Streszczenie pracy

Joanna Filipowska
Streszczenie
Kości stanowią istotną barierę mechaniczną, chroniącą miękkie tkanki
organizmu, ale w szczególności odbierają różnego rodzaju bodźce mechaniczne, regulujące
przebudowę układu szkieletowego. Proces przebudowy kości (inaczej obrót kostny) zachodzi
w warunkach fizjologicznych oraz w wyniku regeneracji mikro- i makro-uszkodzeń kości,
a jego zaburzenia (tj. niedostateczna albo nadmierna resorpcja lub kościotworzenie)
wywierają negatywne efekty na zdrowie całego organizmu. Leczenie znacznych ubytków
kostnych
lub
chorób
zwyrodnieniowych
kości
(np.
osteoporozy),
objawiających
się nieprawidłowym przebiegiem obrotu kostnego, stanowi poważne wyzwanie dla
współczesnej medycyny. Poza klasycznym sposobem terapii ubytków kostnych, na drodze
przeszczepów auto- lub allogenicznych, liczne alternatywne rozwiązania w tym zakresie są
obecnie opracowywane w oparciu o inżynierię tkanki kostnej. W strategii tej, odpowiednie
prekursory osteoblastów stymuluje się in vitro do kościotworzenia m.in. poprzez hodowle
na określonych typach biomateriałów 3D (rusztowania), w obecności wybranych czynników
kościotwórczych,
w
połączeniu
ze
stymulacją
mechaniczną
w
bioreaktorach.
Najpowszechniejszym źródłem prekursorów osteoblastów, o znaczącym potencjale
w zakresie inżynierii tkanki kostnej są mezenchymalne komórki macierzyste pochodzenia
szpikowego (tzw. BMSC).
Celem prezentowanej rozprawy doktorskiej było zbadanie mechanizmów
kościotworzenia in vitro ludzkich komórek BMSC na wybranych rusztowaniach, różniących
się składem chemicznym i bioaktywnością (rusztowania oparte o strukturę polimerów: PLGA
i PU) oraz dokonanie analizy efektów stymulacji mechanicznej komórek hBMSC
w bioreaktorze perfuzyjnym, w hodowlach 3D prowadzonych na wspomnianych typach
rusztowań.
Realizacja
omawianego
projektu
miała
na
celu
wyselekcjonowanie
i optymalizację warunków hodowli ludzkich komórek BMSC in vitro, najbardziej
sprzyjających ich różnicowaniu w kierunku tkanki kostnej.
Eksperymenty
przeprowadzono
na
wspomnianych
typach
rusztowań
w warunkach statycznych i pod wpływem stymulacji mechanicznej perfuzyjnym przepływem
pożywki hodowlanej. Komórki hodowano w pożywce standardowej lub w obecności
suplementów indukujących kościotworzenie, np. AA-2P, DEX, BGP i rhBMP-2.
Wykazano bioaktywność rusztowań kompozytowych S2-PLGA i A2-PLGA
(formowanie warstw apatytowych, zawierających fosforan wapnia) wewnątrz rusztowań.
1
Scharakteryzowano
również
właściwości
mechaniczne
obu
rodzajów
rusztowań
kompozytowych i wykazano, że oba materiały efektywniej, niż niezmodyfikowany
kopolimer PLGA promowały adhezję komórek BMSC do ich powierzchni, jak również
ekspresję znaczników procesu kościotworzenia komórek BMSC. Zaobserwowano istotne
różnice w odpowiedzi komórek na rusztowania kompozytowe, w zależności od składu
chemicznego rusztowań i warunków hodowli. W porównaniu do rusztowań kompozytowych
S2-PLGA, o wysokiej zawartości krzemionki, rusztowania A2-PLGA, o wysokiej zawartości
tlenku
wapnia,
w
mniejszym
stopniu
odpowiadały
na
traktowanie
rhBMP-2
lub deksametazonem (DEX), a właściwości osteoindukcyjne tych rusztowań zależały
częściowo od ich zdolności do uruchamiania ścieżki BMP-2, w komórkach nietraktowanych
suplementami kościotwórczymi. Otrzymane rusztowania kompozytowe, w szczególności
S2-PLGA, również promowały odpowiedź kościotwórczą komórek hBMSC w warunkach
stymulacji 2-godzinnym, stałym przepływem perfuzyjnym o prędkości 2,5 ml/min.
w obecności rhBMP-2. Komórki hodowano także na bioobojętnych, porowatych
rusztowaniach poliuretanowych (PU), pokrytych żelatyną, w obecności suplementów
kościotwórczych i stymulowano pojedynczą sesją perfuzyjnego przepływu pożywki,
na wczesnym lub późnym etapie hodowli 3D. Część komórek traktowano suplementami
indukującymi kościotworzenie w monowarstwie (hodowle 2D) w celu przyspieszenia
ich
różnicowania,
następnie
stymulowano
perfuzją
w
warunkach
3D.
Zamierzano w ten sposób zbadać efekty perfuzji w zależności od stanu zróżnicowania
komórek. Zaobserwowano, że pojedyncza, krótka stymulacja perfuzją może istotnie
wzmocnić ekspresję czynników transkrypcyjnych i wzrostowych, odpowiedzialnych
za indukcję kościotworzenia oraz
produkcję kolagenu i
mineralizację macierzy
pozakomórkowej, ale jest bardziej efektywna, gdy komórki osiągają w hodowli stadium
różnicujących osteoblastów.
W oparciu o otrzymane wyniki można wnioskować, że odpowiedź kościotwórcza
populacji komórek hBMSC w badanych warunkach 3D może być modulowana w zależności
od chemizmu powierzchni rusztowań (rusztowania bioobojętne vs bioaktywne o różnej
zawartości CaO i SiO2), traktowania komórek (pożywka bez suplementów kościotwórczych
vs suplementowana; hodowle statyczne vs. dynamiczne, stymulowane przepływem
perfuzyjnym) i stanu ich zróżnicowania (niezróżnicowane prekursory osteoblastów
vs różnicujące osteoblasty). Wiedza uzyskana na podstawie realizacji prezentowanego
projektu może potencjalnie przyczynić się do opracowania nowych strategii leczenia
ubytków kostnych, w oparciu o inżynierię tkanki kostnej, możliwych do stosowania
w praktyce klinicznej.
2