Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Vol. 6/2007 Nr 2(19)
Endokrynologia Pediatryczna
Pediatric Endocrinology
Wpływ polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 na ekspresję jego
produktu na powierzchni limfocytów T u dzieci z chorobą Hashimoto
The Influence of CTLA-4 Gene Polymorphism at Position 49 of Exon 1 on
the Surface Expression of its Product on T cells in Children with Hashimoto
Thyroiditis
Anna Kucharska, 2Elżbieta Górska, 1Alicja Wiśniewska, 2Maria Wąsik,
1
Barbara Rymkiewicz-Kluczyńska
1
1
2
Katedra i Klinika Pediatrii i Endokrynologii AM w Warszawie
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego AM w Warszawie
Adres do korespondencji: dr med. Anna M. Kucharska, Klinika Pediatrii i Endokrynologii AM w Warszawie, 00-576 Warszawa, ul. Marszałkowska 24,
e-mail: [email protected], [email protected]
Słowa kluczowe: choroba Hashimoto, CTLA-4, polimorfizm genu, limfocyty, dzieci
Key words: Hashimoto disease, CTLA-4, gene polymorphism, T cells, children
STRESZCZENIE/
STRESZCZENIE/ABSTRACT
Polimorfizm genu CTLA-4 jest uznany za jeden z istotnych poza HLA czynników ryzyka chorób autoimmunologicznych,
w tym chorób tarczycy. Według niektórych autorów polimorfizm A/G w pozycji 49 eksonu 1 powoduje osłabienie
funkcji CTLA-4 w regulacji aktywacji limfocytów T. Celem pracy była ocena zależności genotypu w locus 49
eksonu 1 genu CTLA-4 i ekspresji powierzchniowej CTLA-4 na limfocytach T u dzieci z chorobą Hashimoto i w
grupie kontrolnej. Materiał: Zbadano 88 dzieci: 43 z chorobą Hashimoto oraz 45 zdrowych kontroli dobranych
etnicznie i według płci. Obecność polimorfizmu oceniano za pomocą SSCP i RLFP z użyciem enzymu restrykcyjnego
BbvI. Ekspresję CTLA-4 oceniano przy pomocy cytometrii przepływowej aparatem Coulter EPICS XL. Analizę
statystyczną przeprowadzono z użyciem testu T-studenta. Wyniki: U dzieci z chorobą Hashimoto homozygoty G/G
występowały istotnie statystycznie częściej niż w grupie kontrolnej (odpowiednio 30% i 12%). Częstość występowania
homozygot A/A i heterozygot nie różniła się istotnie w obu grupach. Ekspresja powierzchniowa CTLA-4 była istotnie
statystycznie niższa u dzieci z chorobą Hashimoto niż w grupie kontrolnej i dotyczyło to zarówno homozygot G/G,
jak i A/A. Nie stwierdzono natomiast istotnej statystycznie różnicy w ekspresji u homozygot A/A w porównaniu z
homozygotami G/G w grupie dzieci z chorobą Hashimoto jak również w grupie kontrolnej. Wniosek:
Nasze wyniki sugerują, że niższa powierzchniowa ekspresja CTLA-4 na limfocytach T u chorych z chorobą
Hashimoto nie jest zależna od genotypu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4.
9
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 6/2007;2(19):9-14
CTLA-4 gene polymorphism is one of the strongest candidates of autoimmune thyroid diseases susceptibility
locus except the HLA. Some studies show that CTLA-4 exon 1 polymorphism affects the function of the CTLA-4
gene products. The aim of the study was to investigate the surface expression of CTLA-4 on peripheral T cells in
homozygotes A/A and G/G at position 49 of exon 1 of CTLA-4 gene among children diagnosed with Hashimoto
thyroiditis and in healthy controls. Material: blood samples were obtained from 88 children: 43 with Hashimoto
thyroiditis and 45 without any autoimmune diseases or thyroid disease. Hashimoto thyroiditis was diagnosed on
the basis of the presence of thyroglobulin and thyroid peroxidase antibodies and a typical picture of the thyroid
ultrasound. Methods: CTLA-4 exon 1 polymorphism was defined by SSCP analysis and confirmed with FRLP using
BbvI enzyme. The T cell subsets were analysed with three-colour flow cytometry by Coulter EPICS XL cytometer.
