białka - MALDI ToF

Komentarze

Transkrypt

białka - MALDI ToF
Proteiny (bia ka)
sekwencjonowanie
Sk ad chemiczny bia ek
• Liniowe a cuchy tworzone przez reaguj ce
ze sob L-aminokwasy
– Szkielet
• Identyczny
• trans-peptydowe (amidowe) wi zania
– Mniej napr%&e sterycznych
– 1000-krotnie korzystniejsze w stosunku do cis
– )a cuchy boczne
a cuch polipeptydowy
szkielet polipeptydu
Przedstawienie
schematyczne
SEKWENCJA
AMINOKWASÓW
niepolarna
grupa boczna
polarna grupa boczna
glicyna
Wi zanie
peptydowe
formowanie wi%zania
peptydowego z
usuni&ciem wody
O
C
N
H
wi%zanie peptydowe mi&dzy
glicyna a alanin%
alanina
woda
Powstawanie wi zania peptydowego
szkielet polipeptydu
*a'cuchy boczne
N ko'cowa cz&()
bia*ka- z grup%
aminow%
C ko'cowa cz&()
bia*ka z grup%
karboksylow%
wi%zanie
peptydowe
wi%zanie
peptydowe
Aminkwasy i Stereochemia
• Na C s 4 ró&ne podstawniki:
– )a cuch boczny (specyficzny dla
poszczególnych aminokwasów)
– Grupa aminowa
– Grupa karboksylowa
R
– Proton
-Carbon
H
C
CO2H
NH2
• Podstawniki mog przyj 4 dwie
konfiguracje wokó tetraedrycznego w%gla
Budowa aminokwasów
grupa
aminowa
w&giel
grupa
karboksylowa
*a'cuch boczny
forma niezjonizowana
forma zjonizowana
jon obojnaczy
Klasyfikacja popularnych
Aminokwasów
• )a cuch boczny (R) ró&ni si% polarno7ci :
– Hydrofilowy
• Oboj%tny polarny
– Stosunkowo dobrze rozpuszczalne w wodzie
• Obdarzony adunkiem
– kwasowy
– zasadowy
– Hydrofobowy
• Raczej nierozpuszczalne w wodzie
• Sk onne do samoasocjacji
-Carbon
H
R
C
NH2
CO2H
Aminokwasy polarne i niepolarne
aminokwas
a cuch boczny
aminokwas
a cuch boczny
na adowane ujemnie
na adowane dodatnio
niepolarne =
hydrofobowe
bez adunku, polarne
AMINOKWASY POLARNE
AMINOKWASY NIEPOLARNE
4 poziomy struktury bia ek
• I-rz%dowa (Primary)
– > 200 kJ/mol
• II-rz%dowa (Secondary)
– 10 kJ/mol
• III-rz%dowa (Tertiary)
– < 5 kJ/mol
• IV-rz%dowa (Quaternary) – tylko oligomery
(wi%cej ni& 1 ancuch)
Struktura bia ek
• Pierwszorz%dowa
– kolejno74 aminokwasów w a cuchu
• N - koniec (start, umownie)
• C- koniec (zako czenie)
• Drugorz%dowa
– Fragmenty a cucha z o&one w regularnej konformacji
• -helisa
• -arkusz (harmonijka)
• Inne struktury: - lub powrotne skr%ty, p%tle omega, k %bek
-Helisa
• Kszta t cylindra
• Stabilizowana wi zaniami wodorowymi
mi%dzy grup C=O i-tej reszty i protonem
amidowym reszty i+3
• Zwykle 10 -15 reszt aminokwasowych i 3-4
zwoje
– Ka&dy zwój
• zawiera 3.6 reszt aminokwasowych
• D ugo74 ok. 5.41 Å
• Tworz j aminokwasy z rozbudowanymi a cuchami bocznymi
• Hydrofilowe i hydrofobowe aminokwasy znajduj si% na
przeciwleg ych powierzchniach cylindra
-arkusz
• Struktura harmonijkowa (arkusza)
• Sk ada si% z 2-6 nici (3-10 aminokwasów
ka&da) stabilizowanych wi zaniami wodorowymi
– Równolegle u o&enie nici
– Antyrównoleg e (bardziej powszechne)
• Zawiera aminokwasy z rozga %zionym w%glem
– np., izoleucyna, treonina, alanina, glicyna
• W ókna jedwabiu (poli Ala-Gly) (teoretycznie)
• Wysoka zawarto74 -arkuszy
