wykazać asocjacji pomiędzy genem PDCD1, IFIH1 ani TLR3 a autoimmunizacyjną AD wśród polskich pacjentów (Clinical Endocrinology 2013, IF 3,353; Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 2016, IF 2,464). Z uwagi na rosnącą liczbę dowodów na ochronny wpływ witaminy D w patogenezie autoimmunizacji, badaliśmy również związek polimorfizmu genu 1alfa-­‐hydroksylazy (CYP27B1), enzymu odpowiadającego za syntezę aktywnej formy witaminy D, z występowaniem AD. Allel typu dzikiego C(-­‐1260)A okazał się istotnie statystycznie częstszy wśród chorych niż zdrowych, szczególnie u osób ze współistniejącymi 25 dodatkowymi chorobami autoimmunizacyjnymi, co potwierdza dane z innych populacji oraz stanowi kolejny argument przemawiający za rolą witaminy D w autoimmunizacji (Experimental and Clinical Endocrinology and Diabetes 2010, IF 1,826). Brałam również aktywny udział badaniach prowadzonych w ramach finansowanego z funduszy Unii Europejskiej projektu EURADRENAL (2009-­‐2012), którego celem było m.in. poszukiwanie nowych genów związanych z występowaniem AD w dużej grupie chorych pochodzących z sześciu krajów, pod kierunkiem prof. Simona Pearce’a z University of Newcastle. Początkowo planowano analizę asocjacji w skali całego genomu (GWAS), jednak z powodu dużej heterogenności genetycznej między poszczególnymi populacjami, poprzestano na selekcji genów kandydatów i ocenie wyników ich genotypowania za pomocą meta-­‐analizy. Ta strategia umożliwiła identyfikację kolejnych genów związanych z AD: STAT4, GATA3, NF-­‐κB1 oraz IL23A, chociaż dwie ostatnie asocjacje ograniczały się do populacji brytyjskiej i włoskiej (PLoS ONE 2014, IF 3,234). W ramach współpracy międzynarodowej w projekcie EURADRENAL uczestniczyłam również w badaniach serologicznych pod kierunkiem prof. Alberto Falorni’ego z Uniwersytetu w Perugii oraz prof. Ake Lernmarka z Uniwersystetu w Lund. Celem analiz było porównanie międzylaboratoryjnej zgodności wyników oznaczeń przeciwciał przeciwko 21-­‐hydroksylazie, głównemu autoantygenowi kory nadnerczy. Rozrzut wyników między różnymi ośrodkami wskazał na potrzebę wprowadzenia międzynarodowego programu standaryzacji, podobnego do tych prowadzonych dla przeciwciał swoistych w cukrzycy typu 1 (Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2015, IF 3,017). Ponieważ pacjenci z AD są szczególnie narażeni na rozwój dodatkowych schorzeń autoimmunizacyjnych, w swoich badaniach podejmowałam także tę ciekawą tematykę. We współpracy z prof. Jarosławem Walkowiakiem z Kliniki Gastroenterologii Dziecięcej i Chorób Metabolicznych naszej Uczelnie przeprowadziliśmy szczegółową analizę współistniejących schorzeń, również w obecnych postaci subklinicznej, która charakteryzuje się obecnością swoistych autoprzeciwciał przy braku lub skąpych objawach. Najczęstszym współistniejącym zaburzeniem była autoimmunizacyjna choroba tarczycy, zwykle w postaci przewlekłego zapalenia (choroby Hashimoto) stwierdzanej u ponad połowy osób z chorobą Addisona. Następne pod względem częstości występowania były: zanikowe zapalenie błony śluzowej żołądka (u 29,9% 26 chorych), niedokrwistość złośliwa (11,8%), hipogonadyzm hipergonadotropowy (8,2%), bielactwo (8,2%), cukrzyca typu 1 (7.1%), choroba trzewna (3,5%) i łysienie plackowate (2,4%) (Endocrine 2010, IF 1,373). Przewlekłe zanikowe zapalenie błony śluzowej żołądka z tendencją do wtórnej hipergastrynemii jest częstym problemem gastroenterologicznym towarzyszącym chorobie Addisona. Wspólnie z dr Ziadem El Ali z Kliniki Chorób Wewnętrznych, Metabolicznych i Dietetyki naszego Uniwersytetu ocenialiśmy występowanie przeciwciał przeciw komórkom okładzinowym żołądka oraz stężenia gastryny i chromograniny A w surowicy chorych. Stwierdziliśmy wysokie wartości chromograninemii, szczególnie u pacjentów z pozytywnymi przeciwciałami przeciwko komórkom okładzinowym, świadczące o ryzyku hiper-­‐/dysplazji komórek ECL (ang. enterochromaffin-­‐like) i sprzyjającej wystąpieniu rakowiaka żołądka (Journal of Endocrinological Investigation 2010, IF 1,476). W długoterminowej terapii substytucyjnej pacjentów z niewydolnością kory nadnerczy kluczowe znaczenie ma odpowiedni dobór dawek glikokortykosteroidów. Ich niedobór grozi niebezpiecznym dla życia przełomem nadnerczowym, natomiast nadmiar egzogennych steroidów może prowadzić do poważnych powikłań metabolicznych. Problem wpływu substytucji steroidowej na wyrównanie metaboliczne, wodno-­‐
elektrolitowe, gospodarkę węglowodanową oraz gęstość mineralną kości analizowałam w grupie 72 chorych leczonych za pomocą standardowych doustnych dawek hydrokortyzonu. Wyniki badania wskazały na celowość okresowej kontroli oraz indywidualizacji stosowanych dawek leku, z preferencją dla częstszych choć mniejszych dawek podstawowych, odpowiednio zwiększanych w warunkach stresu. W rozwoju następstw egzogennej hiperkortyzolemii niekorzystnymi czynnikami są wiek, długotrwałość choroby oraz sumaryczna przyjęta dawka glikokortykosteroidów (Przegląd Lekarski 2011). B. Genetyka cukrzycy typu 1 (T1D) W ramach serii grantów Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego we współpracy z dr Magdaleną Żurawek z Instytutu Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu oraz z zespołem Kliniki Diabetologii i Otyłości Wieku Rozwojowego UMP prowadziłam również badania nad aspektem genetycznym patogenezy T1D. Przedmiotem naszych analiz były geny analogiczne do badanych w chorobie Addisona, ponieważ oba schorzenia mają etiologię 27 autoimmunizacyjną, charakteryzują się pojawianiem się autoprzeciwciał w surowicy, naciekiem limfocytarnym zajętych gruczołów i ich postępującą