Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na

Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 2 • 169-175
Praca oryginalna • Original Article
Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu
flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans
Comparison of methods, useful in assessing the impact of
fluconazole on Candida albicans viability
Dominika Trzaska, Monika Kocot, Zenon P. Czuba
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu
Medycznego w Katowicach
Streszczenie
Celem pracy było porównanie metod pozwalających na ocenę wpływu różnych stężeń flukonazolu na komórki Candida albicans tj. posiewu ilościowego, spektrofotometrii, testu MTT, chemiluminescencji i mikroskopii fluorescencyjnej z udziałem
oranżu akrydyny. W badaniach wykorzystano szczep referencyjny Candida albicans ATCC 10231. W pierwszym etapie porównano liczby wyrosłych kolonii komórek grzyba na stałych podłożach Sabourauda, które posiewano z hodowli kontrolnych,
prowadzonych na stałym i płynnym podłożu Sabourauda. Gęstości optyczne zawiesin wyjściowych, mierzonych przy długości
fali λ=550 nm, wynosiły 0,5 oraz 1,0 według skali McFarlanda. Ponadto określono zmiany w liczebności komórek C. albicans
poddanych działaniu flukonazolu w stężeniach 0,1; 1,0 oraz 10 µg/ml w stosunku do kontroli. Metoda posiewu ilościowego
umożliwiła określenie przydatności skali McFarlanda do oceny gęstości komórek badanego szczepu w zawiesinie, przeprowadzenie analizy porównawczej liczby wyrosłych kolonii na stałych podłożach, jak również określenie wpływu flukonazolu na
żywotność C. albicans. Do oceny żywotności komórek C. albicans w hodowlach badanych wykorzystano również test MTT,
metodę spektrofotometryczną, a także mikroskopię fluorescencyjną z użyciem barwienia oranżem akrydyny. W niniejszej pracy określono procent komórek żywych w próbach poddanych działaniu flukonazolu.
Summary
The aim of this study was to compare methods used to estimate of Candida albicans cells viability, like quantitative culture,
absorption spectrophotometry, MTT assay, chemiluminescence method and fluorescence microscopy with acridine orange
dye. The references strain of Candida albicans ATCC 10231 was used in this study as a control. At first stage of research, we
compared numbers of yeast colonies after growth on solid Sabourauda medium, which we inoculated from control culture,
maintained on solid and in liquid Sabourauda medium. Optical density of starting measured suspension at 550 nm wavelength conformed 0,5 and 1,0 in McFarland’s scale. Moreover we specyfied changes in number of C. albicans cells, treated of
fluconazole in concentrations 0,1; 1,0 and 10 µg/ml, according to the control. The solid medium culture allowed us to assess
usefulness of McFarland’s scale for estimating cell density in suspension, comperative analysis of cells number on medium
and defining fluconazole influence on C. albicans cell viability. To assess the C. albicans cell viability we used MTT assay,
spectrophotometry and fluorescence microscopy with acridine orange. In this study we estimated percent of lives cells after
fluconazole treatment.
Słowa kluczowe:Candida albicans, żywotność komórek, spektrofotometria, chemiluminescencja, analiza MTT
Key words:Candida albicans, cell viability, spectrophotometry, chemiluminescence, MTT assay
Wstęp
W ciągu ostatnich lat znacznie wzrosła częstość występowania grzybic, zarówno powierzchniowych jak i układowych,
w których dominujący czynnik etiologiczny stanowią drożdżaki z rodzaju Candida, zwłaszcza Candida albicans [1].
Zakażenia grzybicze dotyczą obecnie około 40% ludności
świata, a najczęstszą ich lokalizacją jest skóra i jej przy-
datki. Zakażenia te stanowią 7,9% przyczyn zakażeń szpitalnych. Zajmują czwarte miejsce wśród tych zakażeń na
oddziałach intensywnej opieki medycznej i obarczone są
w 67-83% śmiertelnością [11, 16]. Pomimo ciągłego postępu
w rozpoznawaniu i leczeniu zakażeń grzybiczych pozostają
więc one nadal poważnym problemem medycznym. Warunkiem skutecznej i bezpiecznej terapii grzybic jest przede
169
Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans
wszystkim właściwe rozpoznawanie infekcji, połączone
z identyfikacją patogennych grzybów, a także właściwy wybór skutecznej i akceptowanej przez chorego metody leczenia. Równie ważna jest odpowiednia profilaktyka, polegająca
głównie na usuwaniu czynników predysponujących do zakażenia. Podstawowa diagnostyka mykologiczna obejmuje badanie mikroskopowe materiału biologicznego pobranego od
pacjenta, hodowlę na podłożu agarowym oraz identyfikację
biochemiczną z użyciem testów opartych na auksanografii
węglowodanowej i związków azotowych (testy przyswajania węgla i azotu z określonych związków organicznych)
oraz ocenie zdolności wytwarzania określonych enzymów.
