mycoplasma duo 62739 - 62740 - Bio-Rad

MYCOPLASMA DUO
62739 - 62740
WYKRYWANIE I OZNACZANIE MIANA MYKOPLAZM UROGENITALNYCH
1 - ZNACZENIE KLINICZNE
Mykoplazmy są drobnoustrojami saprofitycznymi, kolonizującymi błony śluzowe dróg moczowo-płciowych, w niektórych
warunkach zdolnymi do wywoływania rożnych stanów chorobowych:
•
Ureaplasma urealyticum (Uu), najczęściej odpowiedzialna za zapalenie cewki moczowej u mężczyzn (jest drugim co do
częstości występowania czynnikiem etiologicznym nierzeżączkowego uretritis), powoduje także zapalenie gruczołu
krokowego lub najądrza(12). U kobiet ciężarnych zakażenie U.urealyticum może prowadzić do zapalenia błon płodowych(13),
z uszkodzeniem ich ciągłości, co z kolei stwarza ryzyko zakażenia płodu. Ponadto zakażenia w układzie moczowopłciowym mogą prowadzić do niepłodności(3, 4, 5).
•
Mycoplasma hominis (Mh) jest czynnikiem etiologicznym zapalenia błony śluzowej macicy i zapalenia jajowodów(12),
ponadto powoduje nieswoiste stany zapalne pochwy(8).
Oba gatunki mogą być odpowiedzialne za:
•
Zakażenia okołoporodowe noworodków (zapalenie opon mózgowych, infekcje układu oddechowego, posocznica) (9) (10) (12)
(13)
.
•
Posocznicę poporodową(6) (12).
•
Zapalenie stawów
Ponieważ mykoplazmy mogą być zarówno komensalami jak i patogenami, należy przyjąć ilościowe kryteria interpretacji
wyników hodowli z próbek urogenitalnych od osób dorosłych(1,2,11). Decyzja o wprowadzeniu leczenia zależna jest od miana
mykoplazm oraz objawów klinicznych .
Test MYCOPLASMA DUO umożliwia:
• Hodowlę, identyfikację i oznaczenie miana mykoplazm urogenitalnych (UU i MH)
• Sporządzenie wystandaryzowanego inokulum do oznaczenia wrażliwości na antybiotyki
2 - ZASADA METODY
Studzienka X o właściwościach wybiórczych zawiera czynnik przeciwgrzybiczy i mieszaninę antybiotyków.
Identyfikację / oznaczenie miana mykoplazm urogenitalnych oparto na charakterystycznych cechach metabolicznych
poszczególnych drobnoustrojów, jakimi jest zdolność hydrolizy:
- mocznika przez Ureaplasma urealyticum (UU).
- argininy przez Mycoplasma hominis (MH).
z uwolnieniem amoniaku, który powoduje alkalizację podłoża (bez jego zmętnienia).
O zajściu reakcji świadczy zmiana barwy wskaźnika pH (czerwieni fenolowej) z żółtej na czerwoną:
• Żółta studzienka: brak mykoplazm
• Czerwona studzienka: obecność mykoplazm
Oznaczenie miana polega na metodzie kolejnych rozcieńczeń:
poprzez rozcieńczanie w podłożu do zawiesin, w studzience D (rozcieńczenie 10-1), a następnie w studzienkach U ≥ 104 i H ≥
104 (rozcieńczenie 10-2).
Miano odpowiada liczbie studzienek, które zmieniły barwę na czerwoną w ciągu 24 do 48 godzin; każda czerwona studzienka
zawiera co najmniej jedną CCU (jednostkę zmiany barwy) – patrz diagram odczytu.
Test wrażliwości na antybiotyki. Wybiórcze warunki w studzience X umożliwiają namnożenie drobnoustrojów i sporządzenie
wystandaryzowanego inokulum (103 do 105 CCU/ml; Colour Changing Units = jednostki zmiany barwy) do oznaczenia
wrażliwości na antybiotyki po 24-godzinnej inkubacji.
1
3 - SKŁAD ZESTAWU – PRZECHOWYWANIE – TRWAŁOŚĆ
• Postać testu:
Mycoplasma Duo, nr kat. 62740
•
•
•
•
•
20 mikropłytek składających się z następujących studzienek:
6 studzienek, które zawierają:
odwodnione substraty do identyfikacji gatunku
czynniki wzrostowe dla mykoplazm
czynniki hamujące wzrost flory towarzyszącej
studzienki U i U ≥ 104 : do identyfikacji i oznaczenia miana UU (zawierają
mocznik)
H i H ≥ 104 : do identyfikacji i oznaczenia miana MH (zawierają argininę)
D: studzienka do rozcieńczeń
X: namnażające podłoże wybiórcze dla mykoplazm, do przygotowania
wystandaryzowanego inokulum do testu wrażliwości
20 fiolek po 2 ml podłoża do sporządzania zawiesin/transportowego
1 fiolka z kroplomierzem, zawiera 15 ml rozcieńczalnika.
40 plastikowych mikropipet (po 2 na każdą próbkę).
20 sztuk folii adhezyjnej.