dysfunkcją endokrynną, a w zakresie genetyki łączą je podobne allele HLA klasy II sprzyjające rozwojowi obu chorób. W dużej grupie polskich pacjentów potwierdziliśmy asocjację genu PTPN22 z T1D, natomiast nie udało się wykazać związku z genami PDCD1, CYP27B1 ani NLRP1 (International Journal of Immunogenetics 2010, IF 1,620; Diabetes Research and Clinical Practice 2011, IF 2,754). Wśród osób z T1D prowadziliśmy także analizy układu interleukiny-­‐2, poprzez ocenę polimorfizmów genów IL2 oraz IL2RA, kodującego podjednostkę alfa (CD25) receptora dla interleukiny-­‐2. Warianty rs11594656 oraz rs3118470 genu IL2RA wykazały istotny statystycznie związek z występowaniem choroby (Tissue Antigens 2012, IF 2,934). Z kolei allel T polimorfizmu rs6822844 genu IL2 był istotnie rzadziej stwierdzany u osób chorych oraz wiązał się wyższymi stężeniami interleukiny-­‐2 w surowicy (Molecular Biology Reports 2013, IF 1,958). W populacji polskiej potwierdziliśmy również związek locus IFIH1 z występowaniem cukrzycy typu 1 (Diabetes Research and Clinical Practice 2015, IF 3,045). Podsumowując, równoległe badania molekularne nad chorobą Addisona, cukrzycą typu 1 oraz innymi narządowo specyficznymi schorzeniami autoimmunizacyjnymi, np. dotyczącymi tarczycy, mają też szerszy kontekst poszukiwania cech wspólnych, sprzyjających ogólnym mechanizmom autoimmunizacji, w odróżnieniu od innych czynników genetycznych czy środowiskowych, które z kolei mogą ukierunkowywać proces autoimmunizacyjny na dany narząd lub gruczoł. C. Rzadkie choroby jednogenowe w endokrynologii Moim kolejnym zainteresowaniem w ramach endokrynologii są rzadkie choroby uwarunkowane mutacjami pojedynczych genów. Już w okresie studiów medycznych miałam okazję badać i opisywać spektrum zaburzeń endokrynologicznych występujących u pacjentów z adrenoleukodystrofią sprzężoną z chromosomem X (Endokrynologia Pediatryczna 2004). Podczas codziennej praktyki klinicznej zwracam szczególną uwagę na możliwe przyczyny genetyczne schorzeń, takich jak pierwotna niedoczynność kory nadnerczy. Jej rzadki przypadek spowodowany wrodzonym niedorozwojem kory nadnerczy zidentyfikowaliśmy po stwierdzeniu towarzyszącego 28 hipogonadyzmu hipogonadotropowego i potwierdziliśmy badaniem molekularnym genu NR0B1 u probanda oraz jego rodziny (Annales d’Endocrinologie 2010, IF 0,583). Obok wspomnianych powyżej rzadkich przyczyn niedoczynności kory nadnerczy, zajmowałam się również hipogonadyzmem hipogonadotropowym, na przykładzie rodzeństwa z opóźnionym dojrzewaniem i normosmią, u którego wykryliśmy dziedziczoną autosomalnie recesywnie mutację genu receptora dla gonadoliberyny (GNRHR) (Endokrynologia Polska 2011, IF 1,239). Nasz artykuł wzbudził zainteresowanie badaczy brazylijskich, pod kierunkiem dr Leticii Silveira z Uniwersytetu w Sao Paulo, którzy stwierdzali tę samą mutację (p.R139H) wśród swoich pacjentów. Z uwagi na istotną imigrację polską do Brazylii w XIX i wczesnym XX wieku, rozważaliśmy możliwość tzw. efektu założyciela (ang. founder effect). Genotypowanie markerów mikrosatelitarnych w locus GNRHR próbek polskich i brazylijskich nie potwierdziło jednak tej tezy (Fertility and Sterility 2014, IF 4,590). D. Badania w onkologii Prowadząc badania naukowe w Instytucie Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu miałam również możliwość uczestniczenia w pracach z zakresu onkologii molekularnej. Badania, w których brałam udział we współpracy z dr Iwoną Ziółkowską-­‐Suchanek obejmowały analizę genów związanych z nowotworami głowy i szyi oraz raka płuc. Wykazaliśmy, iż specyficzne haplotypy genu NBN, kodującego nibrynę, która bierze udział w procesach naprawy DNA, mogą sprzyjać rozwojowi pierwotnych guzów głowy i szyi, a szczególnie raka krtani (Head & Neck 2012, IF 2,833). Opisaliśmy również związek genu IREB2, zaangażowanego w regulację homeostazy żelaza u ssaków, z występowaniem raka płuc w populacji polskiej (Scientific Reports 2015, IF 5,228). Dodatkowo w ostatnich latach uczestniczyłam w badaniach nad schorzeniami hematologicznymi, przede wszystkim nad zmianami molekularnymi związanymi z patogenezą białaczek. We współpracy z dr Agnieszką Dzikiewicz-­‐Krawczyk brałam udział w doświadczeniach, które wykazały asocjację polimorfizmów miejsc wiązania mikroRNA w regionie 3’UTR genów związanych z rozwojem białaczek u dzieci i dorosłych, natomiast w analizach in vitro potwierdziliśmy ich możliwe znaczenie czynnościowe (Journal of Hematology and Oncology 2014, IF 4,812). Z kolei pod kierunkiem profesor Danuty Januszkiewicz-­‐Lewandowskiej poszukiwaliśmy związku 29 obecnych w ludzkim genomie endogennych sekwencji retrowirusowych (HERV) z ostrymi białaczkami u dzieci. Stwierdziliśmy podwyższoną ekspresję sekwencji env HERV-­‐K w leukocytach krwi obwodowej w ostrej białaczce szpikowej (Acta Haematologica 2013, IF 0,994). Prowadziliśmy również badania nad związkiem toksyczności metotreksatu, stosowanego w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci, z polimorfizmami genu reduktazy metylenotetrahydrofolianowej (MTHFR), enzymu metabolizującego 5,10-­‐metylenotetrahydrofolian do 5-­‐metylotetrahydro-­‐