Uzupełnieniem diagnostyki może być także badanie histologiczne wycinka pobranego z miejsca zajętego przez kolonie grzyba, ocena przeciwciał przeciwgrzybiczych we krwi
pacjenta (test immunoenzymatyczny - ELISA) [7, 15] oraz
wykrycie materiału genetycznego grzyba z wykorzystaniem
technik biologii molekularnej (w tym PCR, real-time PCR) [5,
7, 15, 17, 18]. Metody te dają jednak jedynie wynik jakościowy. Dlatego też celem niniejszej pracy była ocena przydatności posiewu ilościowego na podłożu agarowym w ocenie
żywotności komórek C. albicans poddanych działaniu flukonazolu oraz porównanie tej metody z innymi, nie wykorzystywanymi rutynowo w diagnostyce mykologicznej tj. z testem
MTT, barwieniem oranżem akrydyny i oznaczaniem ATP metodą chemiluminescencji [6, 8, 10, 19].
Materiały i metody
Badany szczep i warunki hodowli
Do badań wykorzystano szczep referencyjny Candida albicans ATCC 10231, pochodzący z American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA. Przed użyciem
badany szczep został poddany procedurze sprawdzenia
czystości, obejmującej obserwację mikroskopową w celu
potwierdzenia typowego kształtu komórek badanych, identyfikację biochemiczną przy użyciu testu API 20C AUX firmy
Biomerieux Industry, Warszawa, Polska, (przeprowadzoną
zgodnie z zaleceniami producenta), a także wzrost na selektywnym podłożu chromogennym. Test API 20C AUX jest
wystandaryzowanym zestawem do identyfikacji drożdżaków
w czasie 18-24 godzin i umożliwia przeprowadzenie 12 testów tj. reakcji enzymatycznych lub zakwaszania cukrów, które uwidaczniają się podczas inkubacji dzięki spontanicznym
zmianom barwy. Komórki C. albicans hodowano na stałym
podłożu Sabourauda, zawierającym pepton (10,0 g/l), glukozę (40,0 g/l) oraz agar (8,0 g/l). Hodowlę prowadzono w temperaturze 37°C i regularnie przesiewano co 48-72 godziny.
Metoda posiewu ilościowego
W celu przygotowania komórek badanego szczepu do analizy zastosowano metodę rozcieńczeń. W pierwszym etapie
przygotowano jałowy roztwór związku przeciwgrzybicznego
- flukonazolu o stężeniu 1 mg/ml, w jałowym buforowanym
fizjologicznym roztworze soli (PBS), pozbawionym jonów
wapnia i magnezu. Następnie ze sporządzonego roztworu
170
wyjściowego, techniką dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przygotowano roztwory flukonazolu w jałowej soli fizjologicznej
(0,85%) o stężeniach: 20; 10 i 1,0 µg/ml.
W drugim etapie, z 48-godzinnej hodowli szczepu referencyjnego C. albicans na stałym podłożu Sabourauda, sporządzono zawiesiny w roztworze soli fizjologicznej (0,85%).
Gęstości optyczne zawiesin (OD, optical density) zmierzone
przy użyciu densytometru DensiLaMetr (typ Densi-2, EMO),
przy długości fali λ=550 nm, wynosiły odpowiednio 0,250
oraz 0,500 (standard 1,0 oraz 2,0 według skali McFarlanda). Następnie przygotowane szeregi roztworu flukonazolu
dodawano do wyjściowych zawiesin szczepu C. albicans,
uzyskując w równej objętości końcowe stężenia flukonazolu
10; 1,0 i 0,1 µg/ml. W ostatnim etapie hodowle inkubowano
24 godziny w temperaturze 37°C.
Po okresie inkubacji z przygotowanych hodowli komórek
C. albicans ze związkiem przeciwgrzybicznym, sporządzono
szeregi dziesięciokrotnych rozcieńczeń w zakresie od 10-1
do 10-5. Z trzech ostatnich stężeń z każdego szeregu pobierano po 2 µl zawiesiny, które przy użyciu ezy kalibrowanej
posiewano ilościowo metodą murawkową na powierzchni
stałego podłoża Sabourauda. Posiane płytki inkubowano 48
godzin w temperaturze 37°C. Równocześnie przygotowano hodowle kontrolne z 24- i 48-godzinnej hodowli szczepu
wzorcowego.