• 400,000 Da
Struktura bia ek
• Trzeciorz%dowa
– Kszta t przestrzenny
• Czwartorz%dowa
– W bia kach
zamieraj cych kilka
a cuchów
– np.: hemoglobina
(tetramer)
Mi%dzymolekularne oddzia ywania stabilizujace
• Wi zania wodorowe (3 kcal/mol)
• Oddzia ywania elektrostatyczne - mi%dzy a cuchami
bocznymi obdarzonymi adunkiem
– Mostki solne
• Wi zania disiarczkowe
2 S-H = S-S + 2H+
• Oddzia ywania hydrofobowe (3-5 kcal/mol; udzia entropii)
Bia ka - przyk ady
Protein
MW
5,733
Number of
Residues
51
Number of
Subunits
2
Insulin
(bovine)
Myoglobin
(horse)
Fatty acid
synthetase
(yeast)
Tobacco
mosaic virus
16,890
153
1
2,300,000
20,000
21
40,000,000
336,500
2,130
Bia ka – ró&norodne funkcje
Bia ka globularne (rozp.)
Enzymy
Funkcja, przyk ad
Biochemiczne katalizatory
Antycia a
System immunologiczny
Hormony bia kowe
Stymulatory, przekaSniki
Bia ka transportuj ce
i magazynuj ce
Hemoglobina, ferrytyna
Bia ka w ókniste (nierozp.)
Strukturalna konstrukcja
(kolagen, keratyna)
W'óknisty Kolagen nierozpuszczalny
• Left-hand single helix, 3
residues/turn
• 1/3 Gly, 1/5 Pro or Hyp
• Triplet Gly-X-Pro (or Gly-XHyp) repeats
• Supertwisted coiled coil is
right-handed, made of 3
left-handed -chains
18
Globularna struktura
rozpuszczalnego bia'ka
Rozpuszczalno74 bia ek
• Zmienna
– Zale&y od równowagi
hydrofilowo/hydrofobowej powierzchni bia ka
( a cuchy boczne aminokwasów)
• Zale&y of pH 7rodowiska
– Ni&sza rozpuszczalno74 w okolicach pI
• Bia ka zwierz%ce: pI w zakresie 5.5-6.0
• Bia ka ro7linne/bakterii: pI w zakresie 4.5-5.0
pI
• pH, w którym bia ko ma sumaryczny
adunek równy zeru
• Bia ka s s abo rozpuszczalne w pH
zbli&onym do pI
Rozpuszczalno74 bia ek
• Dodatek surfaktanta poprawia rozpuszczalno74
– Powstaj micele
• Np., sodium dodecyl sulfate (SDS) lub Triton-X
(niejonowy)
– Etanol / aceton mog rozpu7ci4 lub wytr ci4 bia ko
– Wady: trzeba oczyszcza4; mo&liwa denaturacja
Absorpcja UV przez bia ka
• 3 aromatyczne aminokwasy ( -
*
chromofory)
– tyrozyna
– tryptofan
– fenyloalanina
H2N
COOH
COOH
H2N
COOH
H2N
NH
HO
Phenylalanine
Tyrosine
(257) =0.2E3
(274) =1.4E3
Tryptophan
(280) =5.6E3
Absorpcja promieniowania UV
przez bia ka
Amino Acid
max,
nm
x 10-3 at max,
M-1 cm-1
5.6
Tryptophan
280
Tyrosine
274
1.4
Tyrosinate
295
2.6
Phenylalanine
257
0.2
NB: pKa tyrosine 9.5
Absorpcja UV przez bia ka
Kofaktory
• Dinukleotyd flawinoadeninowy (FADH)
• Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH)
• Hem – ugrupowanie prostetyczne (niebia kowa
cz%74) wielu enzymów
Kofaktory - Absorpcja UV Vis
• Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH)
NADH (
NAD+ (
260=14
x 103 M-1 cm-1 ;
3
-1
-1
260=18 x 10 M cm )
340=6.2
x 103 M-1 cm-1)
• UV Vis
– Hem (
Kofaktory
5 M-1 cm-1)
=10
400
Uk ady
delokalizowanych
elektronów
Cyt c
• Funkcja:
Bia ko redoks bierze
udzia w oddychaniu
komórki i apoptozie
• Struktura:
bia ko z grup hemu
– MW 12,384 (horse)
408
Widmo UV-vis 10 XM
Cytochromu c
