Cytochemiczna lokalizacja i właściwości wybranych enzymów

Cytochemiczna lokalizacja i właściwości wybranych enzymów nukleolitycznych
STRESZCZENIE
W
artykule przedstawiono w sposób syntetyczny wyniki badań dotyczących lokalizacji
i właściwości wybranych enzymów nukleolitycznych, wykonanych pod kierunkiem
Davida Shugara w latach 1957–1986. Ustalono histochemiczną lokalizację szeregu enzymów
nukleolitycznych w tkankach roślin i zwierząt, dokonując syntezy swoistych substratów,
estrów alfa-naftylowych 5’- oraz 3’- fosforanów nukleozydów i ich pochodnych. W tkankach
szczura stwierdzono występowanie fosfodwuesterazy I w błonie plazmatycznej, natomiast
fosfodwuesterazy II w lizosomach, wskazujące na ich funkcje. Zbadano lokalizację rybonukleazy typu trzustkowego ssaków, wykazując jej rolę w trawieniu zewnątrzkomórkowym.
Ustalono lokalizację pirofosfatazy nukleotydowej w tkankach roślin, wyodrębniono ją do
stanu niemal homogenności i zbadano jej właściwości oraz swoistość substratową. Stosując ten enzym do usuwania 5’-pirofosforanu 7-metyloguanidyny z kapu eukariotycznych
mRNA wykazano rolę kapu w wiązaniu się mRNA z rybosomami w procesie translacji. Ponadto, wyodrębniono z ziemniaka fosfodwuesterazę cyklicznych nukleotydów i ustalono jej
właściwości fizykochemiczne, oligomeryczną budowę oraz swoistość substratową.
WPROWADZENIE
Halina Sierakowska
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul
Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa; e-mail:
[email protected]

Artykuł otrzymano 8 lipca 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 27 lipca 2015 r.
Słowa kluczowe: cytochemiczna lokalizacja
nukleaz, fosfodwuesteraza I, fosfodwuesteraza II, fosfodwuesteraza cyklicznych nukleotydów, pirofosfataza nukleotydowa, rybonukleazy ssaków
Opisując wkład profesora Davida Shugara w badania lokalizacji i właściwości
enzymów nukleolitycznych warto wspomnieć o genezie i sposobie tworzenia się
zespołu zajmującego się wraz z nim tą tematyką. Profesor Shugar jest badaczem
z powołania, więc cieszyła go praca z ludźmi, zwłaszcza młodymi, których udawało mu się zainteresować pracą badawczą. Czasem nawiązywał więc współpracę z pozbawionymi kierownictwa naukowego osobami, mimo ich odmiennej
specjalizacji i niewielkich jeszcze kwalifikacji. W konsekwencji prowadziło to do
pewnej różnorodności zespołów, które zorganizował i którymi kierował. Przykładem tego jest Jego zainteresowanie się badaniami nad enzymami nukleolitycznymi. Zaczęło się to w latach 50. XX w., kiedy profesor Shugar zajmował się
szkoleniem w zakresie stosowania izotopów promieniotwórczych w badaniach
biologicznych. Jedną z niezagospodarowanych tematycznie osób była wówczas
Halina Sierakowska, o przygotowaniu histologicznym. Był to okres rozwoju
badań nad histo- i cytologiczną lokalizacją enzymów metodami wizualizacji
produktów ich działania w preparatach tkankowych. Profesor Shugar zaproponował wówczas włączenie do tych metod znakowanych pierwiastków promieniotwórczych, celem uzyskania dzięki autoradiografii bardziej ilościowych wyników niż te uzyskiwane wyłącznie za pomocą oceny mikroskopowej produktu
reakcji enzymatycznej w tkance. Prace te dotyczyły fosfatazy alkalicznej [1,2].
Większość zespołu profesora Shugara zajmowała się wówczas badaniami nad
strukturą i właściwościami polinukleotydów. Był to w nauce także okres badań
nad specyficznymi enzymami uczestniczącymi w ich hydrolizie. Stąd też zainteresowanie się nimi przez zespół Shugara i pomysł podjęcia prób ich lokalizacji.