Ocenę ilościową komórek badanych C. albicans, wyrażoną
przez jednostki tworzące kolonie (CFU - colony forming unit),
przeprowadzono w porównaniu do hodowli kontrolnych, pozbawionych związku badanego. Zliczano wyrosłe pojedyncze kolonie na płytce, a uzyskane dane wykorzystano do
określenia przydatności skali McFarlanda do oceny gęstości
komórek badanego szczepu w zawiesinie, do przeprowadzenia ilościowej analizy porównawczej wyrosłych kolonii
komórek grzyba pochodzących z hodowli prowadzonej na
stałym podłożu Sabourauda, celem określenia wpływu flukonazolu na żywotność C. albicans w hodowlach badanych
w porównaniu do kontroli. Wszystkie oznaczenia prowadzono w dwóch powtórzeniach.
Ocena żywotności Candida albicans metodą spektrofotometryczną
W pierwszym etapie przygotowano w dwóch szeregach rozcieńczenia roztworu flukonazolu w jałowej soli fizjologicznej
(0,85%), o stężeniach: 20; 10 i 1,0 µg/ml, które następnie
dodano do zawiesin szczepu badanego C. albicans. Gęstości optyczne zawiesin wyjściowych, przygotowanych
z 48-godzinnej hodowli grzyba na stałym podłożu Sabourauda, wynosiły odpowiednio 0,250 dla pierwszego szeregu
oraz 0,500 dla drugiego (standard 1,0 oraz 2,0 według skali
McFarlanda). Ostatecznie w hodowlach badanych uzyskano stężenie flukonazolu równe 10; 1,0 i 0,1 µg/ml. Przygotowano również hodowle kontrolne, pozbawione związku
przeciwgrzybiczego, o gęstościach optycznych 0,125 oraz
0,250 (standard 0,5 oraz 1,0 według skali McFarlanda). Dodatkowo dla flukonazolu sporządzono widmo absorbcyjne,
D. Trzaska, M. Kocot i Z.P. Czuba
w zakresie od 800 do 200 nm, przy użyciu spektrofotometru
JASCO V-630 (Japonia).
Tak przygotowane próby poddano 24-godzinnej inkubacji
w temperaturze 37°C. Po upływie czasu inkubacji zmierzono
gęstość optyczną prób badanych i kontrolnych a następnie
pobierano po 200 μl i tę ilość zawiesiny nanoszono na mikropłytkę. Odczyt prowadzono w trzech powtórzeniach w automatycznym czytniku do mikropłytek Elx 800 firmy BioTek
Instr., (USA), przy długości fali λ=550 nm. Z otrzymanych
danych wyliczono procent żywotności C. albicans w obecności badanego związku w porównaniu do kontroli.
Ocena żywotności komórek Candida albicans testem
MTT
Ocenę żywotności komórek badanych C. albicans przeprowadzono z użyciem testu MTT. Polega on na oznaczeniu
barwnego produktu – formazanu, powstającego po dodaniu
bromku [3-(4,5-dimetylo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolu] (MTT)
do zawiesiny hodowlanej zawierającej badany związek. Stężenie powstającego produktu jest proporcjonalne do ilości
żywych komórek. Nierozpuszczalne w wodzie kryształki formazanu gromadzą się w komórkach i do ich rozpuszczenia
konieczne jest użycie roztworu rozpuszczającego barwnik.
W tym celu użyto 100% dimetylosulfotlenek (DMSO). Stężenie uwolnionego barwnika mierzono ilościowo w automatycznym czytniku do płytek 96-dołkowych metodą spektrofotometryczną, przy długości fali λ=550 nm, porównując
wartości w próbach badanych do kontrolnych [8].
Przygotowanie komórek C. albicans do analizy przebiegało według opisanej procedury, obejmującej przygotowanie
zawiesin wyjściowych i szeregu rozcieńczeń flukonazolu
w odpowiednich stężeniach oraz 24-godzinną inkubację
w temperaturze 37°C. Jednocześnie przygotowano próby
kontrolne pozbawione związku przeciwgrzybiczego, o gęstości 0,5 i 1,0 w skali McFarlanda. Po inkubacji próbki odwirowano, ściągnięto nadsącz a do osadu komórek dodano
po 450 µl HBSS i 50 µl roztworu MTT i ponownie inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Następnie próbki
ponownie odwirowano, ściągnięto nadsącz a do osadu komórek dodano 300 µl DMSO (100%), po czym zawiesiny
komórek poddano wytrząsaniu. Na mikropłytkę naniesiono
po 150 µl zawiesiny badanej i kontrolnej a następnie przeprowadzono analizę kolorymetryczną wytworzonego formazanu przy długości fali λ=550 nm, z użyciem automatycznego czytnika do mikropłytek [6, 8, 9]. Odczyt prowadzono
w trzech powtórzeniach. Z otrzymanych danych wyliczono
procent żywotności komórek C. albicans w obecności badanego związku, w porównaniu do kontroli.