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
360
Absorbance (AU)
0.3
0.2
528
• Dwa pasma:
– Pasmo Soreta
– Pasmo Q
0.1
0
350
400
350
400
450
500
550
600
Wavelength (nm)
414
300
1
520
0.4
0.2
550
0.6
316
– Intensywno74 i
po o&enie pasm zale&ne
od procesów redoks
Absorbance (AU)
0.8
0
300
450
500
550
600
Wavelength (nm)
Metody Spektroskopowe analizy
bia ek
Method
Information Provided
IR
secondary structure
Raman
secondary structure, folding
CD
secondary structure
NMR
tertiary structure, folding
UV
concentration, specific activity
Fluorescence
concentration
Dichroizm Ko owy
Circular Dichroism (CD)
• Informacje o strukturze drugorz%dowej
• Bazuje na ró&nicy w absorbancji 7wiat a polaryzowanego ko owo prawoskr%tnie
i lewoskr%tniet przez chromofory
Fluorescencja
Dinukleotyd flawinoadeninowy
• Naturalne fluorofory
FADH
NH 2
Me
N
NH
N
N
– Aromatyczne
aminokwasy
– Kofaktory
• FADH
• NADH
O
Me
O
N
N
R
R
R S
HO
O
HO
OH
HO
P
O
P
O
O
N
N
O
OH
R
O
S
OH
S
OH
Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy
NADH
NH2
O
N
N
N
OH O
O
N
O
P
O
R R
RS
HO
OH
P
O
OO HO
+
N
R R
SR
NH2
O
OH
Naturalne Fluorofory
Amino Acid
Note:
em,
nm
F
Trp
348
0.20
Tyr
303
0.10
Phe
282
0.04
is the quantum yield; think of this as analogous to in UV-vis spectroscopy
Sondy Fluorescencyjne
O
Probe
Reagent
Point of
Attachment
Dansyl
chloride
Lys, Cys
em,
nm
510
O
F
S
Cl
0.10
N(CH3)2
NCS
Fluorescein
isothiocyanate
(FITC)
Lys
516
0.30
Note: extensively delocalized -systems
COOH
OH
O
O
Bia ka - bogactwo
• E. coli - 1000 ró&nych protein
• Ca kowita liczba bia ek > 1010
Proteom
PROTEin complement of the genOME
bia kowe dope nienie genomu
Ca"o#$ bia"ek obecnych w komórce (organizmie)
podczas kompletnego cyklu %yciowego
Zale no
pomi dzy genomem a proteomem
>200
potranslacyjnych
modyfikacji
Transkrypcja
DNA
Dojrzewanie
RNA
Translacja
mRNA
Bia ko
Splicing
Redagowanie
Alternatywna
poliadenylacja
Genomika
Transkryptomika
• aktywno/0
katalityczna
• oddzia ywanie
• stabilno/0
• czas 1ycia
• lokalizacja
Proteomika
Metabolomika
Wielko/0 genomu oraz proteomu
Organizm
Wielko/0 genomu
(zasady)
Szacowana
ilo/0 genów
Cz*owiek (Homo sapiens)
3 mld
30 000
Mysz (M. musculus)
2,6 mld
30 000
Rzodkiewnik (A. thaliana)
100 mln
25 000
Nicie' (C. elegans)
97 mln
19 000
Muszka owocowa (D. melanogaster)
137 mln
13 000
DroEdEe (S. cerevisiae)
12,1 mln
6 000
Bakteria (E. coli)
4,6 mln
3 200
Wirus (HIV)
9700
9
Organizacja proteomu cz owieka
• oko o 1x1014 komórek
• 250 typów komórek
• szacowana ilo/0 bia ek 25 000 - 30 000
• 8 000 - 10 000 ró1nych bia ek w komórce
• od kilku do kilku milionów kopii danego bia ka w
komórce (wi:kszo/0 bia ek w komórce to bia ka
konstytutywne wyst:puj ce w ponad 10 000 kopii)
• Kilkadziesi t - kilkaset bia ek specyficznych dla danego
typu komórki lub tkanki
• brak liniowej zale1no/ci pomi:dzy ilo/ci mRNA a
proteomem
Proteomika
• Proteomika
obejmuje
systematyczn%
analiz& bia*ek wyst&puj%cych w komórce,
tkance lub ca*ym organizmie.
