prezentacja wirusy

Usuwanie wirusów z
preparatów farmaceutycznych
metodą filtracji
Ilona Jakubowska
Joanna Łagód
Bezpieczeństwo preparatów biotechnologicznych i
osoczowych jest zapewnione przez złożoną produkcję i
pomiary kontroli jakości, na które składają się:
monitoring surowych materiałów (surowców),
walidacja procesu,
wdrażanie efektywnej technologii usuwania wirusów,
monitoring końcowego produktu na obecność wirusów.
Filtracja wirusów, która jest uważana za skuteczną
technologię oczyszczania, jest powszechnie stosowanym
etapem w wytwarzaniu materiału biologicznego.
Niektóre preparaty farmaceutyczne są produkowane
z użyciem komórek macierzystych ssaków i ludzkiego
osocza.
Ryzyko zanieczyszczenia znanymi lub nieznanymi
wirusami w tych produktach zostało udowodnione, dlatego
jednostki sprawujące kontrolę nakazały producentom ocenę
ę
ryzyka zanieczyszczeń pochodzenia wirusowego i podjęcie
niezbędnych kroków do zmniejszenia tego ryzyka.
Dodatkowo, żeby zapewnić czystość surowcom,
producenci są zachęcani do podjęcia kroków w procesie
oczyszczania, które zapewni ochronę przed endogennymi i
przypadkowymi wirusami.
-
Filtracja była z powodzeniem używana w licznych
procesach usuwania wirusów.
-
Do wprowadzenia skutecznej filtracji w trakcie procesu
produkcji musimy wziąć pod uwagę kilka punktów.
Można je zasadniczo sklasyfikować w trzy kategorie:
kontrola produkcji,
etapy procesu,
dobór odpowiedniego filtru.
Kontrola produkcji
Aby zapewnić bezpieczeństwo leków pochodzenia
biologicznego, należy przeprowadzać kontrolę na różnych
etapach procesu produkcyjnego.
Producenci biopreparatów powinni:
wybierać i badać surowce biologiczne na nieobecność
wirusów,
badać zdolność procesu produkcyjnego do usuwania lub
inaktywacji wirusów,
badać produkt na różnych poziomach procesu
produkcyjnego na nieobecność wykrywalnych wirusów.
Ustanowiono margines bezpieczeństwa, który
stwierdza, że proces jest efektywny i zapewnia
bezpieczneństwo produktu, gdy 106 opakowań zawiera mniej
niż jedną cząstkę wirusową.
Producent preparatu jest zobowiązany do określenia
skali zanieczyszczenia wirusowego.
FDA wymaga, aby przed rozpoczęciem pierwszej
fazy badań, producenci leków biotechnologicznych, którzy
używają tzw. mysich linii komórkowych,( np. CHO-komórek
jajnika chomika chińskiego) udowodnili, że w ciągu procesu
są usuwane mysie retrowirusy.
W Niemczech i we Francji dodatkowo
wymaga się oceny obecności parvowirusów.
Filtry oczyszczające z wirusów są
sklasyfikowane w dwie kategorie:
usuwające od 104-106 „dużych” wirusów ( są to
zazwyczaj endogenne retrowirusy o rozmiarach 80100 nm),
usuwające ponad 104 „małych” i „dużych” wirusów
(większych niż parvowirusy, 18-24 nm).
Etapy procesu
Pora na przyjrzenie się procesowi oczyszczania białek na
potencjalną skalę produkcyjną, aby być pewnym, że filtracja
wirusów jest wprowadzona w najlepszym etapie produkcji
-parvowirusy mają średnicę ok.18-26 nm, a typowe przeciwciało
monoklonalne typu IgG: 8-12 nm.
-aby osiągnąć ponad 104 retencję wirusów i ponad 99% odzysk
białek, „parvowirusowe” filtry muszą posiadać odpowiednią,
niewielką średnicę i rozkład porów
-filtry są wrażliwe na obecność zanieczyszczeń w dostarczanym
roztworze
Lokalizacja filtracji
Zasadniczo filtracja wirusowa może być wprowadzona
w każdym z kilku punktów produkcji.
Jak pokazuje rys. 1 (produkcja preparatu przeciwciał
monoklonalnych), filtracja wirusowa może być wprowadzona w
trzech punktach: po procesie inaktywacji wirusów w niskim pH,
po pośredniej chromatografii lub po ostatecznej chromatografii.
Ze względu na stężenie białek, zanieczyszczeń i skalę
procesu, można wprowadzać zmiany w trakcie całego procesu.
Wymagania dotyczące filtracji( dotyczące powierzchni
filtrującej), są wysoce zależne od lokalizacji tego etapu w
cyklu produkcyjnym.
Rys.1 produkcja przeciwciał monoklonalnych
Wpływ stężenia roztworu filtrowanego
Wysokie stężenie roztworu może redukować przepustowość
płynu oczyszczanego.
Poziom wpływu zależy od interakcji pomiędzy filtrem a
składnikami roztworu, wynikających z ich struktury.
Wzrost objętości roztworu, przez jego rozcieńczenie, zwiększa
skuteczność filtracji.
rys. 2 przedstawia wpływ stężenia roztworu na wielkość
powierzchni filtrującej.
Rys.2 Wpływ stężenia białek na powierzchnię filtru
Wpływ prefiltracji
- Prefiltracja roztworów ma decydują
ący wpływ na wynik
filtracji.
