docPlazmid kryptyczny pIGRW12 jako potencjalny wektor dla
download 
Reklamacja Transkrypt
Plazmid kryptyczny pIGRW12 jako potencjalny wektor dla
0LAZMIDKRYPTYCZNYP)'27JAKOPOTENCJALNYWEKTOR DLABIOTECHNOLOGII 4HECRYPTICPLASMIDP)'27ASAPOTENTIALVECTORFORBIOTECHNOLOGY DR2ENATA7OLINOWSKA MGR+RYSTYNA3TRZEEK 0ROFDRHAB!NDRZEJ0UCIENNICZAK 0ROFDRHAB3TEFAN4YSKI :AKAD-IKROBIOLOGII&ARMACEUTYCZNEJ!KADEMII-EDYCZNEJW7ARSZAWIE )NSTYTUT"IOTECHNOLOGIII!NTYBIOTYKÌW7ARSZAWA .ARODOWY)NSTYTUT,EKÌW7ARSZAWA 0ROFDRHAB3TEFAN4YSKIJESTKIEROWNIKIEM :AKADU-IKROBIOLOGII&ARMACEUTYCZNEJ !KADEMII-EDYCZNEJW7ARSZAWIE STRESZCZENIE Przygotowywanie nowych szczepów dla potrzeb biotechnologii metodami inżynierii genetycznej napotyka często barierę w postaci braku dobrych wektorów plazmidowych. Do celów badawczych dostępnych jest bardzo wiele różnorodnych wektorów. Ze względu na prawa własności i ochronę patentową nie mogą być one jednak użyte do konstrukcji szczepów produkcyjnych. Małe plazmidy zwane kryptycznymi, ze względu na swoją wielkość (2-5 tys. par zasad) i wysoką stabilność mogą być szczególnie łatwo przekształcane w wektory plazmidowe, przydatne do prac badawczych, jak i konstrukcji szczepów przemysłowych. Wyizolowano dwa plazmidy kryptyczne ze szczepu klinicznego E. coli, pIGRW12, pIGWZ12. Mają one wielkość, odpowiednio, 4995 i 4072 par zasad. Oznaczono kompletną sekwencję nukleotydową każdego plazmidu. Sekwencje zostały zgłoszone do bazy GenBank NCBI, pIGRW12 – Acc. No EF088686, pIGWZ12 – Acc. No DQ311641. Wykazano pełną stabilność segregacyjną i strukturalną plazmidu pIGRW12K w komórkach szczepu laboratoryjnego E. coli NM522, dotyczyło to zarówno samego plazmidu jak i plazmidu zrekombionowanego po wklonowaniu genu kodującego białko eukariotyczne. Analizując lizaty komórkowe w żelach poliakrylamidowych stwierdzono wysoki poziom ekspresji białka heterologicznego, w komórkach obserwowano obecność ciałek inkluzyjnych. Wysoki poziom produkcji obcego białka przy całkowitej stabilności plazmidu w hodowlach bez presji selekcyjnej wskazują, że badany plazmid kryptyczny może z powodzeniem zostać wykorzystany do konstrukcji dobrego, wysokowydajnego wektora ekspresyjnego. ABSTRCT Preparation of new strains for biotechnology purposes with use of genetic engineering methods often faces shortage of plasmid vectors with desired properties. For research purposes, many vectors are available. However, due to copyright law and patents much of them cannot be used for constructing strains for industry. Small (so-called cryptic) plasmids, for their small size (2 to 5 kb) and high stability, can be easily transformed into plasmid vectors suitable both for research purposes and construction of bacterial strains used for production. Two cryptic plasmids have been isolated from clinical strain of Escherichia coli, pIGRW12 and pIGWZ12. They are of 4995 and 4072 bp, respectively. A complete nucleotide sequence of each of them has been obtained; they are submitted to database GenBank NCBI: pIGRW12 – Acc. No EF088686, pIGWZ12 – Acc. No DQ311641. Complete segregational and structural stability of plasmid pIGRW12K in cells of laboratory E. coli strain NM522 has been demonstrated, for the plasmid itself as well as for the plasmid after recombination: with cloning gene encoding eucaryotic protein. Lizates analysis in polyacrylamide gels demonstrated high level of heterologic protein expression, inclusion bodies have been observed. High level of protein production, combined with complete plasmid stability in cultures without selection pressure, prove that cryptic plasmid in question can be successfully used for construction of new efficient expression vector. Key words: plasmid, vector, biotechnology Słowa kluczowe: plazmid, wektor, biotechnologia &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. ^¤°°U