fluorochromy i ich zastosowanie

PRACTICUM Z CYTOCHEMII (Kurs BCH395)
dla studentów III roku kierunku BIOCHEMIA
ZASTOSOWANIE AUTOMATYCZNYCH MIKROSKOPÓW FLUORESCENCYJNYCH W CYTOCHEMII Monika Rak
[email protected]
26 marca 2014
ĆWICZENIA 16‐17.04.2014
PRAKTYCZNE WYKORZYSTANIE CYFROWYCH, CHŁODZONYCH KAMER CCD W CYTOCHEMII
Treść wykładu:
Podstawowe pojęcia – przypomnienie
Zjawisko fluorescencji
Mikroskopia fluorescencyjna
Zastosowanie w cytochemii
Rejestracja obrazu ‐ kamery CCD
FLUORESCENCJA
Sir George G. Stokes 1852r.
www.erytryn.pl
Molecular Biology of the Cell Alberts et al 2002
DIAGRAM JABŁOŃSKIEGO
Visser AJWG, Rolinski OJ „Basic photophysics” http://www.photobiology.info/Visser‐Rolinski.html
Zimmerman JW. Et al. Targeted treatment of cancer with radiofrequency electromagnetic fields amplitude‐modulated at tumor‐specific frequencies Chin J Cancer. Nov 2013; 32(11): 573–581. Hildebrandt C. et al. An Overview of Recent Application of Medical Infrared Thermography in Sports Medicine in Austria , Sensors (Basel). 2010; 10(5): 4700–4715 zmodyfikowane. MIKROSKOP FLUORESCENCYJNY
http://www.microscopyu.com
MIKROSKOP FLUORESCENCYJNY
„Podstawy biologii komórki” B. Alberts i in., PWN 2005
System epiiluminacji
Molecular Biology of the Cell Alberts et al 2002
dia‐
Epi‐fluorescence tutorial, noise terminator tutorial
AUTOFLUORESCENCJA
‐ chlorofil, porfiryny, biotyna ryboflawina, tiamina, celuloza…
‐ obrazowanie z zastosowaniem autofluorescencji dna oka ‐ lipofuscyna
Schmitz‐Valckenberg S et al, Fundus Autofluorescence and Progression of Age‐related Macular Degeneration, SURVEY OF OPHTHALMOLOGY Vol. 54, No. 1, 2009, 96‐117.
FLUOROCHROMY (FLUOROFORY)
 wykazujące powinowactwo do określonych struktur
 takie, których właściwości fluorescencyjne zależą od parametrów mikrośrodowiska,  sprzężone z substancjami wykazującymi specyficzne powinowactwo do określonych białek  koniugowane z przeciwciałami, bezpośrednio lub pośrednio wiążącymi się z określonymi antygenami;
 białka fluorescencyjne;
 zdolne do przenikania przez złącza szczelinowe determinujące komunikację międzykomórkową,
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 wykazujące powinowactwo do określonych struktur
‐ Hoechst 33342/33258 (bis‐benzimidazol) – DNA, A‐T
Linia komórek ludzkiego nowotworu prostaty DU145
Linia fibroblastów małpich i … mykoplazma
www.lifetechnologies.com
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 wykazujące powinowactwo do określonych struktur
‐ DAPI (4',6‐diamidyno‐2‐fenyloindol) – DNA, A‐T
Mysie fibroblasty NIH/3T3. http://www.piercenet.com FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 wykazujące powinowactwo do określonych struktur
‐ bromek etydyny
‐ jodek propidyny
DNA, RNA
Lyons JG et al., Characterisation of the effects of a titanium micro particle filler on a polyether‐block‐amide host matrix , Journal of material science, 10.1007/s10853‐010‐4328‐4.
Komórki HepG2 – barwienie EtBr (komórki martwe) / FDA (komórki żywe)
* dwuoctan fluoresceiny
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 wykazujące powinowactwo do określonych struktur
‐ oranż akrydyny Komórka żywa
Komórka martwa
jądro
zielony
zielony
jąderka
zielony
czerwony
cytoplazma zielony
czerwony
Organella
Martwe i żywe komórki HeLa wybarwione oranżem akrydyny.
lizosomy
czerwony
‐‐‐
Oranż akrydyny ‐ barwnik o dwóch obliczach.