• G*ównym celem proteomiki jest jako(ciowy
oraz ilo(ciowy opis bia*ek wyst&puj%cych w
komórkach lub tkankach.
Zastosowania proteomiki
• Poznanie funkcjonowania proteomu
• Badanie modyfikacji potranslacyjnch
• Poznanie szlaków przekazywania sygna*ów
• Zrozumienie molekularnych przyczyn chorób
• Projektowanie nowych leków
• Terapie „personalne”
Proteomika - narz:dzia
Rozdzielanie bia*ek (elektroforeza, chromatografia)
Identyfikacja bia*ek (spektrometria masowa)
Ilo(ciowe pomiary bia*ek (spektrometria masowa,
chromatografia)
Analiza sekwencji bia*ka (bioinformatyka)
Proteomika strukturalna (krystalografia i spektroskopia
NMR)
Proteomika interakcyjna
Badanie modyfikacji bia*ek (modyfikacje posttranslacyjne)
Proteomika komórkowa
Oddzia*ywania bia*ko-bia*ko
Lokalizacja bia*ka w komórce
Modyikacje posttranslacyjne
Oddzia*ywania bia*ko-DNA/RNA
42
Proteomika kliniczna
Oznaczanie biomarkerów w surowicy, osoczu, /linie i innych
p ynach ustrojowych lub tkankach:
- u*atwia wczesne wykrycie choroby
- umoEliwia przewidywanie reakcji pacjenta na terapi& (terapia
personalna)
43
Referencyjne zawarto/ci 70 protein (bioanalitów) w osoczu krwi
PSA
Anderson, N. L. (2003)
Mol. Cell. Proteomics 2: 50
Przygotowanie próbki bia ka do
sekwencjonowania
1. Metody
chemiczne
2. Spektrometria
mas
Sekwencjonowanie
poszczególnych
frakcji HPLC
Strategies for protein sequence analysis
Protein / Protein complex
2D GE
SDS-PAGE/IEF
Proteolytic digestion
In-gel digestion
LC-MS/MS
HPLC peptide mapping
MALDI TOF MS
Edman degradation
47
Masa
Analiza ekstraktu bia kowego z ludzkiej w troby
metod dwukierunkowej elektroorezy 1elowej
Ekstrakcja
Proteoliza
Separacja
Identyfikacja
Punkt izoelektryczny
Enzymes for Proteome Research
Trypsin
K-X and R-X except when X = P
Endoprotease Lys-C
K-X except when X = P
Endoprotease Arg-C
R-X except when X = P
Endoprotease Asp-N
X-D
Endoprotease Glu-C
E-X except when X = P
Chymotrypsin
X-L, X-F, X-Y and X-W
Cyanogen Bromide
X-M
K – lizyna
R – arginina P – prolina
D – kwas asparaginowy
L – leucyna Y – tyrozyna W – tryptoan E – kwas glutaminowy
F – fenyloalanina
M - metionina
7.5e8
7.0e8
-Kazeina produkty
trawienia
Chromatogram
produktów
trawienia bia ka
6.5e8
6.0e8
5.5e8
Intensity (cps)
5.0e8
4.5e8
4.0e8
3.5e8
3.0e8
2.5e8
2.0e8
1.5e8
1.0e8
5.0e7
0.0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52
Time, min
SEKWENCJONOWANIE
Sekwencjonowanie peptydu metod/ Edmana
RóEnice w metodach sekwencjonowania
Degradacja Edmana (chemiczna)
Edman degradation chemically
removes amino acids from the
amino terminus of a peptide
one at a time and determines the
sequence from the N-terminus
of the peptide.
