„Identyfikacja i charakterystyka dwuczłonowego regionu oriC

„Identyfikacja i charakterystyka dwuczłonowego regionu oriC
Helicobacter pylori”
Streszczenie rozprawy doktorskiej
Replikacja chromosomalnego DNA jest istotnym procesem, który zachodzi w każdej
komórce przed jej podziałem. Replikacja jest kontrolowana głównie na początkowym etapie
(inicjacji), tak aby powielenie materiału genetycznego komórki miało miejsce tylko raz
w trakcie cyklu komórkowego1. Podczas inicjacji replikacji w komórkach bakteryjnych białko
inicjatorowe DnaA oddziałuje ze specyficznymi sekwencjami (tzw. boksami DnaA), które
znajdują się w regionie inicjacji replikacji (oriC – origin of chromosomal replication).
W wyniku tych oddziaływań białko DnaA tworzy aktywny kompleks inicjacyjny (orisom),
zdolny do rozplecenia podwójnej helisy DNA w obrębie regionu o obniżonej stabilności
heliakalnej tzw. DUE (DNA unwinding element). Proces inicjacji replikacji u bakterii został
najlepiej poznany na przykładzie Escherichia coli. Do niedawna uważano, że model inicjacji
stworzony w oparciu o badania nad E. coli jest wspólny dla większości bakterii. Ostatnie
odkrycia pokazały, że ogólne zasady procesu są rzeczywiście uniwersalne, jednak pomiędzy
gatunkami istnieją istotne różnice dotyczące aktywności białka DnaA, struktury regionu oriC
i kompleksu inicjacyjnego oraz obecności innych białek, które mogą wchodzić w skład
orisomu lub regulować kolejne etapy procesu inicjacji replikacji chromosomu2.
Mechanizm inicjacji replikacji u Helicobacter pylori od kilkunastu lat jest
przedmiotem badań prowadzonych w Laboratorium Biologii Molekularnej Mikroorganizmów
(IITD PAN, Wrocław)3,4,5,6. OriC H. pylori, zawierający pięć boksów DnaA, został
zlokalizowany w regionie 5’ genu dnaA; scharakteryzowano oddziaływania DnaA
z poszczególnymi boksami DnaA oraz z całym regionem oriC. Wykazano również, że białko
1
Katayama T. et al. (2010) Regulation of the replication cycle: conserved and diverse regulatory systems for
DnaA and oriC. Nat. Rev. Microbiol. 8 (3): 163–70
2
Zakrzewska-Czerwińska J. et al. (2007) Regulation of the initiation of chromosomal replication in bacteria.
FEMS Microbiol. Rev. 31 (4): 378–87
3
Zawilak A. et al. (2001) Identification of a putative chromosomal replication origin from Helicobacter pylori
and its interaction with the initiator protein DnaA. Nucleic Acids Res. 29 (11): 2251–59
4
Zawilak A. et al. (2003) DNA binding specificity of the replication initiator protein, DnaA from Helicobacter
pylori. J. Mol. Biol. 334 (5): 933–47
5
Zawilak-Pawlik A. et al. (2007) HobA - a novel protein involved in initiation of chromosomal replication in
Helicobacter pylori. Mol. Micro. 65 (4): 979–94
6
Zawilak-Pawlik A. et al. (2011) DiaA/HobA and DnaA: a pair of proteins co-evolved to cooperate during
bacterial orisome assembly. J. Mol. Biol. 408 (2): 238–51
HobA, oddziałujące z N-końcem białka DnaA, znacząco wzmacnia wiązanie DnaA do
regionu oriC. Udowodniono, że HobA jest homologiem funkcjonalnym białka DiaA, które
z kolei jest regulatorem inicjacji replikacji u E. coli. Pomimo wielu prób nie udało się
wykazać, że w obrębie wyznaczonej sekwencji oriC dochodzi do otwarcia podwójnej helisy
DNA. Tym samym brakowało kluczowego dowodu, świadczącego o tym, że ten region jest
rzeczywiście miejscem inicjacji replikacji chromosomu H. pylori.
Celem
projektu
doktorskiego
była
analiza
funkcjonalna
oriC
H.
pylori,
a w szczególności lokalizacja regionu DUE i charakterystyka tworzenia kompleksu
inicjacyjnego umożliwiającego rozplatanie DNA w regionie inicjacji replikacji chromosomu
H. pylori.
Stosując szereg metod in vitro oraz in vivo wykazano, że do otwarcia podwójnej helisy
DNA w wyniku wiązania białka DnaA dochodzi w przewidzianym in silico regionie 3’ genu
dnaA (oriC2), a nie w poprzednio wytypowanym regionie oriC (nazwa zmieniona na oriC1)
(Rys. 1). Udowodniono, że białko DnaA wiąże się do regionu oriC2 pomiędzy genem dnaA
a regionem DUE i, co zaskakujące, oddziaływanie to jest regulowane przez topologię DNA.