Najważniejsze biofarmaceutyki, takie jak insulina, ludzki hormon wzrostu, różne rodzaje interferonu są obecnie produkowane przemysłowo przez kilka światowych koncernów farmaceutycznych. Stosowany jest w tym przypadku najstarszy z opracowanych systemów ekspresyjnych, w którym gen kodujący białko przeznaczone do ekspresji jest sklonowany w wektorze plazmidowym, a jako gospodarza wykorzystuje się komórki Escherichia coli (1). Niezbędnym elementem tego układu jest plazmidowy wektor ekspresyjny. W laboratoriach genetycznych jest w użyciu wiele klasycznych wektorów plazmidowych, wiele znakomitych wektorów można kupić do celów badawczych. Ze względu na prawa własności i ochronę patentową nie mogą one jednak być użyte do konstrukcji szczepów produkcyjnych. Dobrą strategią jest więc konstrukcja własnych wektorów ekspresyjnych. Cząsteczkami, które mogą być do tego celu wykorzystane, są plazmidy kryptyczne. Są to niewielkie koliste plazmidy (2-5 tys. par zasad) zdolne do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii. W ostatnich latach obserwuje się rosnącą liczbę publikacji poświęconych plazmidom kryptycznym izolowanym z bakterii różnych gatunków (2, 3, 4, 5). Jeśli planowany układ ekspresyjny ma wykorzystywać komórki E. coli jako gospodarza, to poszukuje się plazmidów ze szczepów bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Większość z nich ma charakter plazmidów o szerokim spektrum gospodarza i będzie zdolna do replikacji w komórkach E. coli (6). Plazmidy bakteryjne nie niosą informacji genetycznej niezbędnej do życia bakterii. Najmniejsze plazmidy niosą jedynie informację niezbędną do ich replikacji. W strukturze plazmidów kryptycznych mogą się ponadto znajdować geny mob, umożliwiające przekazanie cząsteczki plazmidu ze szczepu plazmidowego do bezplazmidowego. Proces ten zachodzi przy udziale dodatkowego plazmidu, tzw. plazmidu mobilizującego.Plazmidy występują często w szczepach bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, w 25-70% w zależności od rodzaju kolekcji (6). We wstępnym etapie prac wytypowano kliniczny szczep E. coli niosący cztery plazmidy. Dwa z nich, o niewielkiej masie cząsteczkowej, zostały przeniesione do laboratoryjnego szczepu E. coli NM522. Ponieważ plazmidy te nie niosą genów oporności na antybiotyki, po wyizolowaniu plazmidowego DNA wykonano transpozycję in vitro, wprowadzając do cząsteczek plazmidu transpozon niosący oporność na kanamycynę (użyto zestawu <KAN-2> Insertion Kit firmy Epicentre Biotechnologies). Tak przygotowanym preparatem transformowano komórki szczepu E. coli NM522. Wprowadzenie transpozonu umożliwiło selekcję na podłożu z kanamycyną tych komórek, które pobrały plazmid. Ponadto wprowadzenie do badanych plazmidów fragmentu DNA o znanej sekwencji umożliwiło rozpoczęcie procesu sekwencjonowania plazmidów. Transpozon zawierał ponadto tzw. polilinker, fragment DNA niosący sekwencje rozpoznawane przez kilka podstawowych enzymów restrykcyjnych, które zostały wykorzystane w następnym etapie badań. Oznaczono pełną sekwencję nukleotydową dwóch plazmidów: pIGRW12 i pIGWZ12. Oba plazmidy zostały zgłoszone do bazy danych GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, Stany Zjednoczone); pIGRW12 – Acc. No EF088686, pIGWZ12 – Acc. No DQ311641. Prace nad plazmidem pIGWZ12 zostały opisane w odrębnej publikacji (2). COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. ¬--\¥ypAo|y-qy-q-®ulJ¥'¤ Ry¬p|J|ª-yR®R®q-®ulJp¬ ¬A®y¬'¤F l X |7®- ª-¥yp¥oÔA¬ Rqlp-AoÖ q-®ulJ¥G u|7G G G X aRy¬ u|7lql®-A¬oyRG « X aRy ®ªlÔ®-y¬ ® AiRk u| -poÔRyp|J|ª-y¬®R® -y|®|yp-y-u¬A¬y|ª¬ Xp-yRyp|J¥oÔA¬7l-tp|R¥p-l| ¬A®yRR7 ¬¤l-tp-lypq¥®¬oyR®¬pt-J|ªR|®y-A®|y| ®-tpÔ ª p|u}p-Ai ®A®R¥ A|ql ^¤¤G yl|ÔARa| q-®ulJ '¤R-- ®¬¸¬Al|ª¬|aqÔJ-y¬ªulp|p|k lRp|y - |ª|k\-®|ª¬u|ªlÖp®RylR¤°°°kp| yR Wykonano badania sprawdzające, czy