Mass spectrometry
mass spectrometric methods match
the masses of fragmented peptides
with the calculated masses from
fragments of proteins in the DNAProtein sequence database.
mass
ABCDEFGH----
mass
GHIK
Analyze PTH-amino acid derivatives
> ~ 2 pmol of protein
ABCDEF
mass
LMNPQR
Search the match in the databases
(peptide mass fingerprinting)
5~50 fmol of protein (LC-MS/MS)
56
Spektrometria mas
Technika analityczna polegaj ca na destrukcyjnej jonizacji
badanej substancji a nast%pnie, analizie utworzonych
produktów ze wzgl%du na ich mas% i adunek.
M:
M.+ + e
PODSTAWY
Cztery etapy zwi zane z eksperymentem spektrometrii mas:
1.
generowanie cz)steczek w fazie gazowej z próbki (ciecz, roztwór, c. sta"e, itd.)
2.
jonizacja tych cz)steczek
3.
rozdzielanie jonów na podstawie ich masy
4.
detekcja strumienia jonów
Z uwagi na rozwi zania etapu 1 spotyka si% ró&ne techniki MS: (LC-MS, GC-MS,
SIMS, MALDI-TOF, itd.)
Rozró&nia si% ró&ne typy aparatury MS z uwagi na rozwi zania etapu 2 i etapu 3.
Etap 4 jest z regu y wspólny dla wi%kszo7ci spektrometrów mas – nie ma zasadniczych
ró&nic.
Otrzymywanie jonów - metody desorpcyjno jonizacyjne
Nowe techniki – analiza trudnolotnych substancji: polimery,
biocz steczki (proteiny, kwasy nukleinowe)
• Elektrorozpylanie
Electrospray Ionization (ESI)
• Desorpcja laserem w obecno#ci matrycy Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization (MALDI)
Eksperyment identyfikacji bia'ka
metod/ MS Fingerprint
Separated Proteins
Enzymatic Digestion
and Extraction
Peptide Mass Fingerprint
MALDI-TOF
Database Search
Protein
Identification
Peptide Mass Fingerprint - procedura
• Izolacja bia ka
• Enzymatyczne trawienie w okre7lonych pozycjach
aminokwasów
• MALDI-TOF analiza powsta ych polipeptydów
• Lista mas polipeptydów – na podstawie widma
MALDI-TOF
• Przeszukiwanie bazy danych w celu odnalezienia
bia ka z identyczn fragmentacj “peptide mass
fingerprint”
Peptide Mass Fingerprint
Cut out
2D-Gel
Spot
Peptide Mass Fingerprint
Trypsin or/and
chymotrypsin
Digest
Peptide Mass Fingerprint
MALDI TOF
MS
KGHHEAELKPLAQSHATK
GLSDGEWQQVLNVWGK
GHHEAELKPLAQSHATK
YLEFISDAIIHVLHSK
VEADIAGHGQEVLIR
HPGDFGADAQGAMTK
HGTVVLTALGGILK
LFTGHPETLEK
ALELFR
Peptide Mass Fingerprint (myoglobin)
Peptide Masses
1811.90
1606.85
1271.66
1378.83
1982.05
1853.95
1884.01
1502.66
748.43
GLSDGEWQQVLNVWGK
VEADIAGHGQEVLIR
LFTGHPETLEK
HGTVVLTALGGILK
KGHHEAELKPLAQSHATK
GHHEAELKPLAQSHATK
YLEFISDAIIHVLHSK
HPGDFGADAQGAMTK
ALELFR
Protein Sequence
• Myoglobin
GLSDGEWQQV
IAGHGQEVLI
EKFDKFKHLK
LKKHGTVVLT
HHEAELKPLA
IKYLEFISDA
GDFGADAQGA
DIAAKYKELG
LNVWGKVEAD
RLFTGHPETL
TEAEMKASED
ALGGILKKKG
QSHATKHKIP
IIHVLHSKHP
MTKALELFRN
FQG
Micro-Sequencing by Tandem Mass
Spectrometry (MS/MS)
• Analizowany jon jest wybierany w pierwszym
segmencie MS
• Jonizacja CID (Collision Induced Dissociation) jest
stosowana do fragmentacji wybranego jonu w
pu apce jonowej (zwykle kolizja z atomami Argonu
(FAB))
• Drugi segment MS rejestruje jony po fragmentacji
• Fragmentatacja polipeptydów zachodzi wzd u&
a cucha na wi zaniu peptydowego: odcinane s
kolejne skrajne aminokwasy, zarówno z ko ca N jak i
C (kierunki N->C i C->N).