Oznaczanie ATP metodą chemiluminescencji
Zasada luminometrycznego oznaczania ATP z użyciem układu lucyferyna/lucyferaza opiera się na następującej reakcji,
katalizowanej przez lucyferazę:
ATP + lucyferyna + O2 oksylucyferyna + AMP + PPi + CO2
Po upływie 24-godzinnej inkubacji zawiesin kontrolnych
i badanych, przeprowadzono ekstrakcję ATP z komórek
C. albicans przy użyciu 5% kwasu trójchlorooctowego (TCA).
Do probówki typu eppendorf dodano 60 μl zawiesiny badanej z flukonazolem oraz 20 μl kwasu trójchlorooctowego
i inkubowano w temperaturze 4oC. Jednocześnie przygotowano próbę kontrolną, którą stanowiła zawiesina komórek
C. albicans pozbawionych wpływu związku przeciwgrzybiczego (60 μl) oraz kwas trójchlorooctowy (20 μl), sprzężony
ze wskaźnikiem pH – ksylenolem oraz próbę ślepą (woda
destylowana + TCA). Po inkubacji pobrano po 40 μl zawiesiny i dodano 160 μl buforu do oznaczeń (0,1 M TRIS-kwas
octowy o pH 7,75 z 2 mM EDTA). Następnie z uprzednio
przygotowanych próbek pobrano po 20 μl i do tej ilości dodano po 140 μl buforu do oznaczeń, 40 μl odczynnika zawierającego lucyferynę i lucyferazę. Inkubowano 10 minut
w temperaturze pokojowej. Zmierzono luminescencję z użyciem luminometru LB Centro XS3 (Berthold Technologies,
Niemcy). Następnie dodano 10μl standardu ATP, ponownie
zmierzono luminescencję w celu zbadania wpływu czynników obecnych w próbce. Ilość uwolnionego ATP jest proporcjonalna do ilości żywych komórek C. albicans. Odczynniki
stosowane w oznaczeniu pochodziły z firmy Bio-Orbit (LKB
Wallac, Turku, Finlandia) [13, 19].
Ocena żywotności komórek Candida albicans metodą
mikroskopową z użyciem oranżu akrydyny
Przygotowanie komórek C. albicans do analizy przebiegało
według wyżej opisanej procedury, obejmującej przygotowanie zawiesin wyjściowych i szeregu rozcieńczeń flukonazolu o odpowiednich stężeniach oraz 24-godzinną inkubację
w temperaturze 37°C. Po upływie czasu inkubacji pobrano
po 1 ml zawiesin badanych, które następnie odwirowano
a nadsącz odrzucono. Do osadu komórek dodano 50 µl roztworu oranżu akrydyny (1:100000) i poddano 15-minutowej
inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie po dodaniu
100 µl buforu HBSS, próbki poddano wytrząsaniu i analizie
mikroskopowej z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego IX51 (Olympus, Japonia) przyjmując komórki fluoryzujące na
zielono za żywe, a fluoryzujące na czerwono za martwe. Dla
prób badanych, traktowanych flukonazolem zliczano liczbę komórek żywych na 100 komórek w polu widzenia, celem obliczenia żywotności komórek C. albicans, wyrażonej
w procencie kontroli [10, 12].
Analiza statystyczna
W opracowaniu statystycznym wyników korzystano z programu Statictica 9.0. W analizie zależności pomiędzy danymi zastosowano test t-Studenta dla prób zależnych. Wyniki
wyrażono w procencie wartości średnich ± odchylenie standardowe. Liczebność prób dla zastosowanych w badaniach
testów zawierała się w przedziale od 2 do 4. Za różnice statystycznie istotne pomiędzy poszczególnymi próbami badanymi a kontrolą uznawano wartości p<0,05.
(emisja światła)
171
Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans
Wyniki
Czystość badanego szczepu
Na podstawie przeprowadzonej procedury stwierdzono czystość użytego w badaniu szczepu grzyba i przynależność do
C. albicans. Barwienie metodą Grama i obserwacja mikroskopowa wykazały typowy dla tych drożdżaków wygląd komórek.
Hodowla na odpowiednim podłożu chromogennym wykazała
typowy wzrost kolonii, charakterystyczny dla badanego szczepu. Ponadto identyfikacja biochemiczna grzyba, przeprowadzona przy użyciu testu API 20C AUX, jednoznacznie potwierdziła przynależność badanego szczepu do C. albicans.