ENZYMY NUKLEOLITYCZNE I ICH WŁAŚCIWOŚCI
Początkowo opracowano metodę histochemicznej lokalizacji specyficznych
enzymów hydrolitycznych działających na polinukleotydy (RNazy, DNazy,
itp.) za pomocą włączania ich substratów (RNA, DNA, kwas poliadenylowy, oligoguanylowy, itp.) do błon substratowych kontaktujących się z preparatem histologicznym, a następnie śledzenia lokalizacji enzymu hydrolizującego substrat
na podstawie zmiany w wybarwieniu błony. Uzyskane wyniki [3] miały jednak
stosunkowo ograniczoną specyficzność i zdolność rozdzielczą, wobec czego zespół zajął się opracowaniem znacznie czulszych i bardziej specyficznych metod
lokalizacji enzymów poprzez chemiczną syntezę nowych specyficznych substratów. Podjęcie tych prac było możliwe dzięki rozwinięciu w owym czasie przez
Davida Shugara, we współpracy z Włodzimierzem Szerem, chemicznej syntezy
nukleotydów i ich pochodnych. Dzięki pomocy i technikom ustawionym przez
ten zespół, mała grupa H. Sierakowskiej, wówczas o przygotowaniu biologiczPostępy Biochemii 61 (3) 2015
253
nym, mogła podjąć się syntezy estrów naftylowych różnych
nukleotydów.
Uwolnioną w trakcie reakcji enzymatycznej grupę naftylową sprzęgano z solami dwuazoniowymi, uzyskując
nierozpuszczalny barwny osad obrazujący lokalizację enzymu. Prace te zostały uwieńczone sukcesem i umożliwiły
lokalizację szeregu enzymów nukleolitycznych. Były to jak
na owe czasy wyniki awangardowe i zostały włączone do
materiału podręcznikowego z dziedziny histochemii [4];
dopiero później zostały zastąpione technikami immunohistochemicznymi.
Ester naftylowy 5’-fosforanu tymidyny okazał się specyficznym substratem dla fosfodwuesterazy I zwierząt i
umożliwił histochemiczne zlokalizowanie tego enzymu w
tkankach szczura, a w szczególności na powierzchniach komórek uczestniczących w procesach absorpcji oraz wydzielaniu substancji surowiczych [5,6]. Wyniki te uzupełniono
za pomocą różnicowego frakcjonowania komórek wątroby
szczura, prowadzonych wespół z Marią Erecińską; wykazały one występowanie tego enzymu w błonie plazmatycznej.
Jednocześnie zlokalizowano fosfodwuesterazę II w lizosomach, co wskazuje na jej aktywność w procesach trawienia
wewnątrzkomórkowego [7].
Dla uzyskania specyficznych substratów dla RNaz bakteryjnych typu T1 oraz T2 i rybonukleaz zwierzęcych zsyntetyzowano szereg 3’-naftylofosforanów nukleozydów,
służących do kolorymetrycznych oznaczeń aktywności
tych enzymów oraz szereg 5’-podstawionych pochodnych
naftylofosforanu 3’-urydyny, umożliwiających histochemiczną lokalizację RNazy trzustkowej w tkankach ssaków
[8-11]. Stwierdzono, że enzym ten koncentruje się w części
wierzchołkowej cytoplazmy komórek surowiczych pęcherzyków wydzielniczych i w świetle przewodów trzustki i
ślinianek [12]. Naftylofosforan 3’-urydyny jest odporny na
rybonukleazy z wątroby i śledziony, co pozwoliło odróżnić rybonukleazy typu trzustkowego, o funkcji trawienia
zewnątrzkomórkowego, od pozostałych kwaso- i termostabilnych rybonukleaz alkalicznych o funkcjach wewnątrzkomórkowych [13].
Powyższe wyniki stanowiły punkt wyjścia dla wyodrębniania we współpracy z Alicją Bardoń kwaso- i termostabilnych rybonukleaz człowieka i ich charakterystyki pod
względem specyficzności, właściwości fizykochemicznych i
heterogenności narządowej, a także możliwości zastosowania w diagnostyce [14,15].
Zsyntetyzowane związki wykorzystano także w badaniach swoistości nukleaz roślin. Stwierdzono, że nukleaza
z fasoli złocistej hydrolizuje estry 3’-fosforanów rybonukleozydów do nukleozydów i estrów kwasu fosforowego,
co stanowi cechę unikalną wśród fosfodwuesteraz [16].
Pozwoliły one także na wyodrębnienie pirofosfatazy nukleotydowej z ziemniaka do stanu niemal homogenności i
ustalenie jej właściwości i swoistości substratowej [17-19].
Użycie bardzo skutecznego substratu, AS-BI-5’-naftylofosforanu tymidyny pozwoliło na lokalizację tej pirofosfatazy
w tkankach roślin wyższych [20] oraz w procesie kiełkowania pszenicy [21].
254
Zdolność pirofosfatazy nukleotydowej do hydrolizy
wiazań pirofosforanowych przy braku aktywności wobec
wiązań międzynukleotydowych typu 3’-5’ umożliwiła jej
zastosowanie do usuwania fosforanu 7-metyloguanidyny z
kapu eukariotycznych mRNA. Badania te były użyteczne w
poznaniu mechanizmów translacji. Współpracując z grupą
Witolda Filipowicza wykazano, że usunięcie 5’-pirofosforanu 7- metyloguanidyny z mRNA reowirusa, globiny królika
oraz Artemia salina powoduje niemal całkowitą utratę zdolności tych mRNA do ulegania translacji w bezkomórkowym układzie biosyntezy białka poprzez utratę zdolności
wiązania się z rybosomami [22].