folianu, który jest niezbędny dla przekształcania homocysteiny do metioniny. Wyniki naszych analiz sugerują, iż allel 677T samodzielnie oraz w haplotypie z allelem 1298C może wiązać się z wolniejszym klirensem metotreksatu i większym ryzykiem niepożądanych efektów tego leczenia (European Journal of Pharmacology 2015, IF 2,730). W zakresie onkologii endokrynologicznej brałam udział w prowadzeniu i opisie rzadkiego przypadku pacjenta z guzem neuroendokrynnem grasicy wydzielającym wazopresynę (Współczesna Onkologia 2011, IF 0,107). E. Endokrynologia otyłości i zespołu metabolicznego Oprócz opisanej powyżej tematyki, interesuję się również endokrynologią otyłości. Byłam współautorką pracy przeglądowej dotyczącej złożonej, aktywnej roli tkanki tłuszczowej w układzie dokrewnym, która później była wielokrotnie cytowana w polskim piśmiennictwie (Endokrynologia, Otyłość i Zaburzenia Przemiany Materii, 2005). Następnie, w ramach stypendium w Endocrinology Unit, Centre for Cardiovascular Science na University of Edinburgh brałam udział w doświadczeniach nad znaczeniem glikokortykosteroidów we wczesnym rozwoju postnatalnym komórek beta wysp trzustkowych u myszy. Wstępne wyniki analiz morfometrycznych rozmiaru i liczby wysp razem z danymi funkcjonalnymi pochodzącymi z dootrzewnowych testów tolerancji glukozy były bardzo zachęcające, sugerując istnienie specyficznego okna czasowego korzystnego wpływu glikokortykosteroidów na rozwój komórek beta. Niestety, badanie nie zostało ukończone z uwagi na brak funduszy. Jednakże, badania podstawowe prowadzone w Edynburgu, umożliwiły mi opanowanie nowych umiejętności laboratoryjnych, lepsze zrozumienie fizjologii oraz wzbudziły moje 30 zainteresowanie możliwą rolą glikokortykosteroidów we wczesnym występowaniu zaburzeń metabolicznych. Od maja 2013 prowadzę badania nad rolą glikokortykosteroidów we wczesnym rozwoju nadmiernej masy ciała oraz zespołu metabolicznego. Dzięki grantowi naukowemu Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego mieliśmy możliwość przenalizowania związku pomiędzy obecnością polimorficznych wariantów genów kodujących białka zaangażowane w lokalną dostępność i tkankowe działanie glikokortykosteroidów (NR3C1, FKBP5, HDS11B1, H6PD), a występowaniem otyłości u dzieci i młodzieży oraz wtórnym do otyłości rozwojem zaburzeń hormonalnych i metabolicznych w tej grupie. Badania są obecnie na końcowym etapie. Pierwszy artykuł, dotyczący związku genu FKBP5 z elementami zespołu metabolicznego u dzieci został już wstępnie zrecenzowany w Pediatric Diabetes i wymaga niewielkich korekt (ang. minor revision). Prowadzimy dalsze analizy statystyczne i przygotowujemy dwie kolejne publikacje. 6. Kierowanie międzynarodowymi i krajowymi projektami badawczymi oraz udział w takich projektach •
Współwystępowanie wybranych zaburzeń autoimmunizacyjnych w przebiegu choroby Addisona (2007-­‐2008) Uniwersytet Medyczny w Poznaniu (grant nr 501-­‐
01-­‐0221355-­‐50396) – kierownik •
Określenie występowania polimorfizmów genów PTPN22, PDCD1 lub CYP27B1 dla oceny ryzyka chorób auto-­‐immunizacyjnych układu dokrewnego (2007-­‐2009) grant MNiSW (badania własne N402 1625 33) – główny wykonawca •
Przydatność badania polimorfizmów genu NALP1 dla oceny ryzyka rozwoju cukrzycy typu 1 i choroby Addisona (2008-­‐10) grant MNiSW (badania własne, N402 2266 35) – wykonawca •
Rola polimorfizmów genów interleukiny-­‐2 (IL2) i podjednostki alfa jej receptora (IL2RA) w rozwoju cukrzycy typu 1 oraz autoimmunizacyjnej choroby Addisona – badania asocjacyjne oraz funkcjonalne (2010-­‐2012) grant MNiSW (badania własne, N402 3597 38) – kierownik 31 •
Badanie asocjacji polimorfizmów genu IFIH1 i jego ekspresji dla oceny ryzyka rozwoju cukrzycy typu 1 i autoimmunizacyjnej choroby Addisona (2011-­‐2013) grant MNiSW (badania własne, N402 547540) – wykonawca •
Znaczenie genów kontrolujących tkankową dostępność i działanie glikokortykosteroidów dla rozwoju insulinooporności i zagrożenia cukrzycą typu 2 u dzieci i młodzieży z otyłością (2013-­‐2016) grant naukowy Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego im. Prof. Artura Czyżyka – kierownik •
Analiza microRNA z wykorzystaniem mikromacierzy ekspresyjnych dla oceny ryzyka rozwoju i identyfikacji molekularnych markerów cukrzycy typu 1 (2015-­‐
2018) grant naukowy Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego im. Prof. Artura Czyżyka – główny wykonawca 7. Międzynarodowe i krajowe nagrody za działalność naukową •
Medal Rektora Akademii Medycznej (obecny Uniwersytet Medyczny) im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu (2003) za osiągnięcia naukowe i społeczne podczas studiów medycznych •
Indywidualna nagroda naukowa (2010) Rektora Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu •
Grant wyjazdowy European Society of Human Genetics na doroczną konferencję Towarzystwa w Amsterdamie (2011) •
Stypendium Polish School of Medicine Memorial Fund na pobyt badawczy w Endocrinology Unit, Centre for Cardiovascular Science, University of Edinburgh w Wielkiej Brytanii (2012/2013) •
Grant Society for Endocrinology (2015) na Clinical Department Visit w Centre for Endocrinology, Diabetes and Metabolism, University of Birmingham w Wielkiej Brytanii 32 8. Wygłoszenie referatów na międzynarodowych i krajowych konferencjach tematycznych •
M Fichna, P Fichna, TJ Stradomska (11-­‐13.10.2001) “Niedoczynność kory nadnerczy w przebiegu adrenoleukodystrofii u dzieci i młodzieży”. Endokr Pol 2001; 52; 4 (supl. 1): 146-­‐7. II Konferencja i XI Sympozjum Polskiego Towarzystwa Endokrynologów Dziecięcych. Łódź. •
Marta Fichna, Maria Gryczyńska, Piotr Fichna, Magdalena Żurawek, Danuta Januszkiewicz-­‐Lewandowska, Jerzy Nowak, Jerzy Sowiński (25-­‐28.09.2008) “Spektrum zaburzeń autoimmunologicznych współistniejących z chorobą Addisona oraz ich związek z polimorfizmem C1858T genu PTPN22”. XIX Zjazd Polskiego Towarzystwa Endokrynologicznego; Wrocław •
Marta Fichna (1-­‐2.10.2010) “Genetyczne oraz immunologiczne markery cukrzycy typu 1” I Ogólnopolski Kongres Polskiego Towarzystwa Immunologii Doświadczalnej i Klinicznej, Sekcji Immunologii Wieku Rozwojowego; Warszawa •