Potrójny
kwadrupol
(Triple
Quad)
Triple Quadrupole
Mass
Analyzer
Sample Inlet
Q2
(Collision cell)
Ion Guide
Q1
Q3
EM
Detector
Q-TOF Mass Analyzer
MCP
Detector
Sample Inlet
Pusher
Q2
(Collision cell)
Ion Guide
Q1
TOF
Reflectron
Hexapole
•Wybór jonu w Q1 (Product Scan)
•Fragmentacja Q2
•Analiza widma TOF
Peptide Fragmentation
Collision Induced Dissociation
H+
H...-HN-CH-CO
Ri-1
. . . NH-CH-CO-NH-CH-CO-…OH
Ri
Prefix Fragment
Ri+1
Suffix Fragment
S#: 1708 RT: 54.47 AV: 1 NL: 5.27E6
T: + c d Full m s2 638.00 [ 165.00 - 1925.00]
850.3
100
95
687.3
90
588.1
80
75
70
65
Relative Abundance
• Peptides tend to fragment along the
backbone.
• Fragments can also loose neutral
chemical groups like NH3 and H2O.
85
60
55
851.4
425.0
50
45
949.4
40
326.0
35
524.9
30
25
20
589.2
226.9
1048.6
397.1
1049.6
489.1
15
10
629.0
5
0
200
400
600
800
1000
m /z
1200
1400
1600
1800
2000
N- and C-terminal Peptides
486
71
415
Reconstruct peptide from the set of masses of fragment ions
301
(mass-spectrum)
185
154
332
57
429
N- and C-terminal Peptides
486
71
154
57
Nte
rm
s
lp
ep
tid
e
in
a
lp
301
Cte
rm
ina
ep
tid
es
415
185
332
429
Terminal peptides and ion types
Peptide
Mass (D)
Peptide
Mass (D)
57 + 97 + 147 + 114 = 415
without
57 + 97 + 147 + 114 – 18 = 397
N- and C-terminal Peptides
486
71
154
57
Nte
rm
s
lp
ep
tid
e
in
a
lp
301
Cte
rm
ina
ep
tid
es
415
185
332
429
Tandem Mass Spectrometry in an Ion Trap
Relative Abundance
100
2) Izolacja jonu: np. m/z 426.7 ± 1.5
1) Widmo wyj/ciowe
426.7
852.3
426.7
50
700.2
1138.7
300
900
m/z
1500
4) Pomiar m/z fragmentów
2000
3) Kolizja i fragmentacja
[For Peptide SLNVALR]
SLNVAL
R
SLNVA
LR
SLNV
ALR
SLN
VALR
SL
NVALR
S
LNVALR
Fragmentation of
426.7
a-ion
b-ion
c-ion
R1
R2
-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-
x-ion
y-ion
z-ion
77
Sequence Nomenclature for Mass
Ladder
a1
O
H 2N
+H
b1 c1 a2 b2 c2 a3 b3 c2
H
C
O
H
N
C
H
C
C
O
H
N
R2
R1
x1
H
C
O
H
N
C
CH
R3
C
OH
R4
y1 z1 x2 y2 z2 x3 y3
z2
1598
723
529
401
Q
G
586
965
1166
852
H
E
L
S
1052
N
E
1424
1295
E
R
Protein Sample
Protease
digestion
Peptides
First Stage Mass Spectrum
Peptides
eluted
from LC
300
2200
m/z
Selected Precursor
mass and fragments
Protein Sequence
GDVEKGKKIFVQK
CAQCHTVEKGGK
HKTGPNLHGLFG
RKTGQAPGFTYT
DANKNKGITWKE
ETLMEYLENPKKY
IPGTKMIFAGIKKK
TEREDLIAYLKKAT
NE
TGPNLHGLFGR
Peptides of
precursors
molecular weight
fragmented
GR FGR
R
75
GFGR
etc
TGPNLHGFGR
2000
m/z
Second Stage (fragmentation) Mass Spectrum
7.5e8
-Kazeina produkty trawienia
7.0e8
6.5e8
6.0e8
5.5e8
Intensity (cps)
5.0e8
4.5e8
4.0e8
3.5e8
3.0e8
2.5e8
2.0e8
1.5e8
1.0e8
5.0e7
0.0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52
Courtesy of the MSCLS at the Univ. of Minn.