Mimo zaobserwowanych podobieństw w aktywnościach
roślinnej pirofosfatazy nukleotydowej i fosfodwuesterazy
cyklicznych nukleotydów wobec szeregu naturalnych oraz
zsyntetyzowanych przez nas substratów udało się wyodrębnić 8000-krotnie oczyszczony preparat cyklicznej fosfodwuesterazy z ziemniaka, co umożliwiło zbadanie jego właściwości fizykochemicznych, oligomerycznej struktury oraz
aktywności substratowej [23,24].
Publikacje cytochemicznej grupy Davida Shugara, w
tym także prace przeglądowe [25,26], były wielokrotnie
cytowane w literaturze naukowej. Grupa wykształciła czterech doktorów (Halina Sierakowska /później dr hab. i prof.
nadzw./, Małgorzata Zan-Kowalczewska, Ryszard Kole,
Marcjanna Bartkiewicz) oraz kilkoro magistrów. Grupa
działała do 1985 r., kiedy uległa rozpadowi wskutek wyjazdu zagranicę jej członków. Prowadzili oni jednak nadal
przez wiele lat prace badawcze zagranicą.
Ryszard Kole, obecnie profesor emeritus na University
of North Carolina w Chapel Hill, jest czynnym badaczem
w Sarepta Therapeutics, Cambridge, MA. Marcjanna Bartkiewicz pracowała w Yale University, między innymi w
pracowni laureata nagrody Nobla Sidneya Altmana. Małgorzata Zan-Kowalczewska kontynuowała współpracę z D.
Shugarem i W. Filipowiczem, a później jako Magda Zan-Phillips była związana z School of Pharmacy, University
of Connecticut. Halina Sierakowska współpracowała z Włodzimierzem Szerem w New York University, a następnie z
Ryszardem Kole w University of North Carolina. Obecnie
niemal wszyscy wymienieni badacze są już emerytami,
a profesor Shugar, który zaszczepił w nich pasję badacza,
kończy 100 lat i nadal jest aktywny.
PIŚMIENNICTWO
1. Shugar D, Szenberg A, Sierakowska H (1957) Quantitative histochemistry by means of radioactive indicators. Exp Cell Res 13: 424-426
2. Shugar D, Sierakowska H, Szenberg A (1958) Quantitative staining
with radioactive indicators: alkaline phosphatase. Acta Biochim Polon
5: 27-41
3. Sierakowska H, Shugar D (1961) Gross histochemical localization of
tissue nuclease enzymes. Acta Biochim Polon 8: 427-436
4. Pearse AGE. Histochemistry, theoretical and applied. Little, Brown
and Co. Boston 1968
5. Sierakowska H, Szemplinska H, Shugar D (1963) Intracellular localization of phosphodiesterase by a cytochemical method. Acta Biochim
Polon 10: 399-411
www.postepybiochemii.pl
6. Sierakowska H, Shugar D (1963) Cytochemical localization of phosphodiesterase by azo-dye simultaneous coupling method. Biochem
Biophys Res Commun 11: 70-74
7. Erecinska M, Sierakowska H, Shugar D (1969) Intracellular localization of phosphodiesterase I and phosphodiesterase II in rat liver. Eur
J Biochem 11: 465-471
8. Kole R, Sierakowska H (1971) Alpha-naphthyl 3’-phosphate analogues for the cytochemical and colorimetric assay of RNases. Acta Biochim Polon 18: 187-197
9. Kole R, Sierakowska H, Shugar D (1971) An RNase substrate resistant
to phosphodiesterase II, 5’-0-benzyluridine-3’-alpha naphthyl phosphate. Biochem Biophys Res Commun 44: 1482-1487
10.Kole R, Sierakowska H, Shugar D (1972) A specific colorimetric and
cytochemical substrate for RNase T-2:adenosine 3’-alpha naphtyl phosphate. Biochim Biophys Acta 289: 323-330
11.Sierakowska H, Shugar D (1971) Phosphodiesterase II activity against
nucleoside 3’-phosphate esters and some 5’-0 substituted analogues
and an improved RNase substrate, alpha naphthyl-5-0-methyl uridine 3’-phosphate esters and some 5’-O substituted analogues and an
improved RNase substrate, alpha naphtyl-5’-O-methyl uridine 3’-phosphate. Acta Biochim Polon 18: 143-152
12.Zan-Kowalczewska M, Sierakowska H, Shugar D (1966) Synthesis of
uridine 3’-naphthyl phosphate and cytochemical localization of ribonulcease by the azo-dye coupling technique. Acta Biochim Polon 13:
237-250
13.Zan-Kowalczewska M, Sierakowska H, Bardon A, Shugar D (1974)
Specificities of rat alkaline RNases and cytochemical localization of
pancreatic-like RNases. Biochim Biophys Acta 341: 138-156
14.Bardoń A, Sierakowska H, Shugar D (1976) Human pancreatic type
RNase with activity against double stranded RNA. Biochim Biophys