Metoda posiewu ilościowego
Analiza wyników posiewu ilościowego wykazała wpływ flukonazolu w zastosowanych stężeniach na żywotność komórek
badanych, wyrażoną w procencie kontroli. Dla hodowli badanych C. albicans o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, poddanych działaniu wybranych stężeń flukonazolu, zaobserwowano spadek żywotności komórek badanych w porównaniu
do hodowli kontrolnej (100±15,7%) (p<0,05), za wyjątkiem
najniższego stężenia (ryc. 1). Po wprowadzeniu flukonazolu
w stężeniach 1,0 i 10 μg/ml żywotność C. albicans wynosiła odpowiednio 44,4±2,2% (p=0,0385) oraz 11,1±15,7%
(p=0,0299). Dla najniższego stężenia flukonazolu nie odnotowano różnic statystycznie istotnych (NS). W przypadku
hodowli badanych C. albicans o gęstości 1,0 w skali McFarlanda poddanych działaniu flukonazolu, zaobserwowano
spadek żywotności komórek drożdżaka w porównaniu do
hodowli kontrolnej (100±7,4%) na poziomie istotności p<0,05
dla 0,1 i 10 μg/ml, oraz p<0,01 dla stężenia 1,0 μg/ml. Po
wprowadzeniu flukonazolu w stężeniu 0,1 μg/ml żywotność
komórek drożdżaka wynosiła 52,6±1,1% (p=0,0124), natomiast dla stężeń wyższych wynosiła 42,1±1,1 (p=0,0083)
oraz 36,8±7,4% (p=0,0136) odpowiednio dla 1,0 i 10 μg/ml.
Metoda spektrofotometryczna
Przeprowadzona analiza wartości zmętnienia prób badanych i kontrolnych mierzona przez pomiar absorbancji metodą spektrofotometryczną (λ=550 nm) wykazała istotny wpływ
flukonazolu na żywotność komórek C. albicans, wyrażoną
w procencie kontroli. W przypadku zawiesiny o gęstości 0,5
w skali McFarlanda zaobserwowano istotny spadek żywotności prób badanych poddanych działaniu flukonazolu w stężeniu 1,0 i 10 μg/ml (p<0,01). Po wprowadzeniu flukonazolu
w tych stężeniach żywotność komórek spadła odpowiednio do poziomu 75±1,25% (p=0,0028) oraz 62,5±10,2%
(p=0,002) w porównaniu do wartości kontrolnej (100±10,2%).
Dla najniższego stężenia flukonazolu nie zaobserwowano
różnic statystycznie istotnych (NS) (ryc. 2)
Rycina 2.
Wpływ flukonazolu o stężeniach 0,1; 1,0 i 10 μg/ml na żywotność
komórek Candida albicans, oceniony pomiarem zmętnienia przez
odczyt absorbancji światła przechodzącego metodą spektrofotometryczną, przy długości fali λ=550 nm. Wyniki uzyskane z prób badanych porównano do hodowli kontrolnej, nie zawierającej badanego
związku. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie
standardowe dla n=4, wyrażone w procencie kontroli. Różnice statystycznie istotne zaznaczono gwiazdkami: * p<0,05; ** p<0,01.
Po wprowadzeniu do hodowli grzyba o gęstości 1,0 w skali
McFarlanda flukonazolu w stężeniach 1 i 10 μg/ml odnotowano spadek żywotności komórek C. albicans w porównaniu
do kontroli (100±22,5%) odpowiednio do poziomu 57,5±13%
(p<0,05) oraz 45±6,9% (p<0,01). Dla najniższego stężenia
flukonazolu nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych (NS) (ryc. 2).
Rycina 1.
Wpływ flukonazolu o stężeniach 0,1; 1,0 i 10 μg/ml na żywotność
komórek Candida albicans, oceniony metodą posiewu ilościowego
na stałym podłożu Sabourauda. Ocenę ilościową komórek badanych (rozcieńczenia 10-3), wyrażoną przez jednostki tworzące kolonie (CFU), przeprowadzono w porównaniu do hodowli kontrolnej nie
zawierającej badanego związku. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie standardowe dla n=2, wyrażone w procencie kontroli. Różnice statystycznie istotne próby badanej względem
kontroli zaznaczono gwiazdkami: * p<0,05; ** p<0,01.
172
Test MTT
Przeprowadzona analiza wartości stężenia formazanu uwolnionego z komórek poddanych działaniu flukonazolu wykazała wpływ badanych stężeń związku na ten parametr
w porównaniu do kontroli. Otrzymane dane posłużyły do oceny żywotności komórek C. albicans wyrażonej w procencie
kontroli. Po wprowadzeniu do hodowli badanej (gęstość 0,5
w skali McFarlanda) flukonazolu w stężeniu 0,1 i 1,0 μg/ml
zaobserwowano istotny spadek żywotności komórek drożdżaka w porównaniu do kontroli (100±2,9%) odpowiednio
do poziomu 93,9±2% (p=0,014) oraz 80,8±5,1% (p=0,0006).