Marta Fichna (08-­‐10.11.2010) “Multi-­‐hormonal replacement challenges in type 2 autoimmune polyglandular syndrome”. The Society for Endocrinology Clinical Update 2010 meeting; Bristol, Wielka Brytania •
Marta Fichna (07-­‐09.03.2012) “Osteoprotegerin/RANKL axis in patients with primary adrenal failure on hydrocortisone substitution”. Joint symposium of Euradrenal and The Norwegian Endocrine Society: Addison’s disease, polyendocrine syndromes and beyond – update on research and clinical care; Bergen, Norwegia Piśmiennictwo [1] Bancos I, Hahner S, Tomlinson J, Arlt W. Diagnosis and management of adrenal insufficiency. Lancet Diabetes Endocrinol 2015; 3(3): 216-­‐26. [2] Johannsson G, Falorni A, Skirtic S, Lennernas H, Quinkler M, Monson JP, Stewart PM. Adrenal insufficiency: review of clinical outcomes with current glucocorticoid replacement therapy. Clin Enocrinol (Oxf) 2015; 82(1): 2-­‐11. [3] Husebye ES, Allolio B, Arlt W et al. Consensus statement on the diagnosis, treatment and follow-­‐up of patients with primary adrenal insufficiency. J Int Med. 2014; 275(2): 104-­‐15. 33 [4] Simon N, Castinetti F, Ouliac F, Lesavre N, Brue T, Oliver C. Pharmacokinetic evidence for suboptimal treatment of adrenal insufficiency with currently available hydrocortisone tablets. Clin Pharmacokinet 2010; 49(7): 455-­‐63. [5] Erichsen MM, Lovas K, Fougner KJ, Svartberg J, Hauge ER, Bollerslev J, Berg JP, Mella B, Husebye ES. Normal overall mortality rate in Addison’s disease, but young patients are at risk of premature death. Eur J Endocrinol 2009; 160(2): 233-­‐7. [6] Johannsson G, Bergthorsdottir R, Nilsson AG, Lennernas H, Hedner T, Skirtic S. Improving glucocorticoid replacement therapy using a novel modified-­‐release hydrocortisone tablet: a pharmacokinetic study. Eur J Endocrinol 2009; 161(1): 119-­‐30. [7] Esteban NV, Loughlin T, Yergey AL, Zawadzki JK, Booth JD, WInterer JC, Loriaux DL. Daily cortisol production rate in man determined by stable isotope dilution/mass spectrometry.J Clin Endocrinol Metab 1991, 72(1): 39-­‐45. [8] Smans LC, Van der Valk ES, Hermus AR, Zelissen PM. Incidence of adrenal crisis in patients with adrenal insufficiency. Clin Endocrinol (Oxf) 2016; 84(1): 17-­‐22. [9] Giordano R, Marzotti S, Balbo M, Romagnoli S, Marinazzo E, Berardelli R, Migliaretti G, Benso A, Falorni A, Ghigo E, Arvat E. Metabolic and cardiovascular profile in patients with Addison's disease under conventional glucocorticoid replacement. J Clin Invest 2009; 32(11): 917-­‐23. [10] Ross IL, Bergthorsdottir R, Levitt NS, Schatz DA, Johannsson G, Marais AD. Increased cardiovascular risk in South African patients with Addison's disease. Horm Metab Res 2013; 45(12): 905-­‐10. [11] Bergthordottir R, Leonsson-­‐Zachrisson M, Oden A, Johannsson G. Premature mortality in patients with Addison’s disease: a population-­‐based study. J Clin Endocrinol Metab 2006; 91(12): 4849-­‐53. [12] Bensing S, Brandt L, Tabaroj F, Sjoberg O, Nilsson B, Ekbom A, Blomqvist P, Kämpe O. Increased death risk and altered cancer incidence pattern in patients with isolated or combined autoimmune primary adrenocortical insufficiency. Clin Encorinol (Oxf) 2008; 69(5): 697-­‐704. [13] Betterle C, Scarpa R, Garelli S et al. Addison's disease: a survey on 633 patients in Padova. Eur J Endocrinol 2013; 169(6): 773-­‐84. [14] Fichna M, Fichna P, Gryczynska M, Walkowiak J, Zurawek M, Sowinski J. Screening for associated autoimmune disorders in Polish patients with Addison’s disease. Endocrine 2010, 37(2): 349-­‐60. [15] Neufeld M, Maclaren N, Blizzard R. Autoimmune polyglandular syndromes. Pediatr Ann 1980; 9(4): 154-­‐62. [16] Ranganath L, Gould SR. Increasing need for replacement therapy in long-­‐standing Addison's disease. Postgrad Med. J 1998; 74(871): 291-­‐3. [17] Thomas JB, Petrovsky N, Ambler GR. Addison's disease presenting in four adolescents with type 1 diabetes. Pediatr Diabetes 2004; 5(4): 207-­‐11. [18] Elbelt U, Hahner S, Allolio B. Altered insulin requirement in patients with type 1 diabetes and primary adrenal insufficiency receiving standard glucocorticoid replacement therapy. Eur J Endocrinol 2009; 160(6): 919-­‐24. 34 [19] O’Leary C, Walsh CH, Wieneke P, O’Regan P, Buckley B, O’Halloan DJ, Ferriss JB, Quigley EM, Annis P, Shanahan F, Cronin CC. Coeliac disease and autoimmune Addison's disease: a clinical pitfall. QJM 2002; 95(2): 79-­‐82. [20] Zelissen PM, Croughs RJ, van Rijk PP, Raymakers JA. Effect of glucocorticoid replacement therapy on bone mineral density in patients with Addison disease. Ann Intern Med. 1994; 120(3): 207-­‐10. [21] Koetz KR, Ventz M, Diederich S, Quinkler M. Bone mineral density is not significantly reduced in adult patients on low-­‐dose glucocorticoid replacement therapy. J Clin Endocrinol Metab 2012; 97(1): 85-­‐92. [22] Lovas K, Gjesdal CG, Christensen M, Wolff AB, Almas B, Svartberg J, Fougner KJ, Syversen U, Bollerslev J, Falch JA, Hunt PJ, Chatterjee VK, Husebye ES. Glucocorticoid replacement therapy and pharmacogenetics in Addison's disease: effects on bone. Eur J Endocrinol 2009; 160(6): 993-­‐1002. [23] Lovas K, Husebye ES. High prevalence and increasing incidence of Addison's disease in western Norway. Clin Endocrinol 2002; 56(6): 787-­‐91. [24] Meyer G, Neumann K, Badenhoop K, Linder R. Increasing prevalence of Addison's disease in German females: health insurance data 2008-­‐2012. Eur J Endocrinol 2014; 170(3): 367-­‐73. [25] Napier C, Pearce SH. Autoimmune Addison’s disease. Presse Med. 2012 (12P2): e626-­‐35. [26] Bednarek-­‐Tupikowska G, Fichna M. Niedoczynność