Statistical analysis was performed using Students’ test. Results: Among children with Hashimoto thyroiditis, there
were more individuals with G/G alleles than in the control group (30% and 12% respectively). The comparison
of CTLA-4 expression between homozygotes G/G and individuals with A/A alleles in children with Hashimoto
disease showed no statistically significant difference. The same results were found in the control group. Statistically
significant lower CTLA-4 expression was found in children with Hashimoto disease than in controls, both in G/G
homozygotes and in A/A homozygotes (p< 0,05). Conclusions: our data suggest that the low surface expression of
CTLA-4 on T cells in children with Hashimoto thyroiditis does not depend on the genotype at position 49 in exon 1
of CTLA-4 gene.
Wstep
Polimorfizm genu CTLA-4 jest uznawany za jeden z najbardziej istotnych poza HLA genetycznych czynników ryzyka chorób autoimmunologicznych, w tym autoimmunologicznych chorób tarczycy. Gen CTLA-4 jest atrakcyjnym kandydatem do
roli genu podatności na choroby autoimmunologiczne, ponieważ regulacja odpowiedzi immunologicznej na szlaku CTLA4/CD28/B7 jest jednym z
kluczowych mechanizmów utrzymywania stanu autotolerancji. Potwierdzają to doświadczenia na populacji myszy pozbawionych CTLA-4, które rozwijają ciężki autoimmunologiczny zespół limfoproliferacyjny [1, 2]. W wielu niezależnych próbach wykazano sprzężenie w rejonie locus genu CTLA-4 z
zespołami autoimmunologicznymi: chorobą Gravesa-Basedowa [3, 4, 5, 6, 7], chorobą Hashimoto [7, 8], cukrzycą typu I [6, 8, 9]. W rejonie genu
CTLA-4 opisano trzy polimorficzne markery pozostające w sprzężeniu z autoimmunologicznymi chorobami tarczycy:
1. w pozycji -318 w rejonie promotora genu
CTLA-4, polegający na zamianie cytozyny na tyminę [10],
2. w pozycji 49 eksonu 1, polegający na zamianie adeniny na guaninę, co prowadzi do zastąpienia threoniny przez alaninę w kodonie 17 wiodącego peptydu CTLA-4 [9],
3. w rejonie 3’ UTR (UTR–rejon nieulegający
transkrypcji) eksonu 4, polimorfizm powtórzeń par
zasad: (AT)n [11].
Stwierdzenie sprzężenia danego loci z choro10
bą nie jest dowodem jego rzeczywistego znaczenia czynnościowego. Dopiero wykazanie, że obecność polimorfizmu zmienia funkcję produktu genu,
prowadząc do rozwoju choroby, jest dowodem jego
udziału w patogenezie. Spośród wymienionych
trzech polimorfizmów znaczenie czynnościowe wykazano najlepiej w przypadku polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 (A/G 49).
Czynność CTLA-4 polega na hamowaniu aktywacji limfocytu T, a jego działanie regulacyjne
zależy głównie od ekspresji białka na powierzchni komórki. CTLA-4 hamuje odpowiedź limfocytu T w dwóch mechanizmach. Pierwszy jest realizowany poprzez przekazanie negatywnego sygnału z
CTLA-4 w odpowiedzi na aktywację receptora limfocytu T i jest zależny od cytoplazmatycznego fragmentu CTLA-4 zakotwiczonego w błonie komórkowej limfocytu T [12, 13]. Drugi mechanizm polega na kompetycji między CTLA-4 i CD28 na powierzchni komórki o wiązanie z B7. Jest on zależny
od poziomu powierzchniowej ekspresji CTLA-4.
Związanie B7 przez CTLA-4 prowadzi do zakończenia odpowiedzi poprzez ograniczenie sygnału z
CD28, anergię limfocytów T oraz apoptozę limfocytów T autoreaktywnych.
Jeżeli założymy, że obecność polimorfizmu A/G
49 ma wpływ na funkcję regulacyjną CTLA-4, to
można się spodziewać, że homozygoty posiadające
rzadkie allele G/G powinny wykazywać słabszą powierzchniową ekspresję CTLA-4 na limfocytach T.
Celem pracy była ocena zależności genotypu
w locus 49 eksonu 1 genu CTLA-4 i ekspresji powierzchniowej CTLA-4 na limfocytach T u dzieci z
chorobą Hashimoto i w grupie kontrolnej.
Kucharska A. i inni – Wpływ polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 na ekspresję jego produktu...