Dla najwyższego stężenia także wykazano istotny spadek
D. Trzaska, M. Kocot i Z.P. Czuba
żywotności do wartości 68±2,1% (p<0,001) (ryc. 3). Dla hodowli badanej o gęstości 1,0 według skali McFarlanda poddanych działaniu flukonazolu w dwóch najwyższych stężeniach również zaobserwowano istotny spadek żywotności
komórek badanych w porównaniu do wartości kontrolnej
(100±1,7). Po wprowadzeniu flukonazolu w stężeniu 1,0
i 10 μg/ml żywotność komórek wynosiła kolejno 81,2±0,8%
(p<0,001) oraz 76±2,4% (p<0,001). Po wprowadzeniu flukonazolu w stężeniu 0,1 μg/ml do hodowli badanej nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych w żywotności komórek C. albicans w porównaniu do kontroli (NS) (ryc. 3).
Rycina 4.
Wpływ flukonazolu o stężeniach 0,1; 1,0 i 10 μg/ml na żywotność
komórek Candida albicans, oceniony metodą mikroskopową z użyciem barwnika fluorescencyjnego. Zliczano liczbę żywych komórek
(fluoryzujących na zielono) z prób badanych, na 100 komórek w polu
widzenia. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie
standardowe dla n=3, wyrażone w procencie kontroli. Różnice istotne statystycznie zaznaczono gwiazdkami: ** p<0,01; *** p<0,001.
działaniu flukonazolu i porównanie ich z wartościami uzy-
Rycina 3.
Wpływ flukonazolu o stężeniach 0,1; 1,0 i 10 μg/ml na żywotność
komórek Candida albicans, oceniony ilościowym pomiarem stężenia
formazanu uwolnionego z komórek żywych metodą spektrofotometryczną przy długości fali λ=550 nm. Wyniki uzyskane z prób badanych porównano do hodowli kontrolnej, nie zawierającej badanego
związku. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie
standardowe dla n=4, wyrażone w procencie kontroli. Różnice statystycznie istotne zaznaczono gwiazdkami: * p<0,05; *** p<0,001.
Metoda mikroskopowa z barwieniem oranżem akrydyny
Analiza danych z ilości komórek żywych C. albicans (fluoryzujących na zielono) zliczanych na 100 komórek w polu
widzenia metodą mikroskopową, posłużyły do obliczenia żywotności komórek drożdżaka poddanych działaniu flukonazolu. Wykazano wpływ flukonazolu na żywotność komórek
badanych na poziomie istotności (p<0,01 oraz p<0,001), wyrażoną w procencie kontroli. Dla hodowli grzyba o gęstości
0,5 w skali McFarlanda zaobserwowano spadek żywotności
komórek poddanych działaniu flukonazolu we wszystkich
stężeniach tj. 0,1; 1,0 i 10 μg/ml (p<0,001), w porównaniu
do kontroli (100±0,1%). Dane widoczne na wykresie (ryc.
4). W przypadku hodowli badanej C. albicans o gęstości 1,0
w skali McFarlanda żywotność komórek grzyba istotnie
spadła w porównaniu z hodowlą kontrolną (100±0,1%). Po
wprowadzeniu flukonazolu we wzrastających stężeniach żywotność komórek zmniejszyła się istotnie się odpowiednio
do wartości 97,3±0,6% (p=0,0014); 92,3±0,6% (p<0,001)
oraz 88,7±0,6% (p<0,001) (ryc. 4).
Oznaczanie ATP metodą chemiluminescencji
Przeprowadzona analiza wyników pozwoliła na obliczenie
ilości ATP uwolnionego z komórek C. albicans poddanych
skanymi dla próby kontrolnej. Otrzymane dane posłużyły
do obliczenia żywotności komórek wyrażonej w procencie
kontroli. Zarówno dla hodowli o gęstości 0,5 jak i dla 1,0
w skali McFarlanda odnotowano istotny spadek żywotności
komórek badanych (p<0,05 oraz p<0,01). Po wprowadzeniu do hodowli grzyba o gęstości 0,5 w skali McFarlanda
flukonazolu w stężeniu 1, i 10 μg/ml żywotność komórek C.
albicans spadła z poziomu 100±1,19% w kontroli do wartości, odpowiednio 93,9±0,5% (p=0,0226) oraz 92,2±1,2%
(p=0,0235). Dla najniższego stężenia związku nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych w porównaniu do kontroli (NS) (ryc. 5). Dla hodowli grzyba o gęstości 1,0 w skali
McFarlanda odnotowano zmniejszenie żywotności komórek
w próbach badanych poddanych działaniu wzrastających
stężeń flukonazolu, w porównaniu do kontroli (100±0,4%)
i uzyskano następujące wartości: 91,4±0,5% (p<0,01) dla
Rycina 5.