plazmid pIGRW12 może zostać użyty do konstrukcji wektora plazmidowego. Prace prowadzono na pochodnej plazmidu pIGRW12, zawierającej transpozon kanamycynowy, oznaczonej pIGRW12K. Testowano stabilność plazmidu pIGRW12K w komórkach laboratoryjnego szczepu E. coli. Etap fermentacji w procesie produkcyjnego otrzymywania białka eukariotycznego prowadzony jest bez udziału antybiotyków jako elementu selekcjonującego komórki niosące plazmid. Stabilność wektora i zrekombinowanego plazmidu w komórkach gospodarza bez obecności presji antybiotycznej &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY ^¤°°U jest jedną z najważniejszych właściwości szczepu konstruowanego dla potrzeb biotechnologii (7). Hodowano szczep E. coli niosący plazmid pIGRW12K na podłożu wzrostowym bez dodatku antybiotyku przez czas odpowiadający 80 generacjom. Wykazano całkowitą stabilność plazmidu pIGRW12K. Wykorzystując miejsca cięcia dla enzymu restrykcyjnego XbaI, wprowadzone do plazmidu pIGRW12 w transpozonie kanamycynowym, sklonowano moduł zawierający gen kodujący białko eukariotyczne – ludzki hormon wzrostu – oraz sygnały regulacyjne: promotor prokariotyczny i terminator transkrypcji. Analizując plazmidowy DNA za pomocą trawień enzymami restrykcyjnymi i PCR potwierdzono poprawność konstrukcji plazmidu, który nazwano pIGRWKBE. Niesie on sklonowaną wstawkę w jednej z dwóch możliwych orientacji (rys. 1). Analiza stabilności plazmidu pIGRW12KBE wykazała jego pełną stabilność w szczepie E. coli NM522 przez 80 generacji przy braku presji selekcyjnej. Obserwując komórki E. coli NM522 niosące plazmid pIGRW12KBE w mikroskopie kontrastowo-fazowym stwierdzono obecność ciałek inkluzyjnych (rys. 2). Ciałka inkluzyjne formują się przy intensywnej produkcji białka heterologicznego. Analiza elektroforetyczna lizatów komórkowych omawianego szczepu w żelu poliakrylamidowym wykazała obecność dodatkowego grubego prążka białkowego na spodziewanej wysokości ok. 30 kDa (dane nie przedstawione). Wynik ten oznacza wysoki poziom ekspresji białka eukariotycznego w szczepie E. coli niosącym plazmid pIGRW12KEB. Uzyskane wyniki wskazują, że plazmid kryptyczny pIGRW12 może zostać wykorzystany do konstrukcji wydajnego wektora ekspresyjnego. Wskazuje na to całkowita stabilność, obserwowana zarówno w przypadku plazmidu pIGRW12K jak i pIGRW12KBE, oraz wysoki poziom produkcji białka eukariotycznego. Plazmid pIGRW12K jest stosunkowo duży, składa się z 7261 par zasad. Jego wielkość można zmniejszyć przez wykonanie delecji fragmentu kodującego geny mob zbędne z punktu widzenia biotechnologii. &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY l²ulRyylA ª| 1. Borowicz P. Produkcja biotechnologiczna leków, w: Bielecki S. (red.), Raport perspektywy i kierunki rozwoju biotechnologii w Polsce do 2013 r., 2006, on-line: http:// www.biotechnologia.pl/biotechnologia/12/606 (dostęp 2007-10-10). 2. Zaleski P. i wsp. The complete sequence and segregational stability analysis of a new cryptic plasmid pIGWZ12 from a clinical strain of Escherichia coli. Plasmid, 2006, 56, 228-232. 3. Sprincova A., Javorsky P., Pristas P., pSRD191, a new member of RepL replicating plasmid family from Selenomonas ruminantium. Plasmid, 2005, 54, 39-47. 4. Stepanek, V., Valesova, R., Kyslik, P., Cryptic plasmid pRK2 from Escherichia coli W: sequence analysis and segregational stability. Plasmid, 2005, 54, 86-91. 5. Titok M.Z. i wsp., Bacillus subtilis soil isolates: plasmid replicon analysis and construction of a new theta-replicating vector. Plasmid, 2003, 49, 53-62. 6. Thomas C.M. (red.), The Horizontal Gene Pool, Amsterdam, OPA, 2000. 7. Altenbuchner J., Mattes R., Escherichia coli, w: Gellissen G. (red.) Production of recombinant proteins, Wiley-VCH Verlag, Weinheim 2005, 7-43. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33.