Materiał i metody
Zbadano 88 dzieci: 43 dzieci z chorobą Hashimoto oraz 45 zdrowych kontroli dobranych etnicznie i według płci. Kryterium rozpoznania choroby
Hashimoto była obecność przeciwciał przeciwko
tyreoglobulinie i peroksydazie tarczycowej w surowicach chorych oraz charakterystyczny obraz ultrasonograficzny tarczycy. Dzieci z grupy kontrolnej miały prawidłową czynność tarczycy, nie miały przeciwciał przeciwtarczycowych ani chorób o
podłożu autoimmunologicznym.
Metody laboratoryjne
Genomowe DNA izolowano z krwi żylnej przy
użyciu zestawów Genomic Midi AX (ASA Biotechnology). Polimorfizm genu CTLA-4 w pozycji 49
eksonu 1 badano metodą SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) oraz równolegle każdą próbkę badano metodą RFLP (Restriction Fragment-Lenght Polymorphism).
Metodą PCR amplifikowano fragment genu
CTLA-4 z użyciem oligonukleotydów: forward
5’GCTCTACTTCCTGAAGACCT-3’ oraz reverse 5’-AGTCTCACTCACCTTTGCAG-3’, według
opisu sekwencji ludzkiego cDNA dla CTLA-4 podanego przez Harper i Balzano [11]. Stosowano następujące warunki reakcji: denaturacja przez 10 minut w temp. 950C, następnie 35 cykli przez 45 sekund w temp. 940C; przyłączenie starterów: 45 sekund w temp. 580C; wydłużanie: 45 sekund w
temp. 720C; wydłużanie końcowe: 10 minut w
temp. 720C.
Meoda SSCP: Do 2 μL produktu PCR dodawano równoważną objętość formamidu i denaturowano 5 minut w temp. 950C. Następnie próbkę schładzano w łaźni lodowej (40C) i poddawano elektroforezie w 7,5% żelu poliakrylamidowym przez 20
minut przy 400 mA, 40 W, 150 V, w temp. 40C. Do
elektroforezy używano aparatu Fast-System (Biosystem). Elektroforegramy barwiono solami srebra.
Metoda RFLP: 15 μL produktu reakcji PCR dodawano do 10 μL mieszaniny zawierającej 1x Nebuffer 2 oraz 1,5 μL enzymu restrykcyjnego Bbv I
(Biolabs, New England). Próbkę po nawarstwieniu
olejem mineralnym inkubowano przez 24 godziny
w temp. 370C. Następnie poddawano elektroforezie
na 2% żelu agarozowym (60 minut, 500 mA, 40 W,
120 V) w temp. pokojowej. Elektroforegram barwiono bromkiem etydyny celem wizualizacji.
Metoda RFLP: 15 μL produktu reakcji PCR dodawano do 10 μL mieszaniny zawierającej 1x Nebuffer 2 oraz 1,5 μL enzymu restrykcyjnego Bbv I (Biolabs, New England). Próbkę po nawarstwieniu olejem mineralnym inkubowano przez 24 godziny w
temp. 37ºC. Następnie poddawano elektroforezie na
2% żelu agarozowym (60 minut, 500 mA, 40 W, 120
V) w temp. pokojowej. Elektroforegram barwiono
bromkiem etydyny celem wizualizacji.
Oznaczanie ekspresji antygenów na limfocytach krwi obwodowej
Ocenę fenotypu limfocytów przeprowadzono
przy użyciu cytometru przepływowego firmy Beckman Coulter EPICS XL 4C, wykorzystując oprogramowanie EPICS XL/XL-MCL, wersja 2,0. Analizę
przeprowadzano przy użyciu kombinacji przeciwciał monoklonalnych firmy Immunotech Beckman
Coulter Company, France: CD4 FITC/ CD28PC5/
CD152PE oraz CD8FITC/ CD28PC5/ CD152PE.
W doświadczeniu stosowano odpowiednio potrójną izotypową kontrolę IgG. Heparynizowaną krew
rozcieńczano trzykrotnie 0,9% jałowym roztworem
chlorku sodu, nawarstwiano na odczynnik Histopaque 1077-1 firmy SIGMA Diagnostics. Inc. (ST.Louis, MO 63178 USA), następnie wirowano przez 30
minut przy 400 x g. Wyizolowane komórki przepłukiwano trzykrotnie jałowym roztworem 0,9% NaCl
i zawieszano w PBS (BIOMED).
