Prowadzący ćwiczenia:

Prowadzący ćwiczenia:
dr Agata Krawczyk-Balska
Izolacja i charakterystyka mutantów Serratia marcescns o zmienionym zabarwieniu
Wstęp:
Mutacje spontaniczne zachodzą z częstotliwością mniejszą niż 10 -5, co oznacza, że w czasie
namnażania się komórek błąd w sekwencji nukleotydowej DNA pojawia się rzadziej niż raz na 10 5
komórek potomnych. Mutageny (czynniki mutagenne) to czynniki zwiększające od kilku do kilku tysięcy
razy częstość powstawania mutacji. Ogólnie można je podzielić na czynniki fizyczne (np.
promieniowanie UV, gamma) i chemiczne (np. kwas azotawy, iperyt gazowy, analogi zasad azotowych,
związki alkilujące).
Serratia marcescens (pałeczka krwawa, pałeczka cudowna) jest bakterią gramujemną produkującą
w temperaturze pokojowej i dostępie światła czerwony barwnik prodigiozynę, tj. metabolit wtórny z
grupy heterocyklicznych amin aromatycznych. Struktura cząsteczki prodigiozyny zawiera 3 pierścienie
pirolowe. Szlak biosyntezy prodigiozyny (rys. 1) jest szlakiem wieloetapowym, w którym każdy etap jest
kontrolowany przez charakterystyczny enzym (2).
Rys. 1. Szlak biosyntezy prodigiozyny
W wyniku mutagenizacji (np. przy użyciu ultrafioletu lub nitrozoguanidyny (N-metylo-N’-nitro-Nnitrozoguanidyna) możliwe jest uzyskanie szczepów mutantów w genach kodujących enzymy szlaku
biosyntezy prodigiozyny, wytwarzających kolonie o innym kolorze niż czerwony (tabela 1).
Tabela 1. Zabarwienie mutantów S. marcescens w genach kodujących enzymy szlaku biosyntezy
prodigiozyny.
Mutant w genie
Kolor szczepu
c
Różowy
b1
Biały lub żółty
b2
Różowy
b3
Pomarańczowy
m1
Jasno różowy
m2
Różowy lub biały
1
Barwa mutantów o różnych fenotypach może zostać przywrócona do stanu macierzystego
(czerwonego) w wyniku reakcji cross-feeding, która polega na wzajemnym uzupełnianiu produktów
pośrednich szlaku biosyntezy prodigiozyny przez mutanty należące do różnych klas. Różne mutanty mają
blokadę w różnych miejscach szlaku, co oznacza, że produkują różne produkty pśrednie. Produkty te
wydzielane są do podłoża, dzięki czemu mogą być pobierane i wykorzystane do przywrócenia fenotypu
macierzystego.
Cel ćwiczenia: (I) Porównanie efektywności mutagenizacji przy użyciu ultrafioletu oraz
nitrozoguanidyny (II) zbadanie efektywności przywracania fenotypu macierzystego mutantom
pigmentacyjnym S. marcescens w wyniku reakcji cross-feeding
Wykonanie ćwiczenia:
Dzień I
Mutagenizacja promieniami UV
1. Sterylnie pobrać 4 ml hodowli nocnej Serratia marcescens, próbę odwirować (8 tys. rpm, 5 min)
w probówkach typu Eppendofr z wykorzystaniem mikrowirówki typu Eppendorf.
2. Osad zawiesić w 2 ml roztworu soli fizjologicznej (RF)
3. Zawiesinę komórek przenieść do sterylnej szalki Petriego, umieścić w szalce wysterylizowany
dipol magnetyczny i mieszać na mieszadle.