Acta 438: 461-473
15.Bardoń A, Sierakowska H, Shugar D (1976) Purification and properties
of human acid thermostable RNases and diagnosis of childhood pancreatic fibrosis. Clin Chim Acta 67: 231-243
17.Kole R, Sierakowska H, Shugar D (1976) Novel activity of potato nucleotide pyrophosphatase. Biochim Biophys Acta 438: 540-550
18.Bartkiewicz M, Sierakowska H, Shugar D (1984) Nucleotide pyrophosphatase from potato tubers: purification and properties. Eur J Biochem 142: 419-426
19.Bartkiewicz M, Grzybowska E, Sierakowska H, Shugar D (1985) Reassociable dimer subunit of potato nucleotide pyrophosphatase: specificity and stability. Biochim Biophys Acta 830: 313-319
20.Sierakowska H, Gahan PB, Dawson AL (1978) The cytochemical localization of nucleotide pyrophosphatase activity in plant tissues using
naphthyl esters of thymidine 5’-phosphate. Histochem J 10: 679-694
21.Gahan PB, Sierakowska H, Dawson AL (1979) Nucleotide pyrophosphatase activity in dry and germinated seeds of Triticum and its relationship to general acid phosphatase activity. Planta (Berl) 145: 159-166
22.Zan-Kowalczewska M, Bretner M, Sierakowska H, Szczesna E, Filipowicz W, Shatkin AJ (1977) Removal of 5’-terminal m7G from eukaryotic mRNAs by potato nucleotide pyrophosphatase and its effect on
translation. Nucleic Acids Res 4: 3065-3081
23.Zan-Kowalczewska M, Bartkiewicz M, Sierakowska H, Shugar D
(1984) Purification and resolution of potato tuber cyclic nucleotide
phosphodiesterase from nucleotide pyrophosphatase. Biochim Biophys Acta 788: 62-73
24.Zan-Kowalczewska M, Ciesla JM, Sierakowska H, Shugar D (1987) Potato tuber cyclic nucleotide phosphodiesterase: selective inactivation
of activity vs. nucleoside cyclic 3’:5’-phosphates and properties of the
native and selectively inactivated enzyme. Biochemistry 26: 1194-1200
25.Shugar D, Sierakowska H (1967) “Mammalian nucleolytic enzymes
and their localization” w Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Davidson JN, Cohn WE (red) Vol. 7, Academic Press,
New York, str. 369-427
26.Sierakowska H, Shugar D (1977) Mammalian nucleolytic enzymes w
Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Cohen WE
(red) Vol. 20, Academic Press, New York, str. 59-130
16.Kole R, Sierakowska H, Shugar D (1974) Mung bean nuclease, mode
of action and specificity vs synthetic esters of 3’-nucleotides. Nucl Acid
Res 1: 369-706
Cytochemical localization and properties of selected nucleolytic enzymes
Halina Sierakowska
Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 5A Pawińskiego St., 02-106 Warsaw, Poland

e-mail: [email protected]
Key words: cyclic nucleotide phosphodiesterase, mammalian ribonucleases, nuclease localization, phosphodiesterase I, phosphodiesterase II,
nucleotide pyrophosphatase
ABSTRACT
In the article there are shortly outlined studies on cytochemical localization of selected nucleolytic enzymes carried out between 1957–1986 by
David Shugar and his coworkers. The histochemical localization of several nucleolytic enzymes in animal and plant tissues was determined
by synthesis of specific substrates, alpha-naphthyl esters of 5’- and 3’-nucleotides and their derivatives. In rat tissues phosphodiesterase I
was localized in the plasma membrane whereas phosphodiesterase II in the lizosomes, reflecting their physiological roles. The localization of
pancreatic type ribonuclease in animal tissues was determined, indicating its role in extracellular digestion. Plant nucleotide pyrophosphatase
was localized in several tissues, purified to near homogeneity from potato tubers and its properties and substrate specificity were determined. Application of this enzyme for removal of m7GMP from the “cap” of eukaryotic mRNA allowed to elucidate the role of “cap” in mRNA
binding to ribosomes in the process of translation. Furthermore, cyclic nucleotide phosphodiesterase was isolated from potato tubers and its
physicochemical properties, oligomeric structure and substrate specificity were elucidated.
Postępy Biochemii 61 (2)
(3) 2015
255