Plakat

Pracownia Stereokontrolowanej Syntezy Organicznej
Synteza 6-alkilowych analogów tioflawiny T
Kierownik pracy: dr hab. Rafał Siciński
Opiekun pracy: dr hab. Rafał Siciński
Bartłomiej Winek
1. Wstęp
Tioflawina T jest barwnikiem, który bardzo selektywnie łączy się z tzw. amyloidami - liniowo zagregowanymi
białkami za pomocą motywu międzymolekularnej ß-kartki. Kompleksy amyloid-tioflavina T wykazują charakterystyczną
fluorescencję ex. 450 nm/ em. 484 nm. Duże znaczenie bioanalityczne tego barwnika wynika z faktu, iż powstawanie
amyloidów jest podłożem molekularnym szeregu chorób neurodegeneracyjnych m. in. Alzheimera, Parkinsona,
Huntingtona, Creutzfeldta-Jakoba (choroba prionowa) i innych. W każdej z tych chorób włókna amyloidowe powstają z
innego, nie spokrewnionego z pozostałymi genetycznie bądź strukturalnie, białka prekursora. Mimo tego amyloidy
różnych białek przyłączają tioflavinę T (Rysunek 1), co prowadzi do silnej fluorescencji barwnika. M. in. dzięki temu
odkryciu poczyniono wielkie kroki w rozwoju diagnostyki klinicznej chorób tego typu. Po raz pierwszy określenia
amyloid użył w 1853 roku niemiecki patolog Rudolf Virchow, który zaobserwował nagromadzanie się w chorych
tkankach substancji podobnej do skrobi. Jak się później okazało jest to białko składające się z 39-43 aminokwasów i
będące produktem częściowej proteolizy większego białka – APP – prekursora amyloidu kodowanego u człowieka na
chromosomie 21.
NH2
2. Próby syntezy analogów tioflawiny T
Z analizy danych literaturowych dotyczących otrzymywania benzotiazoli stwierdziłem, że mam możliwość wyboru kilku
dróg syntezy analogów tioflawiny T. Ze względu na ilość etapów prowadzących do produktu, jak i na podawane w literaturze
wydajności poszczególnych procesów, wybrałem dwie drogi, które wyglądały najbardziej obiecująco (Schemat 1).
NH2
N
S
R
R
6
Związkiem wyjściowym w kolejnej syntezie (Schemat 3) była również p-butyloanilina (1), którą poddałem reakcji
z rodankiem amonu i roztworem bromu w kwasie octowym. W wyniku tego procesu otrzymałem 2-amino-6-butylobenzotiazol (2). Kolejnym etapem syntezy było usunięcie grupy aminowej z wykorzystaniem reakcji diazowania i redukcji
utworzonej soli diazoniowej przy pomocy kwasu podfosforawego H3PO2. Otrzymany w ten sposób 6-butylo-benzotiazol
(7) poddałem reakcji bromowania w pozycji 2. W tym celu wygenerowałem sól litową związku 7 działając na niego nbutylolitem, a następnie na powstały anion podziałałem CBr4. W wyniku tej reakcji otrzymałem 2-bromo-6-butylobenzotiazol (8), który jest dogodnym substratem do syntezy różnych pochodnych tioflawiny T.
Następnym etapem syntezy jest reakcja Suzuki, polegająca na katalizowanym palladem sprzęgnięciu 2-bromo6-butylo-benzotiazolu (8) z kwasem aryloboronowym. Kwasy aryloboronowe są dość łatwe do otrzymania, a wiele tych
związków jest już handlowo dostępnych, tak więc dzięki tej reakcji istnieje możliwość zsyntetyzowania analogów
tioflawiny T (9) różniących się rodzajem pierścienia aromatycznego Ar, połączonego z częścią benzotiazolową
cząsteczki (podstawnik przy C-2). Końcowym etapem syntezy jest reakcja metylowania 9 w celu otrzymania związku 10,
posiadającego ugrupowanie czwartorzędowej soli amoniowej w pierścieniu tiazolowym. W przypadku, gdy pierścień
arylowy przy C-2 również posiada grupy aminowe (np. dimetyloaminową NMe2), alkilowanie może zajść na obu centrach
i wówczas należy prowadzić reakcję metylowania w niskich temperaturach, starannie kontrolując jej przebieg.
N
Br
S
R
NR2
(HO)2B
NR2
N
NH2
NR2
S
R
SO3H
S
5
3. Synteza 6-alkilowych analogów tioflawiny T
S
R
SH
HOOC
S
NH2
N
NH2
NH2
R
H2N
N
NH4SCN, Br2 (aq)
CH3COOH, 12 OC
1
2
Rys. 1 – Ilustracja przedstawiająca wiązanie się barwnika z β-pofałdowaną
struktórą amyloidu.