Wpływ flukonazolu o stężeniach 0,1; 1,0 i 10 μg/ml na żywotność
komórek Candida albicans, oceniony przez pomiar uwolnionego z
komórek żywych ATP (μmol/l) metodą chemiluminescencji. Wyniki
uzyskane z prób badanych porównano do hodowli kontrolnej, nie
zawierającej badanego związku. Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± odchylenie standardowe dla n=3, wyrażone w procencie kontroli. Różnice statystycznie istotne zaznaczono gwiazdkami:
* p<0,05; ** p<0,01.
173
Porównanie metod przydatnych w ocenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek Candida albicans
stężenia 1 μg/ml oraz 89,8±0,6% (p<0,01) dla stężenia
10 μg/ml. Dla najniższego stężenia związku nie zaobserwowano różnic statystycznie istotnych w porównaniu do kontroli (NS) (ryc. 4).
Dyskusja
W ostatnich latach nastąpił znaczny wzrost zakażeń grzybiczych wywołanych przez C. albicans. Podstawowa diagnostyka mykologiczna, obejmująca obserwację mikroskopową,
hodowlę na podłożu agarowym oraz testy biochemiczne,
pozwala głownie na analizę jakościową i wykrycie czynnika
etiologicznego zakażeń [1, 5]. Ocena żywotności komórek
C. albicans nie jest badaniem rutynowo wykorzystywanym
w mykologii. Dlatego też celem niniejszej pracy było określenie przydatności metod pozwalających na ocenę wpływu
związku przeciwgrzybicznego - flukonazolu w różnych stężeniach na żywotność komórek Candida albicans.
Flukonazol jest przedstawicielem azoli-syntetycznych leków przeciwgrzybicznych (związek grzybostatyczny), którego mechanizm działania związany jest z hamowaniem
zależnej od cytochromu P-450 14α-demetylazy lanosterolu
w biosyntezie hormonów steroidowych grzybów. Prowadzi to
do zmniejszenia ilości ergosterolu – najważniejszego sterolu
w błonie komórkowej grzybów oraz do kumulacji lanosterolu
w błonie komórkowej grzyba, zaburzeń w jej strukturze i funkcjonowaniu, a w efekcie zniszczenia komórki [2, 3, 4, 14].
W badaniach wykorzystano metodę posiewu ilościowego na
podłożu agarowym, metodę spektrofotometryczną, kolorymetryczny test MTT, chemiluminescencyjny pomiar stężenia
ATP oraz metodę mikroskopową z udziałem barwnika fluorescencyjnego.
Analiza statystyczna otrzymanych wyników wykazała przydatność zastosowanych w pracy metod do oceny żywotności komórek C. albicans poddanych działaniu wybranych
stężeń flukonazolu (0,1; 1,0 i 10 μg/ml). Metoda posiewu
ilościowego, spektrofotometrii, chemiluminescencji wykazała negatywny wpływ flukonazolu w stężeniach 1,0 i 10 μg/
ml na żywotność komórek badanych o gęstości 0,5 w skali
McFarlanda. Metody te natomiast nie okazały się przydatne
do oceny żywotności komórek drożdżaka poddanych działaniu flukonazolu w najniższym zastosowanym stężeniu (0,1
μg/ml). W przeciwieństwie do powyższych metod, analiza
mikroskopowa z użyciem barwnika oranżu akrydyny, umożliwiła określenie wpływu flukonazolu na żywotność komórek
C. albicans w najniższym zastosowanym stężeniu, zarówno w odniesieniu do gęstości komórek badanych 0,5 jak
i 1,0 w skali McFarlanda. W teście mikroskopowym wykorzystuje się możliwość przechodzenia oranżu akrydyny przez
błonę komórkową, dzięki czemu barwnik ten zabarwia całą
komórkę, umożliwiając identyfikację komórek żywych. Po
przeprowadzonych badaniach najbardziej czułą i dokładną
metodą okazał się test MTT. Analiza ilości uwolnionego formazanu pozwoliła na ocenę wpływu flukonazolu we wszystkich zastosowanych stężeniach na żywotność komórek C.
albicans. Test MTT jest ilościowym testem toksyczności,
174
którego podstawą jest przekształcenie soli tetrazoliowych
(MTT) o zabarwieniu żółtym do fioletowo zabarwionego, nierozpuszczalnego w wodzie formazanu. Proces ten zachodzi
w mitochondriach żywych komórek a redukcja MTT do formazanu następuje w sposób proporcjonalny do ich ilości.