Anna Noatyńska
http://bioinfo.mol.uj.edu.pl/
articles/Naotynska03
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE

‐
‐
‐
wykazujące powinowactwo do określonych struktur
PO‐ PRO‐ 3, SYTOX Green, YOYO‐1, DRAQ5 chromomycyna A3, mitramycyna (G‐C)
TO‐PRO‐, TOTO‐, SYTO, Pico Green
‐ DiOC6 (3,3’‐heksylokarbocyjanian jodowy) – błony wewnętrzne, siateczka śródplazmatyczna
‐ DiIC18 (1,1’‐dioctadecyl‐3,3,3’3’‐tetrametylindokarbocyjanian perchloru) – błona komórkowa
* określenie potencjału błonowego
‐ kationowe m.in. rodamina i karbocyjany (DiOC6, DiOC2, DiSC3)
‐ anionowe np. DiBAC4
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 wykazujące powinowactwo do określonych struktur
‐
‐
‐
‐
‐
Bodipy‐Ceramide – aparat Golgiego
Mito‐Tracker, Rodamina 123 ‐ mitochondria ER‐Tracker
Lyso‐Tracker
…
ER‐Tracker™ Green and MitoTracker®
http://www.lifetechnologies.com
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 fluorofory, których właściwości fluorescenycjne zależą od parametrów mikrośrodowiska, np. jego pH, lub stężenia jonów wapnia (Fluo‐4, Fura‐2 – Ca2+, karboksyfluoresceina (cF), BCECF czy CFDA‐SE ‐ pH);
Calcium signaling
Calcium wave
Zmiany stężeń jonów wapnia w komórce ujawniane przy użyciu
barwnika fluorescencyjnego zmieniającego intensywność świecenia w
obecności jonów wapnia „Podstawy biologii komórki” Alberts B. 2007
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 fluorofory, których właściwości fluorescenycjne zależą od parametrów mikrośrodowiska np. obecności enzymów
Lyons JG et al., Characterisation of the effects of a titanium micro particle filler on a polyether‐block‐
amide host matrix , Journal of material science, 10.1007/s10853‐010‐4328‐4.
Komórki HepG2 – barwienie EtBr (komórki martwe) / FDA (komórki żywe)
esterazy
dwuoctan fluoresceiny ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ > fluoresceina
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 sprzężone z substancjami wykazującymi specyficzne powinowactwo do określonych białek (np. rodamina sprzężona z falloidyną, toksyną Ammanita phalloides, łączącą się specyficznie z F‐aktyną)
Szczurzy mięsak XC.
Mysie fibroblasty 3T3.
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 koniugowane z przeciwciałami, bezpośrednio lub pośrednio wiążącymi się z określonymi antygenami;
Linia prawidłowych małpich fibroblastów nerki (CV‐1)
Przeciwciało I rz. – monoklonalne mysie anti‐tubulina
Przeciwciało II‐rz. ‐ kozie anty‐mysie sprzężone z Rodaminą Red‐X DAPI www.microscopyu.com/galleries
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 koniugowane z przeciwciałami, bezpośrednio lub pośrednio wiążącymi się z określonymi antygenami;
Pruszak J et al. Markers and Methods for Cell Sorting of Human Embryonic Stem
Cell‐Derived Neural Cell Populations, STEMCELLS 2007;25:2257–2268.
FISH (z ang. fluorescent in situ hybridization) Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest techniką cytogenetyczną, służącą do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA
http://pl.wikipedia.org/wiki/FISH
Photo: Petra Björk, Stockholm University
http://www.nobelprize.org
Chromosomy komórki metafazowej
pozytywnej pod względem rearanżacji
bcr/abl zobrazowane metodą FISH
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 białka fluorescencyjne;
EGFP formation
Określanie wydajności transfekcji komórek (ekspresja EGFP)
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 białka fluorescencyjne; białka fuzyjne
Lokalizacja białka fuzyjnego GFP-kadheryna w komórkach
nabłonkowych
Podstawy biologii komórki Alberts 2007
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 białka fluorescencyjne;
Nagroda Nobla w dziedzinie chemii – 2008:
Osamu Shimomura, Marine Biological Laboratory (MBL), Woods Hole, MA, USA and Boston University Medical School, MA, USA
Martin Chalfie, Columbia University, New York, NY, USA
Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute, University of California,San Diego,CA, USA
"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP".