W przeciwieństwie do organizmów eukariotycznych i archeonów, u bakterii nie wykazano do
tej pory zależności pomiędzy powinowactwem białka inicjatorowego do regionu inicjacji
a topologią tego regionu. Białko DnaA w pierwszej kolejności oddziałuje z superskręconym
regionem oriC2, a następnie z regionem oriC1 w wyniku czego dochodzi do utworzenia
struktury pętli (Rys. 1). Udowodniono, że oriC2 ulega rozpleceniu w wyniku oddziaływania
z białkiem DnaA nawet przy braku oriC1, jednak skutkuje to znacznym zmniejszeniem oczka
replikacyjnego i spadkiem liczby rozplecionych cząsteczek. Wykazany wpływ obecności
oriC1 na rozplatanie DNA sugeruje, że tworzenie pętli pomiędzy regionami oriC1 i oriC2 jest
istotne dla prawidłowego przebiegu procesu inicjacji replikacji. Udowodniono ponadto, że
oba podregiony oriC są wiązane przez białko DnaA in vivo oraz, że oba są konieczne dla
zajścia procesu inicjacji w komórkach H. pylori. W oparciu o te wyniki stwierdzono, że
region oriC H. pylori ma strukturę dwuczłonową, co jest pierwszym przykładem takiej
budowy regionu inicjacji replikacji chromosomu u bakterii Gram-ujemnych7.
W wyniku dalszych badań zidentyfikowano miejsca wiązania białka DnaA w regionie
oriC2: trzy boksy DnaA (c6, ts1 i ts2), z czego dwa okazały się być wiązane przez białko
DnaA tylko wtedy, gdy DNA było negatywnie superskręcone (Rys. 1). Z kolei wszystkie
pozostałe boksy DnaA w dwuczłonowym regionie oriC, w tym boksy w regionie oriC1, były
7
Donczew R. et al. (2012) Helicobacter pylori oriC - the first bipartite origin of chromosome replication in Gramnegative bacteria. Nucleic Acids Res. 40 (19): 9647–60
2
wiązane przez DnaA bez względu na topologię DNA. Wykazano, że wszystkie trzy boksy
w regionie oriC2 są istotne dla poprawnego formowania orisomu i rozplatania DNA, ale
poszczególnym boksom można przypisać różne funkcje w procesie tworzenia orisomu i/lub
rozplatania DNA. Boks c6 jest głównie zaangażowany w oddziaływania dalekiego zasięgu
z regionem oriC1, a boksy wrażliwe na topologię (ts1 i ts2) są kluczowe dla rozplatania DNA
przez białko DnaA. Obserwację tę można rozszerzyć na cały region oriC, który
prawdopodobnie podzielony jest na część odpowiedzialną przede wszystkim za otwarcie
podwójnej helisy DNA i część pełniącą funkcje regulatorowe i/lub związaną z ładowaniem
helikazy DnaB.
Przedstawione wyniki badań pokazały, że tworzenie orisomu zdolnego do rozplatania
podwójnej helisy DNA w dwuczłonowym oriC H. pylori jest procesem uporządkowanym
i hierarchicznym. Jego przebieg jest zależny od budowy regionu oriC: rozkładu boksów
DnaA i różnic w powinowactwie, z jakim poszczególne boksy są wiązane przez białko DnaA.
Na podstawie wyników uzyskanych w rozprawie doktorskiej oraz danych literaturowych
zaproponowano model inicjacji replikacji chromosomalnego DNA u H. pylori (Rysunek 1)8.
Rysunek 1. Model inicjacji replikacji chromosomu u H. pylori w oparciu o Donczew i wsp., 2014 (cyt. 8).
Region oriC1 był zidentyfikowany w trakcie wcześniejszych prac jako region inicjacji replikacji chromosomu H.
pylori (cyt. 3-6). Położenie regionu DUE i dwuczłonowa struktura oriC, jak również wpływ dwuczłonowej
struktury oriC i topologii DNA na oddziaływanie DnaA z obydwoma podregionami oriC zostały opisane
w Donczew i wsp., 2012 oraz Donczew i wsp., 2014 (cyt. 7, 8).
8
Donczew R. et al. (2014) Assembly of Helicobacter pylori initiation complex is determined by sequencespecific and topology-sensitive DnaA-oriC interactions. J. Mol. Biol. doi: 10.1016/j.jmb.2014.05.018
3
Oryginalne wyniki badań uzyskanych w ramach projektu doktorskiego zostały
opublikowane w czasopismach Nucleic Acids Research i Journal of Molecular Biology7,8.
Identyfikacja zależnego od superskręcenia DNA oddziaływania DnaA z oriC2 była
pierwszym dowodem na to, że topologia DNA może bezpośrednio wpływać na oddziaływania
pomiędzy białkiem inicjatorowym a regionem inicjacji replikacji chromosomu u bakterii.
Rolę lokalnej i globalnej topologii DNA, konformacji i metylacji DNA w regulacji procesu
inicjacji replikacji chromosomów bakterii opisano w przeglądowej pracy opublikowanej
w czasopiśmie Journal of Molecular Biology9.
9
Donczew R. et al. (2014) Beyond DnaA: the role of DNA topology and DNA methylation in bacterial replication
initiation. J. Mol. Biol. 426 (12): 2269-82
4