kory nadnerczy. W: Endokrynologia kliniczna T. 2. Pod red. A. Milewicza. Wrocław, Polskie Towarzystwo Endokrynologiczne, 2012, 356-­‐369. [27] Husebye ES, Perheentupa J, Rautemaa R, Kampe O. Clinical manifestations and management of patients with autoimmune polyendocrine syndrome type I. J Intern Med 2009; 265(5): 514-­‐29. [28] Mitchell AL, Boe Woff A, MacArthur K, Weaver JU, Vaidya B; Swedish Addison Registry Study Group, Erichsen MM, Darlay R, Husebye ES, Cordell HJ, Pearce SH. Linkage Analysis in Autoimmune Addison's Disease: NFATC1 as a Potential Novel Susceptibility Locus. PLoS One 2015; 10(6): e013550. [29] Mitchell AL, Macarthur KD, Gan EH et al. Association of autoimmune Addison's disease with alleles of STAT4 and GATA3 in European cohorts. PLoS One 2014; 9(3): e88991. [30] Myhcre AG, Undlien DE, Lovas K, Uhlving S, Nedrebo BG, Fougner KJ, Trovik T, Sorheim JI, Husebye ES. Autoimmune adrenocortical failure in Norway autoantibodies and human leukocyte antigen class II associations related to clinical features. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87(2): 618-­‐23. [31] Gombos Z, Hermann R, Kiviniemi M, Nejentsev S, Reimand K, Fadeyev V, Peterson P, Uibo R, Ilonen J. Analysis of extended human leukocyte antigen haplotype association with Addison's disease in three populations. Eur J Endocrinol 2007; 157(6): 757-­‐61. [32] Gambelunghe G, Falorni A, Ghaderi M, Laureti S, Tortoioli C, Santeusanio F, Brunetti P, Sanjeevis CB. Microsatellite polymorphism of the MHC class I chain-­‐
35 related (MIC-­‐A and MIC-­‐B) genes marks the risk for autoimmune Addison's disease. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84(10): 3701-­‐7. [33] Skinningsrud B, Husebye ES, Pearce SH, McDonald DO, Brandal K, Wolff AB, Lovas K, Egeland T, Undlien DE. Polymorphisms in CLEC16A and CIITA at 16p13 are associated with primary adrenal insufficiency. J Clin Endocrinol Metab 2008; 93(9): 3310-­‐7. [34] Brozzetti A, Marzotti S, Tortoioli C et al. Cytotoxic T lymphocyte antigen-­‐4 Ala17 polymorphism is a genetic marker of autoimmune adrenal insufficiency: Italian association study and meta-­‐analysis of European studies. Eur J Endocrinol 2010; 162(2): 361-­‐9. [35] Skinningsrud B, Husebye ES, Gervin K, Lovas K, Blomhoff A, Wolff AB, Kemp EH, Egeland T, Undlien DE. Mutation screening of PTPN22: association of the 1858T-­‐
allele with Addison's disease. Eur J Hum Genet 2008; 16(8): 977-­‐82. [36] Roycroft M, Fichna M, McDonald D, Owen K, Żurawek M, Gryczyńska M, Januszkiewicz-­‐Lewandowska D, Fichna P, Cordell H, Donaldson P, Nowak J, Pearce S. The tryptophan 620 allele of the lymphoid tyrosine phosphatase (PTPN22 gene) predisposes to autoimmune Addison's disease. Clinical Endocrinology (Oxf) 2009; 70(3): 358-­‐362. [37] Lopez ER, Zwermann O, Segni M, Meyer G, Reincke M, Seissler J, Herwig J, Usadel KH, Badenhoop K. A promoter polymorphism of the CYP27B1 gene is associated with Addison's disease, Hashimoto's thyroiditis, Graves' disease and type 1 diabetes mellitus in Germans Eur J Endocrinol 2004; 151(2): 193-­‐7. [38] Fichna M, Żurawek M, Januszkiewicz-­‐Lewandowska M, Gryczyńska M, Fichna P, Sowiński J, Nowak J. Association of the CYP27B1 C(-­‐1260)A polymorphism with autoimmune Addison’s disease. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes 2010; 118(8): 544-­‐9. [39] Magitta NF, Boe Wolf AS, Johansson S, Skinningsrud B, Lie BA, Myhr KM, Undlien DE, Joner G, Njolstad PR, Kvien TK, Forre O, Knappskog PM, Husebye ES. A coding polymorphism in NALP1 confers risk for autoimmune Addison's disease and type 1 diabetes. Genes Immun 2009; 10(2): 120-­‐4. [40] Żurawek M, Fichna M, Januszkiewicz-­‐Lewandowska D, Gryczyńska M, Fichna P, Nowak J. A coding variant in NLRP1 is associated with autoimmune Addison’s disease. Human Immunology 2010; 71(5): 530-­‐4. [41] Mitchell AL, Cordell HJ, Soemedi R, Owen K, Skinningsrud B, Wolff AB, Ericksen M, Undlien D, Husebye ES, Pearce SH. Programmed death ligand 1 (PD-­‐L1) gene variants contribute to autoimmune Addison's disease and Graves' disease susceptibility. J Clin Endocrinol Metab 2009; 94(12): 5139-­‐45. [42] Jurecka-­‐Lubieniecka B, Ploski R, Kula D, Krol A, Bedbarczuk T, Kolocza Z, Tukiendorf A, Szpak-­‐Ulczok S, Stanjek-­‐Cichoracka A, Polanska J, Jarzab B. Association between age at diagnosis of Graves' disease and variants in genes involved in immune response. PLoS One 2013(3):359349. 36 [43] Fichna M, Żurawek M, Januszkiewicz-­‐Lewandowska D, Fichna P, Nowak J. PTPN22, PDCD1 and CYP27B1 polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes in Polish patients. Int J Immunogenet 2010; 37(5): 367-­‐72. [44] Irvine WJ, Stewart AG, Scarth L. A clinical and immunological study of adrenocortical insufficiency (Addison's disease). Clin Exp Immunol 1967; 2(1): 31-­‐