Do 100 μL wyizolowanych limfocytów o stężeniu 5mln/mL PBS dodawano 10 μL odpowiednich
przeciwciał monoklonalnych, następnie próbki inkubowano w temp. pokojowej, w ciemności przez
30 minut. Po inkubacji próbki utrwalano oraz lizowano zestawem odczynników firmowych Uti-Lyse
firmy Dako Cytomation, USA. Tak przygotowane próbki poddawano analizie w cytometrze przepływowym. Wyniki podano, opisując ich wartości
średnie oraz odchylenia standardowe.
Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu T-studenta oraz testów istotności określających różnice między wskaźnikami struktury dla
rozkładu normalnego z użyciem programu Statistica 5. Za istotne statystycznie przyjęto p<0,05.
Dla badania uzyskano akceptację Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Warszawie.
Wyniki
W grupie dzieci z chorobą Hashimoto homozygoty G/G występowały istotnie statystycznie czę11
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 6/2007;2(19):9-14
ściej niż w grupie kontrolnej (tab. I). Ekspresję badanych antygenów CD na powierzchni limfocytów
T analizowano przy pomocy testu T-studenta w następujących układach:
Grupa I: Homozygoty A/A w grupie pacjentów z
chorobą Hashimoto w stosunku do homozygot A/A
w grupie kontrolnej. Grupa II: Homozygoty G/G z
chorobą Hashimoto w porównaniu do homozygot
G/G w grupie kontrolnej. Grupa III: Homozygoty
G/G w grupie Hashimoto w porównaniu do homozygot A/A w grupie kontrolnej. Grupa IV: Homozygoty A/A w grupie Hashimoto w porównaniu do homozygot G/G w grupie kontrolnej. Grupa V: Homozygoty A/A do homozygot G/G w grupie z chorobą
Hashimoto. Grupa VI: Homozygoty A/A do homozygot G/G w grupie kontrolnej.
Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w
ekspresji CTLA-4 u homozygot A/A w porównaniu
do homozygot G/G w obrębie tej samej grupy: zarówno w grupie dzieci z chorobą Hashimoto, jak i
w grupie kontrolnej. Stwierdzono natomiast statystycznie istotną różnicę pomiędzy dziećmi chorymi
i zdrową grupą kontrolną, niezależnie od genotypu.
Ekspresja powierzchniowa CTLA-4 na limfocytach
krwi obwodowej była istotnie statystycznie niższa
u dzieci z chorobą Hashimoto niż w grupie kontrolnej. Różnica ta była istotna zarówno przy porównywaniu samych homozygot rzadkich G/G w obu grupach, jak i samych homozygot częstych A/A. Homozygoty rzadkie G/G z chorobą Hashimoto miały istotnie mniej limfocytów z ekspresją powierzchniową CTLA-4 niż częste homozygoty A/A z grupy
kontrolnej. Homozygoty częste A/A w grupie dzieci z chorobą Hashimoto miały istotnie statystycznie
niższą ekspresję CTLA-4 zarówno na limfocytach
CD4, jak i CD8 w porównaniu do homozygot rzad-
Tabela I. Częstość występowania poszczególnych rodzajów genotypów w pozycji 49 genu CTLA-4 w badanych grupach
Table I. The frequency of particular genotypes at position 49 CTLA-4 gene in the examined groups
Homozygoty A/A [%]
Homozygoty G/G
[%]
Heterozygoty A/G
[%]
Grupa z chorobą Hashimoto
[n=43]
27,9
30,2*
41,8
Grupa kontrolna
[n=45]
26,6
12,3*
60,0
*różnica istotna statystycznie
Tabela II. Porównanie ekspresji antygenów na powierzchni limfocytów T u pacjentów i kontroli w zależności od genotypu w pozycji
49 genu CTLA-4 (test T-studenta).
Table II. The comparison of T cell antigen expression in patients and controls depending on the genotype at position 49 of CTLA-4
gene (T-student test).