NaNO2
H3PO2
APP jest białkiem częściowo zakotwiczonym w błonie, w której jest zanurzona sekwencja peptydu betaamyloidu (AB). Aby peptyd AB mógł tworzyć złogi amyloidowe musi zostać wycięty z βAPP. Do tego celu służą
enzymy zwane sekretazami; dwa z nich: β-sekretaza i γ-sekretaza wycinają sekwencje AB z N-końca aminokwasu
powodując odkładanie się w komórkach peptydu AB w postaci blaszek.
Strukturę tioflawiny T i sposób jej łączenia się z amyloidem przedstawia Rysunek 2. Pokazany jest również
(Rysunek 3) przykład zastosowania tioflawiny T do oznaczania złogów amyloidowych.
NH2
S
H3PO4
-8 OC
CH3
+
N
N
NR2
S
R
Br
S
Schemat 1
N
DME, - 70 OC
S
8
Pierwsza próba otrzymania pochodnych tioflawiny T była związana z cyklem przemian przedstawionych na Schemacie 2.
NH2
n-BuLi, CBr4
1
N
Pd2(dba)3 , DME, H2O
Ar-B(OH)2
NH2
S
7
+
N
NH4SCN, Br2 (aq)
CH3COOH, 12 OC
H
Ar
K2CO3, 100 OC, 6h
S
2
9
Ar - :
50% KOH 6-8 h
5N AcOH
Rys. 2. Tioflawina T i diagram struktury β-amyloidu. (A) Struktura tioflawiny T. (B)
Schemat przedstawiający strukturę β-kartki. Zaznaczone są główne atomy (N, C i
Cα) oraz łańcuch boczny (R) jednego fragmentu cząsteczki. W amyloidzie nie
wykryto wiązań wodorowych, schemat ten jest prawidłowy zarówno dla
równoległych jak i antyrównoległych struktur β-kartki. Podwójną strzałką
zaznaczony jest kierunek wiązania się tioflawiny T z β-amyloidem. (C) Schemat
przedstawiający trzy β-kartki; β-włókna zaznaczone są zygzakowatymi liniami w
poprzek rysunku, łańcuchy boczne oznaczono jako czarne kulki wychodzące poza
płaszczyznę kartki. Molekuły barwnika zaznaczone są strzałkami.
MeI, I2
NH2
t. wrz.
200 OC, 1 h
O
N
S
NR2
HOOC
NH2
NR2
CF3
4
CH3
SK(H)
+
PPA, 220 OC, 4h
N
S
Ar
3
S
Schemat 2
Związkiem wyjściowym w syntezie była handlowo dostępna p-butyloanilina (1), którą poddałem reakcji z rodankiem amonu i
roztworem bromu w kwasie octowym. W wyniku tego procesu otrzymałem oczekiwany bicykliczny związek, 2-amino-6-butylobenzotiazol (2). Kolejnym etapem syntezy była reakcja rozerwania pierścienia benzotiazolowego poprzez reakcję z
roztworem wodorotlenku potasu. Etap ten sprawił największy problem, gdyż powstającym głównym produktem był związek
zawierający mostek siarczkowy (5) lub produkt utlenienia gupy tiolowej (6). Związki te powstawały również wtedy, gdy
prowadziłem reakcje z hydrazyną. Zakładając, że wśród kilku produktów reakcji z KOH powstaje również oczekiwany związek
3, poddałem nierozdzieloną mieszaninę produktów reakcji z kwasem p-N-dimetyloaminobenzoesowym w PPA. Powstające
związki nie udały się jednak rozdzielić, natomiast można było zaobserwować ich specyficzną fluorescencję pod światłem UV.
Po wielu nieudanych próbach musiałem porzucić ten cykl przemian i wypróbować kolejną metodę otrzymania pochodnych
tioflawiny T.
Rys. 3. Amyloid oznaczony tioflawiną T z biopsji nerkowej.
10
Schemat 3
4. Wnioski
Przedstawiony powyżej cykl przemian pozwala na zsyntetyzowanie z zadowalającą wydajnością szeregu
nieznanych dotąd pochodnych tioflawiny T, charakteryzujących się obecnością różnych podstawników w pierścieniach
benzenowych. Umożliwi to badania powinowactwa tak zmodyfikowanych związków do białek o strukturach
amyloidowych.