Time, min
1029.2
2100
Widmo MS piku – tR = 30 min
1900
Intensity, cps
1700
1500
1300
1100
900
700
500
300
100
400
500
600
700
800
m/z, amu
900
1000
1100
1200
MSMS jonu 1031.3 –sekwencjonowanie
3.4e6
a1
I
F
Q
pS
E
E
Q
Q
Q
T
E
D
E
Intensity, cps
3.0e6
2.6e6
2.2e6
1.8e6
y8
y2
b2
1.4e6
y3
1.0e6 y1-NH3 b2-NH3
y3-NH3
6.0e5
y1
a1-NH3 a2-NH3
2.0e5 b1-NH3 y2-NH3
y6
y4
y5
b5
y7
y7-NH3
b3
b3-NH3
y5-NH3
b6
b4-NH3 a5 y6-NH3
y4-NH3 b4
y9
y10
y10-NH3
y9-NH3
b7
b8
y8-NH3b8-NH3b9-NH3
y11
y11-NH3
y12
y12-NH3
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500
m/z, amu
Courtesy of the MSCLS at the Univ. of Minn.
Sekwencjonowanie bia'ek technik/ MS/MS –
dwie metody znajdowania sekwencji
# Metoda przeszukiwania baz y danych fragmentów
peptydowych
# Metoda De Novo
De Novo vs. Database Search
S # : 1 7 0 8 R T : 5 4 .4 7 AV: 1 N L : 5 .2 7 E 6
T : + c d F u l l m s 2 6 3 8 .0 0 [ 1 6 5 .0 0 - 1 9 2 5 .0 0 ]
95
6 8 7 .3
90
De Novo
85
5 8 8 .1
80
75
70
65
Re lative Abund ance
Database
Search
8 5 0 .3
1 00
60
55
8 5 1 .4
4 2 5 .0
50
45
9 4 9 .4
40
3 2 6 .0
35
5 2 4 .9
30
25
20
5 8 9 .2
2 2 6 .9
1 0 4 8 .6
3 9 7 .1
1 0 4 9 .6
4 8 9 .1
15
10
6 2 9 .0
5
0
20 0
400
600
800
10 00
m /z
1200
1400
160 0
18 00
2000
Mass, Score
Database of
known peptides
MDERHILNM, KLQWVCSDL,
PTYWASDL, ENQIKRSACVM,
TLACHGGEM, NGALPQWRT,
HLLERTKMNVV, GGPASSDA,
GGLITGMQSD, MQPLMNWE,
ALKIIMNVRT,
ALKIIMNVRT,AVGELTK
AVGELTK, ,
HEWAILF, GHNLWAMNAC,
GVFGSVLRA, EKLNKAATYIN..
W
n
Database of all peptides =
R 20
V
A
L
A
L
T
AAAAAAAA,AAAAAAAC,AAAAAAAD,AAAAAAAE,
G
G
AAAAAAAG,AAAAAAAF,AAAAAAAH,AAAAAAI,
E
C
L
P
K
K
W
AVGELTI, AVGELTK
, AVGELTL, AVGELTM,
D
T
YYYYYYYS,YYYYYYYT,YYYYYYYV,YYYYYYYY
AVGELTK
De novo Peptide Sequencing
S#: 1708 RT: 54.47 AV: 1 NL: 5.27E6
T: + c d Full ms2 638.00 [ 165.00 - 1925.00]
850.3
100
95
687.3
90
85
588.1
80
75
70
Relative Abundance
65
60
55
851.4
425.0
50
45
949.4
40
326.0
35
524.9
30
25
20
589.2
226.9
1048.6
397.1
1049.6
489.1
15
10
629.0
5
0
200
400
600
800
1000
m/z
1200
1400
Sequence
1600
1800
2000

Podobne dokumenty