CD4/28
CD4/152
CD8/28
CD8/152
CD4
CD8
CD152
Grupa I
NS
p=0,004
NS
NS
NS
NS
p=0,002
Grupa II
NS
p=0,02
NS
p=0,02
NS
NS
p=0,005
Grupa III
NS
p=0,01
NS
NS
NS
NS
p=0,008
Grupa IV
NS
p=0,01
NS
p=0,005
NS
NS
p=0,002
Grupa V
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Grupa VI
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
Grupa I: porównanie ekspresji u homozygot A/A w grupie Hashimoto do ekspresji u homozygot A/A w grupie kontrolnej
Grupa II: porównanie ekspresji u homozygot G/G w grupie Hashimoto do ekspresji u homozygot G/G w grupie kontrolnej
Grupa III: porównanie ekspresji u homozygot G/G w grupie Hashimoto do ekspresji u homozygot A/A w grupie kontrolnej
Grupa IV: porównanie ekspresji u homozygot A/A w grupie Hashimoto do ekspresji u homozygot G/G w grupie kontrolnej
Grupa V: porównanie ekspresji u homozygot A/A do ekspresji u homozygot G/G w grupie z chorobą Hashimoto
Grupa VI: porównanie ekspresji u homozygot A/A do ekspresji u homozygot G/G w grupie kontrolnej
NS – różnica nieistotna statystycznie
12
Kucharska A. i inni – Wpływ polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 na ekspresję jego produktu...
kich G/G w grupie kontrolnej. Różnice te dotyczyły subpopulacji limfocytów T CD4+, a w przypadku grupy II i IV także limfocytów CD8+. (tab. II).
Dyskusja
Sprzężenie polimorfizmu A/G 49 z autoimmunologicznymi chorobami tarczycy sugeruje,
że jego obecność ma wpływ na czynność białka
CTLA-4. Teoretycznie wpływ ten może być realizowany na kilka sposobów: przez zmniejszoną ekspresję CTLA-4 na powierzchni limfocytów, poprzez zmniejszenie powinowactwa do ligandu lub
też przez produkcję nieprawidłowego białka pozbawionego właściwej mu funkcji. Homozygoty rzadkie G/G (Ala/Ala) powinny teoretycznie wykazywać słabszą funkcję CTLA-4 hamującą pobudzenie
limfocytów w porównaniu do homozygot częstych
A/A (thr/thr). Taką koncepcję potwierdzają wyniki badań Kouki, który wykazał, że G 49 allele jest
związana z osłabieniem kontroli proliferacji limfocytów T [14]. Badania Maurer 2002 sugerują także, że powierzchniowa ekspresja CTLA-4 i jej wewnątrzkomórkowa dystrybucja koreluje z genotypem w pozycji 49. Homozygoty G/G mają zmniejszoną powierzchniową ekspresję CTLA-4, podczas
gdy aktywowane limfocyty T u homozygot A/A wykazują inny model dystrybucji wewnątrzkomórkowej CTLA-4 niż homozygoty G/G [15]. Zależność
między genotypem w pozycji 49 a poziomem ekspresji CTLA-4 potwierdził w swoich badania takze
Ligers [16]. Homozygoty AA wykazywały wyższą
ekspresję powierzchniową CTLA-4 po aktywacji,
a także większą zawartość mRNA dla CTLA-4 w
niestymulowanych komórkach. Nasz eksperyment
analizował ekspresję powierzchniową CTLA-4 na
limfocytach krwi obwodowej w warunkach pod-
stawowych, to znaczy bez stymulacji komórek. Porównywano procentowy udział limfocytów T z ekspresją powierzchniową CTLA-4 u dzieci z chorobą
Hashimoto i u dzieci zdrowych.
W naszym badaniu udział limfocytów T z ekspresją powierzchniową CTLA-4 we krwi obwodowej był istotnie statystycznie niższy u dzieci z chorobą Hashimoto niż w grupie kontrolnej niezależnie od rodzaju genotypu w badanym loci. Wynik
ten potwierdzono zarówno u homozygot rzadkich
G/G, jak i u homozygot częstych A/A, co sugeruje, że ekspresja CTLA-4 nie była zależna od obecności polimorfizmu, natomiast miała związek z chorobą Hashimoto. Fakt, że w obrębie tej samej grupy pacjentów nie stwierdzono istotnej statystycznie wyższej ekspresji CTLA-4 u homozygot częstych A/A w porównaniu do homozygot rzadkich
G/G także zaprzecza założeniu, że ekspresja jest
determinowana przez genotyp w pozycji 49 genu
CTLA-4. Homozygoty częste A/A w grupie dzieci
z chorobą Hashimoto, które teoretycznie powinny
mieć prawidłową ekspresję CTLA-4, miały ją istotnie statystycznie mniejszą niż homozygoty rzadkie
G/G w grupie kontrolnej, zarówno na limfocytach
CD4, jak i CD8. Według naszych wyników dzieci z
chorobą Hashimoto mają istotnie mniejszą ekspresję CTLA-4 na limfocytach T we krwi obwodowej,
ale zjawisko to nie jest prostą konsekwencją obecności niekorzystnych alleli G w analizowanym w
badaniu loci.