Mycoplasma Duo suspension medium (nr kat. 62739)
• 40 fiolek po 2 ml podłoża do sporządzania zawiesin; jednocześnie jest to podłoże
transportowe.
• Przechowywanie: w temp. +2-8°C.
• Trwałość: zgodnie z datą ważności, podaną na opakowaniu.
4 - PRÓBKI
1) Materiały pobrane z dróg moczowo-płciowych: Wymazy z cewki moczowej, szyjki macicy, pochwy (a także rzadziej
pobierane wymazy z nosogardzieli i zeskrobiny ze spojówek u niemowląt). Ponieważ mykoplazmy przylegają ściśle do
komórek nabłonkowych, do prawidłowego pobrania materiału zaleca się specjalne wymazówki (cytobrush lub Bactopick®), które
następnie należy umieścić w 2 ml podłoża.
2) Płyny fizjologiczne:
• Mocz*:
- pobrany z początkowego strumienia i zhomogenizowany,
- z całej mikcji: odwirowany i osad zawieszony w 0.2 ml soli fizjologicznej
• Nasienie i rzadsze materiały: supernatant z hodowli krwi, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn stawowy, popłuczyny oskrzelowe
od noworodków. 0.2 ml materiału zawiesić w 2 ml podłoża do zawiesin.
*
Ze względu na przyleganie mykoplazm do komórek, najlepszymi materiałami z dróg moczowo-płciowych są materiały
zawierające komórki nabłonkowe: wymazy z cewki moczowej, szyjki macicy i pochwy.
Należy zapoznać się z zaleceniami dotyczącymi warunków przechowywania materiałów biologicznych(14).
3) Transport:
Próbki należy transportować w podłożu do zawiesin; po inokulacji podłoże można przechowywać:
• 48 godzin w temp. pokojowej
• 72 godziny w temp. +2-8°C
• 6 miesięcy, zamrożone w temp. -20°C
5 - PROCEDURA
A. INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY
• Cieplarka o temp. 37°C
• Pojemnik na odpady zakaźne
B. PROCEDURA
Inokulacja mikropłytki
1) Rozcieńczalnik
Przy pomocy kroplomierza nanieść po 4 krople (200 μl) rozcieńczalnika do każdej z trzech studzienek dolnego rzędu
mikropłytki: U ≥ 104 , D, H ≥ 104.
2
2) Próbka
Mikropipetą nanieść podłoże zaszczepione badanym materiałem:
• Po 4 krople (100 μl) do trzech studzienek górnego rzędu mikropłytki: U, X, H;
• 1 kroplę (25 μl) do studzienki D.
3) Rozcieńczenie
Nową pipetą (jest to bardzo ważne, gdyż mykoplazmy przylegają do plastiku) dokładnie wymieszać zawartość studzienki D
(3 x pobierając zawiesinę do pipety), a następnie rozcieńczyć zawiesinę, przenosząc po 1 kropli (25 μl) do studzienki U ≥ 104 i
do studzienki H ≥ 104.
Inkubacja
• Zakryć mikropłytkę folią adhezyjną.
• Inkubować przez 24 godziny w cieplarce, w temp. 37°C, o ile nie jest wymagane przedłużenie inkubacji przez kolejne 24
godziny (patrz p.7).
6 - ODCZYT - INTERPRETACJA WYNIKÓW
1) Odczyt
• Pierwszy odczyt wyników następuje po 24 godzinach inkubacji: uzyskuje się wtedy ostateczny wynik dla próbek
zawierających mykoplazmy w wysokim mianie (≥ 104 CCU/ml);
• Kolejny odczyt po 48 godzinach jest niezbędny do:
- Potwierdzenia wyniku ujemnego,
- Wykrycia drobnoustrojów występujących w niskim mianie (≤ 103 CCU/ml),
- Wykrycia drobnoustrojów występujących w wysokim mianie (≥104 CCU/ml), lecz w przypadku szczepu o wolniejszych
procesach metabolicznych.
3
2) Interpretacja
O obecności mykoplazm w badanej próbce świadczy zmiana barwy z żółtej na czerwoną studzienki z mocznikiem i/lub argininą,
bez zmętnienia podłoża. Odczyt i interpretacja są takie same w przypadku obu gatunków: studzienki U i ≥ 104 są przeznaczone
dla UU, studzienki H i H ≥ 104 są przeznaczone dla MH.
MYCOPLASMA DUO umożliwia oznaczenie miana dwóch gatunków mykoplazm, obecnych w jednej próbce.
Badane próbki można sklasyfikować jako:
• Ujemne: brak zmiany barwy (podłoże żółte)
• Dodatnie pod względem UU: zmiana barwy tylko w studzience/studzienkach U
• Dodatnie pod względem MH: zmiana barwy tylko w studzience/studzienkach H
• Dodatnie pod względem UU i MH: Zmiana barwy zarówno w studzienkach U, jak i H świadczy o obecności w próbce
mykoplazm obu gatunków; należy odczytać miano każdego z nich.
4
Uwagi
• Po 48 godzinach wyniki nie ulegają zmianie, umożliwiając odczyt opóźniony (np. po weekendzie).