70. [45] Nerup J, Andersen V, Bendixen G. Anti-­‐adrenal, cellular hypersensitivity in Addison's disease. Clin Exp Immunol 1969; 4(4): 355-­‐63. [46] Freeman M, Weetman AP. T and B cell reactivity to adrenal antigens in autoimmune Addison's disease. Clin Exp Immunol 1992; 88(2): 275-­‐9. [47] Kriegel MA, Lohmann T, Gabler C, Blank N, Kalden JR, Lorenz HM. Defective suppressor function of human CD4+ CD25+ regulatory T cells in autoimmune polyglandular syndrome type II. J Exp Med 2004; 199(9): 1285-­‐91. [48] Vendrame F, Segni M, Grassetti D, Tellone V, Augello G, Trischitta V, Torlontano M, Dotta F. Impaired caspase-­‐3 expression by peripheral T cells in chronic autoimmune thyroiditis and in autoimmune polyendocrine syndrome-­‐2. J Clin Endocrinol Metab 2006; 91(12): 5064-­‐8. [49] Bratland E, Skinningsrud B, Undlien DE, Mozes E, Husebye ES. T cell responses to steroid cytochrome P450 21-­‐hydroxylase in patients with autoimmune primary adrenal insufficiency. J Clin Endocrinol Metab 2009; 94(12): 5117-­‐24. [50] Rottembourg D, Deal C, Lambert M, Mallone R, Carel JC, Lacroix A, Caillat-­‐Zucman S, le Deist F. 21-­‐Hydroxylase epitopes are targeted by CD8 T cells in autoimmune Addison's disease. J Autoimmun 2010; 35(4): 309-­‐15. [51] Anderson JR, Goudie RB, Gray KG, Timbury GC. Auto-­‐antibodies in Addison’s disease. Lancet 1957 272(6979): 1123-­‐4. [52] Blizzard RM, Kyle M. Studies of the adrenal antigens and antibodies in Addison’s disease. J Clin Invest 1963; 42: 1653-­‐60. [53] Furmaniak J, Wedlock N, Kiso Y, Baumann-­‐ANtczak A, Fowler S, Krishnan H, Craft JA, Rees Smith B. Steroid 21-­‐hydroxylase is a major autoantigen involved in adult onset autoimmune Addison's disease. FEBS Lett 309(1): 51-­‐5. [54] Uibo R, Aavik E, Peterson P, Perheentupa J, Aranko S, Pelkonen R, Krohn KJ. Autoantibodies to cytochrome P450 enzymes P450scc, P450c17, and P450c21 in autoimmune polyglandular disease types I and II and in isolated Addison's disease. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78(2): 323-­‐8. [55] Betterle C, Volpato M, Rees Smith B, Furmaniak J, Chen S, Zanchetta R, greggio NA, Pedini B, Boscaro M, Presotto F. II. Adrenal cortex and steroid 21-­‐hydroxylase autoantibodies in children with organ-­‐specific autoimmune diseases: markers of high progression to clinical Addison's disease. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82(3): 939-­‐42. [56] Betterle C, Volpato M, Rees Smith B, Furmaniak J, Chen S, Greggio NA, Sanzari M, Tedesco F, pedini B, Boscaro M, Presotto F. I. Adrenal cortex and steroid 21-­‐
hydroxylase autoantibodies in adult patients with organ-­‐specific autoimmune 37 diseases: markers of low progression to clinical Addison's disease. J Clin Endocrinol 1997; 82(3): 932-­‐8. [57] Laureti S, De Bellis A, Muccitelli VI, Calcinaro F, Bizzaro A, Rossi R, Bellastella A, Santeusiano F, Falorni A. Levels of adrenocortical autoantibodies correlate with the degree of adrenal dysfunction in subjects with preclinical Addison's disease. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83(10): 3507-­‐11. [58] Betterle C, Scalici C, Presotto F, Pedini B, Moro L, Rigon F, Mantero F. The natural history of adrenal function in autoimmune patients with adrenal autoantibodies. J Endocrinol 1988; 117(3): 467-­‐75. [59] Furmaniak J, Kominami S, Asawa T, Wedlock N, Colls J, Smith BR. Autoimmune Addison's disease-­‐-­‐evidence for a role of steroid 21-­‐hydroxylase autoantibodies in adrenal insufficiency. J Clin Endocrinol Metab 1994; 79(5): 1517-­‐21. [60] Boscaro M, Betterle C, Volpato M, Fallo F, Furmaniak J, Rees Smith B, Sonino N. Hormonal responses during various phases of autoimmune adrenal failure: no evidence for 21-­‐hydroxylase enzyme activity inhibition in vivo. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81(8): 2801-­‐4. [61] Boe AS, Bredholt G, Knappskog PM, Hjelmervik TO, Mellgren G, Winqvist O, Kampe I. Husebye ES. Autoantibodies against 21-­‐hydroxylase and side-­‐chain cleavage enzyme in autoimmune Addison's disease are mainly immunoglobulin G1. Eur J Endocrinol 2004; 150(1): 49-­‐56. [62] Ekman B, Alstrand N, Bachrach-­‐Lindstrom M, Jenmalm MC, Wahlberg J. Altered chemokine Th1/Th2 balance in Addison's disease: relationship with hydrocortisone dosing and quality of life. Horm Metab Res 2014; 46(1): 48-­‐53. [63] Wesche B, Jaeckel E, Trautwein C, Wedemeyer H, Falorni A, Frank H, von zur Muhlen A, Manns MP, Brabant G. Induction of autoantibodies to the adrenal cortex and pancreatic islet cells by interferon alpha therapy for chronic hepatitis C. Gut 2001; 48(3): 378-­‐83. [64] Hellsen A, Edvardsen K, Breivik L, Husebye ES, Bratland E. The effect of types I and III interferons on adrenocortical cells and its possible implications for autoimmune Addison's disease. Clin Exp Immunol 2014; 176(3): 351-­‐62. [65] Edvardsen K, Hellesen A, Husebye ES, Bratland E. Analysis of cellular and humoral immune responses against cytomegalovirus in patients with autoimmune Addison's disease. J Transl Med 2016; 14(1): 68. [66] Bellastella G, Maiorino MI, Petrizzo M, De Bellis A, Capuano A, Esposito K, Giugliano D. Vitamin D and autoimmunity: what happens in autoimmune polyendocrine syndromes? J Endocrinol Invest 2015; 38(6): 629-­‐33. [67] Jodar E, Valdepenas MP, Martinez G, Jara A, Hawkins F. Long-­‐term follow-­‐up of bone mineral density in Addison’s disease. Clin Endocrinol 2003; 58: 617-­‐620. [68] Hofbauer LC, Schoppet M. Clinical implications of the osteoprotegerin/ RANKL/RANK system for bone and vascular disease. JAMA 2004; 292: 490-­‐495. [69] Nakagawa N, Kinosaki M, Yamaguchi K et al. RANK is the essential signaling receptor for osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis. Biochem Biophys Res Commun 1998; 253: 395-­‐400. 38 [70] Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR et al. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 1997; 89: 309-­‐319. [71] Hofbauer LC, Gori F, Riggs BL et al. Stimulation of osteoprotegerin ligand and inhibition of osteoprotegerin production by glucocorticoids in human osteoblastic lineage cells: potential paracrine mechanisms of glucocorticoid-­‐induced osteoporosis. Endocrinology 1999; 140: 4382-­‐4389. [72] Sasaki N, Kusano E, Ando Y, Tsuda E, Asano Y. Glucocoricoid decreases circulating osteoprotegerin (OPG): possible mechanism for glucocorticoid induced osteoporosis. Nephrol Dial Transplant 2001; 16: 479-­‐482. [73] Dovio A, Allasino B, Palmas E et al. Increased osteoprotegerin levels in Cushing’s syndrome are associated with an adverse cardiovascular risk profile. JCEM 2007; 92: 1803-­‐1808. [74] Camozzi V, Sanguin F, Albigier N et al. Persistent increase of osteoprotegerin levels after cortisol normalization in patients with Cushing’s syndrome. Eur J Endocrinol 2010; 162: 85-­‐90. [75] Browner WS, Lui LY, Cummings SR. Associations of serum osteoprotegerin levels with diabetes, stroke, bone density, fractures, and mortality in elderly women. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 631-­‐637. [76] Jabbar S, Drury J, Fordham JN, Datta HK, Francis RM, Tuck SP. Osteoprotegrin, RANKL and bone turnover in postmenopausal osteoporosis. J Clin Pathol 2011; 64: 354-­‐357. [77] Hofbauer LC, Hicok KC, Chen D, Khosla S. Regulation of osteoprotegerin production by androgens and anti-­‐androgens in human osteoblastic lineage cells. Eur J Endocrinol 2001; 147: 269-­‐273. [78] Khosla S, Atkinson EJ, Dunstan CR, O’Fallon WM. Effect of estrogen versus testosterone on circulating osteoprotegerin and other cytokine levels in normal elderly men. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 1550-­‐1554. [79] Pepene CE, Ilie IR, Marian I, Duncea I. Circulating osteoprotegerin and soluble receptor activator of nuclear factor κB ligand in polycystic ovary syndrome: relationships to insulin resistance and endothelial dysfunction. Eur J Endocrinol 2011; 164: 61-­‐68. [80] Devogelaer JP, Crabbe J, Nagant de Deuxchaisnes C. Bone mineral density in Addison’s disease: evidence for an effect of adrenal androgens on bone mass. Br Med J (Clin Res Ed), 1987; 294: 798-­‐800. [81] Uemura H, Yasui T, Miyatani Y et al. Circulating profiles of osteoprotegerin and soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand in post-­‐menopausal women. J Endocrinol Invest 2008; 31: 163-­‐168. [82] Zoller B, Li X, Sundquist J, Sundquist K. Risk of subsequent ischemic and hemorrhagic stroke in patients hospitalized for immune-­‐mediated diseases: a nationwide follow-­‐up study from Sweden. BMC Neurol 2012; 12: 41. [83] Ntaios G, Gatselis NK, Makaritsis K, Dalekos GN. Adipokines as mediators of endothelial function and atherosclerosis. Atherosclerosis 2013; 227: 216-­‐21. 39 [84] Herder C, Baumert J, Zierer A, Roden M, Meisinger C, Karakas M, Chambless L, Rathmann W, Peters A, Koenig W, Thorand B. Immunological and cardiometabolic risk factors in the prediction of type 2 diabetes and coronary events: MONICA/KORA Augsburg case-­‐cohort study. PLoS One 2011; 6(6): e19852. [85] Pischon T, Girman CJ, Hotamisligil GS, Rifai N, Hu FB, Rimm EB, Plasma adiponectin levels and risk of myocardial infarction in men. JAMA 2004; 291(14): 1730-­‐7. [86] Wabitsch M, Jensen PB, Blum WF, Christoffersen CT, Englaro P, Heinze E, Rascher W, Teller W, Tornqvist H, Hauner H. Insulin and cortisol promote leptin production in cultured human fat cells. Diabetes 1996; 45(10): 1435-­‐8. [87] Elimam A, Knutsson B, Bronnegard M, Stierna P, Albertsson-­‐Wikland K, Marcus C. Variations in glucocorticoid levels within the physiological range affect plasma leptin levels. Eur J Endocrinol 1998; 139(6): 615-­‐20. [88] Leal-­‐Cerro A, Considine RV, Peino R, Venegas E, Astorga R, Casanueva FF, Dieguez C. Serum immunoreactive-­‐leptin levels are increased in patients with Cushing's syndrome. Horm Metab Res 1996; 28(12): 711-­‐3. [89] Degawa-­‐Yamauchi M, Moss KA, Bovenkerk JE, Shankar SS, Morrison CL, Lelliott CJ, Jones R, Considine RV. Regulation of adiponectin expression in human adipocytes: effects of adiposity, glucocorticoids, and tumor necrosis factor alpha. Obes Res 2005; 13(4): 662-­‐9. [90] Ermetici F, Malavazos AE, Corbetta S, Morricone L, Dall’Asta C, Corsi MM, Ambrosi B. Adipokine levels and cardiovascular risk in patients with adrenal incidentaloma. Metabolism 2007; 56(5): 686-­‐92. [91] Brochu-­‐Gaudreau K, Rehfeldt C, Blouin R, Bordignon V, Murphy BD, Palin MF. Adiponectin action from head to toe. Endocrine 2010; 37: 11-­‐32. [92] Arlt W, Rosenthal C, Hahner S, Allolio B. Quality of glucocorticoid replacement in adrenal insufficiency: clinical assessment vs. timed serum cortisol measurements. Clin Endocrinol (Oxf) 2006; 64: 384-­‐9. [93] Chapman K, Holmes M, Seckl J. 11β-­‐hydroxysteroid dehydrogenases: intracellular gate-­‐keepers of tissue glucocorticoid action. Physiol Rev 2013; 93(3): 1139-­‐206. [94] Lawson AJ, Walker EA, Lavery GG, Bujalska IJ, Hughes B, Arlt W, Stewart PM, Ride JP. Cortisone-­‐reductase deficiency associated with heterozygous mutations in 11beta-­‐hydroxysteroid dehydrogenase type 1. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108(10): 4111-­‐6. [95] Nair S, Lee YH, Lindsay RS, Walker BR, Tataranni PA, Bogardus C, Baier LJ, Permana PA. 11beta-­‐Hydroxysteroid dehydrogenase Type 1: genetic polymorphisms are associated with Type 2 diabetes in Pima Indians independently of obesity and expression in adipocyte and muscle. Diabetologia 2004; 47(6): 1088-­‐
95. [96] Olza J, Gil-­‐Campos M, Leis R, Ruperez AI, Tojo R, Canete R, Gil A, Aguilera CM. A gene variant of 11β-­‐hydroxysteroid dehydrogenase type 1 is associated with obesity in children. Int J Obes (Lond) 2012; 36: 1558-­‐63. 40 Gambinieri A, Tomassoni F, Munarini Ą Stimson RH, Mioni Ę Pagotto U,
Chapman KE, Andrew Ę Mantovani V, Pasquali Ę Walker BR' A combination of
polymorphisms in HSD11B1 associates with in vivo 11{beta}-HSD1 activity and
metabolic syndrome in women with and without polycystic ovary syndrome. Eur I
Endocrinol 20 Ll ; 165 (2) : 283 -9 2.