Wniosek
Nasze wyniki sugerują, że niższa powierzchniowa ekspresja CTLA-4 na limfocytach T u chorych z
chorobą Hashimoto nie jest zależna od genotypu w
pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4.
PIŚMIENNICTWO/REFERENCES
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
Tivol E.A., Borriello F., Schwieitzer A.N., Lynch W.P. et al.: Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal
multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4. Immunity, 1995:3, 541-547.
Waterhouse P., Penninger J.M., Timms E., Wakcham A. et al.: Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice
deficient in CTLA-4. Science, 1995:270, 985-988.
Yanagawa T., Hidaka Y., Giumaraes V., Soliman M., DeGroot L.J.: CTLA-4 gene polymorphism associated with Graves’
disease in a Caucasian population. JCEM 1995:80, 41-45.
Yanagawa T., Taniyama M., Enomoto S., Gomi K. et al.: CTLA-4 gene polymorphism confers susceptibility to Graves’ disease
in Japanese. Thyroid. 1997:7. 843-846.
Yung E., Cheng P.S., Fok T.F., Wong G.W.: CTLA-4 gene A-G polymorphism and childhood Graves’ disease. Clinical
Endocrinology. (Oxf) 2002:56(5), 649-53.
13
Praca oryginalna
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
14
Endokrynol. Ped., 6/2007;2(19):9-14
Donner H., Rau H., Walfish P.G., Braun J., Siegmunt T., Finke R., Herwig J., Usadel K.H., Badenhoop K.: CTLA4 alanine-17
confers genetic susceptibility to Graves disease and to type 1 diabetes mellitus. The Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism. 1997:82. 143-146.
Awata T., Kurihara S., Iitaka M. et al.: Association of CTLA-4 gene A/G polymorphism (IDDM12 locus) with acute- onset and
insulin-depleted IDDM as well as autoimmune thyroid disease (Graves, disease and Hashimoto’s thyroiditis) in the Japanese
population. Diabetes. 1998:47, 128-129.
Donner H., Braun J., Seidl Ch. et al.: Codon 17 Polymorphism of the Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 Gene in Hashimoto’s
Thyroiditis and Addison’s Disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1997:82 (12), 4130-32.
Nistico L., Buzzetti R., Pritchard L.E. et al.: The CTLA-4 gene region of chromosome 2q33 is linked to, and associated with
type I diabetes. Human Molecular Genetics. 1996:5, 1075-1080.
Deichmann K., Heinzmann A., Bruggennolte E. et al.: An Mse I RFLP in the human CTLA-4 promoter. Biochemical and
Biophysical Researche Communications. 1996:225, 817-818.
Harper K., Balzano C., Rouvier E. et al.: CTLA-4 and CD28 activated lymphocyte molecules are closely related in both mouse
and human as to sequence, message expression, gene structure and chromosomal location. Journal of Immunology, 1991:
147, 1037-1044.
Lee K.M., Chuang E., Griffin M. et al.: Molecular basis of T cell inactivation by CTLA-4. Science. 1998:282, 2263-2266.
Carreno M., Bennet F., Chau T.A., Ling V. et al.: CTLA-4 (CD152) can inhibit T cell activation by two different mechanisms
depending on its level of cell surface expression. The Journal of Immunology. 2000:165, 1352-1356.
Kouki T., Sawai Y. Gardine C.A. et al.: CTLA-4 Gene Polymorphism at Position 49 in Exon 1 Reduces the Inhibitory Function
of CTLA-4 and contributes to the Pathogenesis of Graves’ Disease. The Journal of Immunology, 2000:165, 6606-6611.
Maurer M., Loserth S., Kolb-Maurer A. et al.: A polymorphism in the human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA4) gene
(exon 1+49) alters T cell activation. Immunogenetics. 2002:54, 1-8.
Ligers A., Teleshova N., Masterman T. et al.: CTLA-4 gene expression is influenced by promoter and exon 1 polymorphism.
The Genes and Immunity, 2001:2, 145-152.