Plakat - Wydział Chemii UW

Katarzyna Laszczka
Badanie specyficzności połączeń selenu, arsenu i antymonu
z białkami surowicy krwi metodą HPLC ICP-MS
Cele pracy magisterskiej:
Pracownia Teoretycznych Podstaw Chemii Analitycznej
9Wyboru kolumny chromatograficznej i warunków rozdzielania białek;
9Optymalizacji procesu rozdzielania białek surowicy krwi;
Promotor: prof. dr hab. Ewa Bulska
9Przygotowanie próbki modelowej zawierającej białka i pierwiastki w ilościach odpowiadających stężeniom w surowicy krwi;
9Oznaczenie wybranych pierwiastków w próbce modelowej i materiale referencyjnym (w obecności matrycy białkowej);
Opiekun: dr Marcin Wojciechowski
9Określenie specyficzności połączeń Se, Sb i As z wybranymi białkami przez nałożenie widma pierwiastkowego na chromatogram rozdzielonych białek.
Surowica krwi jako próbka chemiczna:
Oznaczanie selenu, arsenu i antymonu metodą ICP-MS
Surowica krwi
posiada odczyn lekko zasadowy
(pH=7,2-7,6) i stanowi około 50% krwi pełnej. Głównym jej
składnikiem jest woda (ok. 90%), która zapewnia
utrzymanie objętości i ciśnienia krwi, zaopatruje komórki
całego organizmu w wodę jak również transportuje
pozostałe składniki w surowicy. W większej ilości surowica
krwi zawiera kilka rodzajów białek, między innymi albuminy
i globuliny, a wśród nich transferynę. Białka te pełnią
istotną rolę w utrzymaniu ciśnienia osmotycznego i
równowagi pH. Nie należy zapominać również o jonach
nieorganicznych – to one utrzymują równowagę
osmotyczną, oraz pełnią różnego rodzaju funkcje
biologiczne. Pozostałe składniki surowicy to mieszanina
węglowodanów, lipidów, enzymów, przeciwciał, soli i
rozpuszczonych gazów.
Po usunięciu elementów komórkowych krwi
pełnej,
tzn.
czerwonych
krwinek
(erytrocytów), białych krwinek (leukocytów) i
płytek krwi otrzymujemy osocze. Aby uniknąć
wykrzepiania
osocze
musi
zawierać
antykoagulant stosowny do planowanych
badań. W skład osocza wchodzi natomiast
surowica i fibryna. Surowica krwi jest
produktem powstałym w wyniku oddzielania
„skrzepu” krwi pełnej od pozostałej fazy
płynnej. Surowica różni się od osocza brakiem
fibrynogenu
oraz
obecnością
szeregu
czynników zużywanych w procesie tworzenia
włóknika.
Optymalizacja rozdzielania białek surowicy krwi:
Białka występujące w surowicy krwi są do siebie bardzo podobne: mają zbliżone ciężary cząsteczkowe, podobne właściwości fizyczne i chemiczne, co
powoduje, że bardzo trudno je rozdzielić. W rutynowych badaniach klinicznych stosuje się rozdział elektroforetyczny jak również metody
chromatograficzne. Natomiast w celach naukowych, gdy chodzi wyłącznie o białka występujące w przeważającej większości stosuje się chromatografię
powinowactwa lub anionowymienną, gdyż większość białek występuje w postaci anionów w surowicy.
Kolumna: anionowymienna kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowej Cosmogel DEAE;
Eluenty: A: bufor Tris-HCl, B: bufor Tris-HCl + octan amonu
Eluent A [%]
100 - 0
0
gdzie X= 4,6,8 lub 10 min
Eluent B [%]
0 - 100
100
¾stężenie octanu amonu (200mmol/l, 400mmol/l i 600mmol/l)
Zależność czasu retencji białek od stężenia octanu amonu
min gradient)
(8
Optymalne warunki rozdzielenia:
12
¾Czas narastania gradientu octanu amonu: 8 min.
10
8
6
4
2
trans feryna
0
400
600
Rozpylacz
Współosiowy
Palnik plazmowy
Kwarcowy
Częstotliwość pracy generatora
40 MHz
Rozdzielczość sygnałów mas
0,7 ± 0,1 j.m.a.
Moc generatora plazmy
1150W
Przepływ gazu plazmowego
15,00 L/min
Przepływ gazu pomocniczego
1,0 L/min
Przepływ gazu rozpylającego
0,88 L/min
Czas zatrzymania
100 msek
78Se
0,639
2,13
Liczba przemiatań
5
80Se
3,978
13,26
Liczba powtórzeń
3
82Se
0,579
1,93
Granica
Granica
Stężenie
Oznaczan wykrywalnośc oznaczalnośc
w
e izotopy
i [ppb]
i [ppb]
surowicy
3*SD
10*SD
krwi [ppb]
Szybkość dozowania próbki
1 mL/min
75As
0,132
0,44
Mierzone izotopy
78Se, 80Se, 82Se, 75As,
121Sb
0,006
0,02
123Sb
0,024
0,08
121Sb, 123Sb
8-270
Ok.. 1
0,07-0,76
globuliny
Chromatogram rozdzielonych białek
absorbancja
¾czas narastania gradientu octanu amonu (4min, 6min, 8min i
10 min)
Zależnosć czasu retencji od czasu narastania
gradientu octanu amonu
10
8
transf eryna
6
albuminy
4
globuliny
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
10 min
czas narastania gradientu octanu amonu [min]
2
4
Ostatnim etapem badań jest połączenie HPLC z ICP-MS.
Pik albuminy
Pik globulin i
transferyny
0
2
8 min
Wyznaczono granice wykrywalności i oznaczalności dla Se, As i Sb. Przy tak bogatej matrycy białkowej oraz 10krotnym rozcieńczeniu próbek wymaganym dla kolumny chromatograficznej nie jest możliwe oznaczenie
rzeczywistego stężenia tych pierwiastków. Powoduje to konieczność dodania do próbek odpowiednich ilości tych
pierwiastków.
album iny
stężenie octanu amonu [mmol/l]
6 min
Opis
Kwarcowa typu Scotta
Do rozdzielenia chromatograficznego białek wybrano najlepsze warunki: stężenie buforu Tris-HCl 50 mmol/l,
stężenie octanu amonu 400 mmol/l, czas narastania gradientu octanu amonu równy 8 min.
¾Stężenie buforu Tris-HCl: 50mmol/l
¾Stężenie octanu amonu: 400mmol/l
16
14
4 min
Parametr
Komora mgielna
Wnioski końcowe:
Optymalizacja warunków rozdzielania:
200
Parametry pomiarowe ICP-MS:
Matryca białkowa nie pozwala na oznaczenie Sb i As w próbkach rozcieńczonych surowicy krwi.
¾stężenia buforu Tris-HCl (25mmol/l i 50mmol/l);
czasretencji [min]
Czas [min]
0-X
X - 15
czas retencji [min]
Elucja gradientowa:
pH =7,4
Z uwagi na fakt, że selen, arsen i antymon to
pierwiastki śladowe, jako metodę detekcji wybrano
ICP MS
Określenie specyficzności połączeń Se, As i Sb z białkami surowicy krwi
pozwoli na:
6
8
czas retencji [min]
10
12
14
9Określenie obiegu pierwiastków i ich metabolizmu w żywych organizmach ;
9Wyjaśnienie i zrozumienie toksyczności tych pierwiastków dzięki uzyskaniu informacji o ich sposobie transportu;