[9B] Malavasi EL, Kelly V, Nath N, Gambineri Ą Dakin RS, Pagotto U, Pasquali Ę
Walker BĘ Chapman KE. Functional effects of polymorphisms in the human gene
encoding L1 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11 beta-HSD1): a sequence
variant at the translation start of 11 beta-HSD1 alters enzyme levels. Endocrinology
2010; 1.5L:195-202.
[99] Masuzaki H, Paterson J, Shinyama, Morton NM, Mullins ||, Seckl |Ę Flier |S. A
transgenic model of visceral obesity and the metabolic syndrome. Science 2001,;
294:2166-70.
[100] Kannisto K Pietilainen KH, Ehrenborg E, Rissanen A, Kaprio |, Hamsten Ą Ykifarvinen H. Overexpression of 1lbeta-hydroxysteroid dehydrogenase-1 in adipose
tissue is associated with acquired obesity and features of insulin resistance: studies
in young adult monozygotic twins. I Clin Endocrinol Metab 2004; 89 4414-ZI.
[101] Molnar Ą Kovesdi A, Szucs N, Toth M,|gaz P, Racz K, Patocs A. Polymorphisms of
the GR and HSD1lBlgenes influence body mass index and weight gain during
hormone replacement treatment in patients with Addison's disease. Clin Endocrinol
(oxĄ2016lan22. doi: 10.t117/cen.t3022. [Epub ahead of print]
[102] wenzlau fM, fuhl K, Yu K, Moua o, sarkar sA, Gottlieb p, Rewers M, Eisenbarth GS,
lensen f, Davidson HW, Hutton fC. The cation efflux transporter ZnTB (Slc30AB) is a
major autoantigen in human type t diabetes. Proc Natl Acad Sci USA 2007; LO4@3):
I97]
L7040-5.
[103] Achenbach P, Lampasona v, Landherr u, Koczwara K, Krause s, Grallert H,
Winlder C, Pfluger M, Illig T, Bonifacio E, Ziegler AG. Autoantibodies to zinc
transporter B and SLC30AB genotype strati$r Wpe t diabetes risk. Diabetologia
2009;52(9):1881-8.
[104] wenzlau fM, Liu Y, Yu L, Moua o, Fowler KT, Rangasamy s, walters f, Eisenbarth
GS, Davidson HW Hutton IC. A common nonsynonymous single nucleotide
polymorphism in the SLC3OAB gene determines ZnTB autoantibody specificity in
type 1 diabetes. Diabetes 2008; 57(10J: 2693-7.
[105] sadlack B, Lohler f, schorle H, Klebb G, Haber H, sickel E, Noelle Rf Horak I.
Generalized autoimmune disease in interleukin-2-deficient mice is triggered by an
uncontrolled activation and proliferation of CD4+ T cells. Eur J Immunol 1995; 25:
3053-9.
[106] Wang X, Rickert M, Garcia KC. Structure of the quaternary complex of interleukin2 with its alpha, beta, and gamma receptors. Science Z00S;310: 1159-63.
[107] Caudy AA, Reddy ST, Chatila T, Atkinson |P, VerbsĘ IW. cD25 deficiency causes
an
immune dysregulation, polyendocrinopathy, enetropathy, X-linked-like
syndrome, and defective IL-10 expression from CD4 lymphocytes, J Allergy Clin
Immunol 2007 ; LI9: 482-7.
47
[108] Zhernakova A, Alizadeh BZ, Bevova M et aL Novel association in chromosome
4q27 region with rheumatoid arthritis and confirmation of type 1 diabetes point to a
general risk locus for autoimmune diseases. Am I Hum Genet 2A07; BL L284'8.
[109] Maier LM, Lowe CE, Cooper I et aI. ILZRA genetic heterogeneity in multiple
sclerosis and type 1 diabetes susceptibility and soluble interleukin-Z receptor
production. PLoS Genet 2009;52 eL000322.
[t10] Van Heel DĄ Franke L, Hunt KA et al' A genome-wide association study for celiac
disease identifies risk variants in the region harboring ILZ and IL21. Nat Genet
2007;39:827-9.
[111] Brand o|, Lowe CE, Heward IM, Franklyn |Ą Cooper |D, Todd |A, Gough SC.
Association of the interleukin-Z receptor alpha (lL-ZRalpha)/CD25 gene region with
Graves' disease using a multilocus test and tag SNPs. Clin Endocrinol (Oxf) 2007;66:
508-512.
I1L2] Todd |A, Walker NM, Cooper |D, Smyth D|, Downes
Ę Plagnol
V, Bailey &
Nejentsev S, Field SF, Payne F, Lowe CE, Szeszko fS, Hafler fP. Robust associations of
four new chromosome regions from genome-wide analyses of type 1 diabetes. Nat.
Genet 2007;39:857-64.
[113] Cerosaletti K Schneider Ą Schwedhelm K Frank I, Tatum M, Wei S, Whalen E,
Greenbaum C, Kita M, Buckner f, Long SA. Multiple autoimmune-associated variants
confer decreased IL-2R signaling in CD4+ CDzs(hi) T cells of type 1 diabetic and
multiple sclerosis patients. PLoS One 20L3;B(72): eB3B11.
I1,I4l Bratland E, Skinningsrud B, Undlien DE, Mozes E, Husebye ES. T cell responses to
steroid cytochrome P450 21-hydroxylase in patients with autoimmune primary
adrenal insufficiency. I Clin Endocrinol Metab 2009;94t SII7-24.
[115] Nagel fE, Chopra RK Chrest Ff, McCoy MT, Schneider EL, Holbrook Nf, Adler WH.
Decre,ased proliferation, interleukin 2 synthesis, and interleukin 2 receptor
expression are accompanied by decreased mRNA expression in
phytohemagglutinin-stimulated cells from elderly donors. I Clin Invest 19BB; 81:
1096-102.
Poznań,29 czerwca20l6
II4fuJ^-
flłrra-
42