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Images.htm
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 białka fluorescencyjne; FRET (z ang. Förster Resonance Energy
Transfer)
http://microscopy.berkeley.edu
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/biosensors/index.ht
ml
FLUOROCHROMY I ICH ZASTOSOWANIE
 fluorochromy zdolne do przenikania przez złącza szczelinowe determinujące komunikację międzykomórkową, np. kalceina
100 µm
100 µm
Wizualizacja komunikacji za pośrednictwem złącz szczelinowych (GJIC)
komórek ludzkiego nowotworu prostaty DU145.
Transfer kalceiny.
Komórki donorowe wyznakowane DiI.
analiza obecności i lokalizacja (kolokalizacja) składników komórek wizualizacja struktur subkomórkowych
określenie żywotności i stanu fizjologicznego komórek
wizualizacja i analiza procesów komórkowych
identyfikacja określonych typów komórek
analizy ilościowe
Mitotic spindles fly
FLUOROCHROMY (FLUOROFORY)
 fotoblaknięcie (photobleaching)
http://www.microscopyu.com
 wygaszanie (quenching)
FRAP
Bardziej zaawansowane metody i techniki np.:
‐ mikroskopia konfokalna
‐ FRET (z ang. Förster Resonance Energy Transfer)
‐ FRAP (z ang. Fluorescence recovery after photobleaching)
‐ mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia (ang. Total Internal
Reflection Fluorescence Microscopy) ‐ …
http://www.microscopyu.com
Rejestracja obrazu –
zastosowanie cyfrowych, chłodzonych kamer CCD Rejestracja obrazu –
zastosowanie cyfrowych, chłodzonych kamer CCD ‐ pozwala na bezpośrednie zapisanie obrazu w postaci cyfrowej poprzez pomiar jasności poszczególnych pikseli (punktów) matrycy CCD, na którą pada światło poprzez obiektyw
Matryca CCD (ang. Charge Coupled Device) ‐składa się wielu elementów światłoczułych, z których każdy rejestruje sygnał elektryczny proporcjonalny do ilości padającego na niego światła. Pojedynczy element światłoczuły przekazuje informację dotycząca wartości piksela (w więc jego jasności) w obrazie na ekranie komputera. http://www.surpedia.com
Matryca CCD (ang. Charge Coupled Device) ‐składa się wielu elementów światłoczułych, z których każdy rejestruje sygnał elektryczny proporcjonalny do ilości padającego na niego światła. Pojedynczy element światłoczuły przekazuje informację dotycząca wartości piksela (w więc jego jasności) w obrazie na ekranie komputera. http://www.microscopyu.com
Matryca CCD (ang. Charge Coupled Device) http://www.microscopyu.com
Przetwornik analogowo‐cyfrowy
Próbkowanie
(częstotliwość próbkowania)
Kwantyzacja
http://pl.wikipedia.org
Przetwornik analogowo‐cyfrowy
Obraz cyfrowy –
skala poziomów szarości
Np. obraz 8‐bitowy ‐ każdy piksel może przyjąć 1 z 28 = 256 odcieni szarości
Matryca CCD
http://www.microscopyu.com
Matryca CCD
http://www.microscopyu.com
 readout rate – tempo odczytu
‐ 0,1 – 10/20 MHz  pixel binning – binowanie
 parametr gain
(wzmocnienie)
www.olympusmicro.com SNR (signal‐to‐noise ratio)
 źródła generowanych szumów
‐ szum termiczny (prąd ciemny)
‐ szum przetwarzania  chłodzenie
http://www.microscopyu.com
http://www.olympusconfocal.com
http://zeiss‐campus.magnet.fsu.edu
Molecular Biology of the Cell Alberts et al. 2002
Podstawy Biologii Komórki Alberts et al. 2007
Biofizyka wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami
Jóźwiak Z, Bartosz G. PWN 2005
www.nobelprize.org
Katalogi firm: Sigma‐Aldrich, LifeTechnologies, abcam