- Ma ona na celu usunięcie różnego typu zanieczyszczeń, takich
jak: agregaty białek, DNA, ślady substratów.
- Chociaż większe zanieczyszczenia mogą być usunięte przez
prefiltrację (używając 0,2 lub 0,1 μm filtrów), mniejsze od
białkowych produktów zanieczyszczenia, nie mogą być tak
łatwo usunięte przez metody oparte na różnicy rozmiarów.
- Dlatego prefiltracja przez adsorpcję, została dostrzeżona jako
metoda zapewniająca znaczącą ochronę dla filtrów.
Wpływ czasu przechowywania oraz cykli zamrażania i
rozmrażania
- Niektóre białka wykazują zdolność agregacji, zależną od
czasu lub momentu, w którym są poddawane cyklom zamrażania
i rozmrażania.
- Jeżeli w czasie procesu występują w/w etapy, ważne jest aby
uwzględnić ich efekty podczas optymalizacji filtracji.
- Ponadto, chociaż aktualnie proces oczyszczania może nie
zawierać etapu zamrażania, to próbka przeznaczona do badania
obecności wirusów, często jest zamrażana, ze względu na
stabilność surowców.
Czas procesu
Filtry „parvovirusowe” mogą być sklasyfikowane w dwie
grupy:
z dużym przepływem białek, ale z niską do średniej
pojemnością
o dużej pojemności, ale z niskim do średniego przepływem.
Obydwa rodzaje filtrów mają wady i zalety.
Projektowanie badań nad zdolnością do retencji wirusów
Wprowadzono schemat badań nad oczyszczaniem z wirusów
metodą filtracji dla celów walidacyjnych. Badania te pomagają w
wyborze metody oczyszczania.
Powinny być zaprojektowane tak, aby odzwierciedlać zdolność
oczyszczania z wirusów w danym procesie jednostkowym.
Dlatego poziom oczyszczania w skali laboratoryjnej powinien
naśladować proces produkcyjny w jak największym stopniu,
poprzez odtworzenie kluczowych dla procesu parametrów, które
wpływają znacząco na efektywność oczyszczania.
Parametry krytyczne dla tego procesu będą się różniły w
zależności od technologii oczyszczania ( z powodu różnicy w
mechanizmach działania).
Parametry filtracji na skalę laboratoryjną skupiają się na:
identyczności pomiędzy czynnikami wpływającymi na
zdolność retencyjną filtrów uwzględnionymi w badaniach,
a obecnymi w procesie
szybkości przepływu lub ciśnieniu,
stosunku objętości do całkowitej powierzchni filtra lub
zakresie zmniejszania się przepływu
wydajności i jakości produktu
Zazwyczaj zleceniodawca badań może polegać na
wytwórcy filtrów, że ten dostarczy parametry potrzebne do
walidacji procesu.
Odpowiednie wymagania jak zaplanować i
przeprowadzić retencje wirusów są dostępne chociażby
w FDA.
Dokumenty tj. Parenteral Drug Association
Technical Report 41 zawierają instrukcje jak
zapewniać odpowiednią liczbę redukcji wirusów ( LRV).
Wiele filtrów „parvowirusowych” wykazuje
zmniejszoną wartość LRV spowodowaną efektem ich
zatykania.
Powyższe zagadnienia powinny być wzięte pod
uwagę przy wyborze i projektowaniu badań nad filtrami
przeciwwirusowymi, tak aby uzyskać pożądana
wydajność i redukcję wirusów.
Gdy wydajność lub liczba LRV nie są spełnione
z powodu różnic w strukturze białek albo jakości
wirusowych cząstek, należałoby przedyskutować inne
alternatywne metody usuwania z odpowiednimi
organami kontrolnymi.
Dobór odpowiedniego filtru
Wdrażanie
Po tym jak etapy oczyszczania zostały zoptymalizowane
i badania nad tym procesem zakończono, proces wdrażania jest
konieczny, aby sama produkcja była stabilna i wydajna.
Po wyborze pojemności filtra wymaganej w procesie
oczyszczania w badaniach laboratoryjnych ( symulacja procesu
przemysłowego), można obliczyć parametry dla pojemności
większych, charakterystycznych dla przemysłu.
Wiele filtrów dostępnych na rynku jest przygotowana
tak aby umożliwić i ułatwić wdrażanie większej skali procesu.
Kolejne etapy procesu to:
instalacja filtru,
pomiar współczynnika filtracji wody (współczynnik
wodoprzepuszczalności),
oczyszczanie przewodów,
sterylizacja i sanityzacja,
dobór buforu i pomiar współczynnika przepuszczalności,
odzysk produktu.
Sanityzacja i sterylizacja
W typowym oczyszczaniu zgodnie z kierunkiem przepływu cieczy
filtracja odbywa się w kolumnach chromatograficznych, a w
przeciwprądzie za pomocą ultrafiltracji i diafiltracji. Żadne z
powyż
ższych nie jest rozważ
żane jako aseptyczny proces.
Dodatkowo pojawia się trend w przemyśle, w którym sterylizuje
się filtry tak aby zredukować zanieczyszczenia biologiczne.
Niektóre filtry są dostępne już wysterylizowane, dlatego ten
proces zostaje wyeliminowany .
Przykładowy zestaw do ultrafiltracji
DZIĘ
ĘKUJEMY ZA UWAGĘ
Ę!