Jeżeli więc komórki zostały wcześniej uszkodzone lub zniszczone przez związek przeciwgrzybiczny to reakcja ta jest
mniej intensywna lub nie zachodzi w ogóle [6, 8, 9].
Analiza statystyczna wyników uzyskanych wybranymi metodami dla hodowli badanych C. albicans o gęstości 1,0
w skali McFarlanda pozwoliła na podobne obserwacje jak
w przypadku zawiesiny komórek badanych o niższej gęstości w sali McFarlanda.
Piśmiennictwo
1. Biliński P, Seweryńska I, Warzocha K. Diagnostyka i leczenie
układowych zakażeń grzybiczych w onhohematologii. Onkol
Prak Klin 2008; 4: 15–24.
2. Bille J. Mechanisms and clinical significance of antifungal resistance. Int J Antimicrob Agents 2000; 16: 331-333.
3. Carrillo-Munoz AJ, Giusiano G, Ezkurra PA i wsp. Antifungal
agents: Mode of action in yeast cells. Rev Esp Quimioterap
2006; 19: 130-139.
4. Charlier C, Hart E, Lefort A i wsp. Fluconazole for the management of invasive candidiasis: where do we stand after 15 years?.
J Antomicrob Chemother 2006; 57: 384-410.
5. Chybicka A. Kandydoza jako problem w onkologii i hematologii
dziecięcej. Zakażenia 2004; 4: 73-77.
6. Derengowski LS, De-Souza-Silva C, Braz SV i wsp. Antimicrobial effect of farnesol, a Candida albicans quorum sensing molecule, on Paracoccidioides brasiliensis growth and morphogenesis. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2009; 8: 13.
7. Drożdż I, Makarewicz M. Zakażenia mikrobiologiczne. Nowoczesne metody ich wykrywania w przemyśle spożywczym. Laboratorium Przegląd Ogólnopolski 2009. 10: 18-21.
8. Freimoser FM, Jakob CA, Aebi M i wsp. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] Assay Is
a Fast and Reliable Methods for Colorimetric Determination of
Fungal Cell Densities. Appl Environ Microbiol 1999; 65: 37273729.
9. Gregoraszczuk EŁ. Hodowla in vitro w toksykologii – Hodowla tkanek w badaniach toksykologicznych. Hodowla komórek i
tkanek, pod red. S. Stokłosowej, Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa 2004; 251-252.
10. Gregoraszczuk EŁ. Hodowla in vitro w toksykologii – Hodowla tkanek w badaniach toksykologicznych. Hodowla komórek i
tkanek, pod red. S. Stokłosowej, Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa 2004; 254-255.
11. Hasse-Cieślińska M. Flukonazol w leczeniu powierzchownych
zakażeń grzybiczych. Zakażenia 2008; 6: 35-41.
12. Hjertstedt J, Hahn BL, Kos WL i wsp. Comparison of fungal
viability assays using Candida albicans yeast cells undergoing prolonged incubation in the absence of nutrients. Mycoses
1998; 41: 487-492.
13. Koshlukova SE, Araujo MWB, Baev D i wsp. Released ATP is an
Extracellular Cytotoxic Mediator in Salivary Histatin 5-Induced
Killing of Candida albicans. Infect Immun 2000; 68: 6848-6856.
14. Lupetti A, Danesi R, Campa M i wsp. Molecular basis of resistance to azole antifungals. Trends Mol Med 2002; 8: 76-81.
15. McCullough MJ, Ross BC, Reade PC. Candida albicans: a review of its history, taxonomy, epidemiology, virulence attributes,
and methods of strain differentation. Int J Oral Maxillofac Surg
1996; 25: 136-144.
16. Reboli AC, Rotstein C, Pappas PG i wsp. Anidulafungina w po-
D. Trzaska, M. Kocot i Z.P. Czuba
równaniu z flukonazolem w leczeniu inwazyjnej kandydozy. N
Engl J Med 2007; 356: 2472-2482.
17. Tomczak H. Zakażenia grzybicze w laryngologii – problemy
związane z diagnostyką i leczeniem. Post chir głowy i szyi 2008;
2: 51-57.
18. Wacińska-Drabińska M, Gajdzik-Plutecka D, Olczak-Kowalczyk
D. Grzybica jamy ustnej, diagnostyka i leczenie. Nowa stom
2009; 3: 74-81.
19. Yamashoji S, Asakawa A, Kawasaki S i wsp. Chemiluminescent
assay for detection of viable microorganisms. Anal Biochem
2004; 15: 303-308.
Adres do korespondencji:
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach.
41-808 Zabrze, ul. Henryka Jordana 19
e-mail: [email protected]
tel: 509-538-335
Zaakceptowano do publikacji: 27.04.2011
175