• Identyfikację można potwierdzić obserwując wzrost kolonii na agarze, przeznaczonym do hodowli mykoplazm.
• W przypadku zmętnienie podłoża, co wskazuje na zanieczyszczenie innymi bakteriami (występuje rzadko ze względu na
wybiórczość podłoża do zawiesin), należy przesiać 3 krople hodowli z podłoża do zawiesin lub ze studzienki D na
powierzchnię agaru i inkubować przez 48 godzin w temp. 37°C w atmosferze 10% CO2.
• Metoda pozwala na oznaczenie miana mykoplazm na poziomie 103 i 104/ml, uznanym za granicę stanu chorobowego(7).
7 - WYKORZYSTANIE STUDZIENKI X
Studzienka X nie powinna być uwzględniana w interpretacji wyniku, zawiera podłoże wybiórcze dla mykoplazm i jest
przeznaczona do namnożenia tych drobnoustrojów w celu przygotowania wystandaryzowanego inokulum do testu wrażliwości
na antybiotyki (SIR MYCOPLASMA, nr kat. 62781).
Zawartość studzienki należy rozcieńczyć w stosunku 1:100:
• w podłożu płynnym z mocznikiem (U9, nr kat. 62762), dla UU
• w podłożu płynnym z argininą (Arginine, nr kat. 62763), dla MH
Ze studzienki X należy pobrać 20 μl hodowli i przenieść do 2 ml podłoża z mocznikiem lub argininą, w zależności od gatunku
mykoplazmy. Uzyskana w ten sposób, rozcieńczona 1:100 hodowla, posłuży następnie do inokulacji testu wrażliwości SIR
MYCOPLASMA (po 100 μl do każdej studzienki).
5
8 - CHARAKTERYSTYKA / KONTROLA JAKOŚCI
SZCZEPY WZORCOWE
Ureaplasma urealyticum ref UU 80
Mycoplasma hominis ref MH 31
Enterococcus faecalis CIP 76117
Proteus mirabilis ATCC 25933
Staphylococcus aureus CIP 52148
KONTROLA AKTYWNOŚCI
Satysfakcjonująca
identyfikacja, oznaczenie miana i namnożenie
KONTROLA SELEKTYWNOŚCI MIKROPŁYTKI
Zahamowanie wzrostu
Zahamowanie wzrostu
KONTROLA SELEKTYWNOŚCI PODŁOŻA
Zahamowanie wzrostu
9 - KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA
Odczynniki zostały przygotowane zgodnie z Systemem Jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego
produktu komercyjnego.
Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria.
Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii.
10 - OGRANICZENIA METODY
W przypadku moczu można uzyskać wyniki fałszywie ujemne z powodu zbyt małej liczby komórek w próbce lub fałszywie
dodatnie przy zasadowym pH.
11 - REFERENCJE
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
12)
13)
14)
EB F. and ORFILA J., Les Mycoplasmes génitaux: rôle pathogène et diagnostic, Méd. Mal. infect, 1985, 9bis, 491-494
SCHIEFFER H.G., Urethral syndrome in women: etiologic, cytologic and clinical studies, (abstract) June 1988: 7th Congress
InternationalOrganization for Mycoplasmology - Vienna
QUINN P.A. and coll. Incidence of late loss and U. urealyticum in women with recurrent pregnancy loss, Abstract of the 1987
ICAAC
LAMONT R.F. TAYLOR ROBINSON D. and coll. The role of mycoplasmas, ureaplasmas and chlamydia in the genital tract of
women presenting spontaneous early preterm labor., J. Med. Microbiol., 1987,- 24, 253-257
WAITES K.B. and coll. Ureaplasma pneumonia and sepsis associated with persistent pulmonary hypertension in the newborn,
(abstract) June 1988: 7th Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna
PHILLIPS L.E. and coll., Post cesarean wound infection by Mycoplasma hominis in a patient with persistent post partum fever,
Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1987, 7, 193-197
BEBEAR C. and RENAUDIN H., Les mycoplasmes génitaux : principe d’isolement et d’identification, Feuil. Biol., 1986, 27,19-23
MARDH P.A. and coll., Mycoplasma hominis in women with bacterial vaginosis and their consorts, (abstract) June 1988: 7th
Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna
WAITES K.B. and coll., Chronic Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis infections of central nervous system in
preterm infants. Lancet, 1988, 2/9, 17-21
MADOFF S. & HOOPER D.C., Non genitourinary infections caused by Mycoplasma hominis in Adults. Rev. Infect. Dis., 1988, 3,
602-612
BONISSOL CH., Isolement et identification des mycoplasmes urogénitaux, Méd. Mal. infect., 1980, 10, 640-646
COPIN E. and LEBRUN L., Infections à mycoplasmes urogénitaux, Feuil. Biol, 1991, 32, (181), 9-15
CASSELL G.H., WAITES K.B., WATSON H.L., CROUSE D.T. and HARASAWA R., Ureaplasma urealyticum intra-uterine
infection: role in prematurity and disease in newborns, Clin. Microbiol, Rew., 1993, 6 (1), 69-87
Basic Laboratory Procedures Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva. 1991. 1st edition.
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33
881055
02/2010
6