4. Usunąć pokrywkę z szalki i naświetlać zawiesinę promieniami UV przez 0 (kontrola), 20, 40, 60 i
80 sekund
5. Sterylnie przygotować seryjne rozcieńczenia każdej próby (0,1 ml próby i 0,9 ml RF), z
rozcieńczenia 10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 –5 ( w przypadku kontroli szereg rozcieńczeń do10 –6) wysiać
po 0,1 ml na szalki z agarem odżywczym (próbę z każdego rozcieńczenia wysiać na 2 szalki, w
przypadku kontroli wysiać próbę z rozcieńczenia 10 –5 i 10 –6)).
6. Szalki inkubować w 30 oC na świetle przez 3-4 doby.
Mutagenizacja nitrozoguanidyną (NTG)
1. Przygotować hodowlę wykładniczą Serratia marcescens (OD600 = 0,8) w podłożu płynnym LB
(inoculum 1:20 w 100 ml podłoża).
2. Sterylnie pobrać 4 ml hodowli, próbę odwirować (8 tyś. rpm, 5 min) w probówkach typu
Eppendofr z wykorzystaniem mikrowirówki typu Eppendorf.
3. Osad zawiesić w 2 ml świeżego podłoża LB
4. a) Kontrola – do zawiesiny komórek nie dodawać nic;
b) Próba badana - dodać NTG do końcowego stężenia 100 g/ml.
5. Inkubować z wytrząsaniem przez 15 minut w 37 oC.
6. Zawiesiny komórek odwirować (8 tys. rpm, 5 min).
7. Uzyskany osad zawiesić w 2 ml roztworu soli fizjologicznej, a następnie odwirować (8 tys. rpm, 5
min) – etap płukania powtórzyć 2-krotnie.
8. Osad zawiesić w 1 ml podłoża LB i przenieść do kolbki z 9 ml podłoża LB. Zawiesinę inkubować
z wytrząsaniem w 37 oC przez 1 godzinę.
7. Sterylnie przygotować seryjne rozcieńczenia hodowli (0,1 ml próby i 0,9 ml RF), z rozcieńczenia
10 -4, 10 –5 i 10 -6 wysiać po 0,1 ml na szalki z agarem odżywczym (próbę z każdego rozcieńczenia
wysiać na 2 szalki).
9. Szalki inkubować w 30 oC na świetle przez 3-4 doby.
Dzień II
2
1. Obejrzeć szalki po zakończonej inkubacji, określić całkowitą liczbę bakterii w próbach oraz liczbę
bakterii o zmienionym zabarwieniu (mutanty w genach kodujących enzymy szlaku syntezy
prodigiozyny – czerwonego barwnika wytwarzanego przez S. marcescens)
2. Obliczyć przeżywalność komórek wg wzoru
P = (liczba bakterii po mutagenizacji / liczba bakterii w próbach kontrolnych)  100%
3. Obliczyć odsetek mutantów o zmienionym zabarwieniu wg wzoru
O = (liczba bakterii o zmienionym zabarwieniu / całkowita liczba bakterii w próbach)  100%
4. Kolonie o zmienionym zabarwieniu rozsiać posiewem redukcyjnym na szalki z agarem
odżywczym
5. Szalki inkubować w 30 oC na świetle przez 3-4 doby.
Dzień III
Test „cross-feeding
1. Na szalkę z agarem odżywczym wysiać rysą szczep wybranego mutanta. Kolejne mutanty posiać
rysą, prostopadle do pierwszej wykonanej rysy, w odstępie około 3 mm.
2. Szalki inkubować w 30 oC na świetle przez 3-4 doby. Po okresie inkubacji określić, czy doszło do
komplementacji do fenotypu macierzystego oraz czy była to komplementacja 1, czy 2kierunkowa.
Opracowanie wyników:
Po przeprowadzonych ćwiczeniach należy ocenić i porównać:
1. przeżywalność komórek z zastosowaniem ultrafioletu oraz nitrozoguanidyny
2. odsetek uzyskanych mutantów pigmentacyjnych z zastosowaniem ultrafioletu oraz
nitrozoguanidyny
Należy również przeanalizować teoretyczną zdolność poszczególnych mutantów pigmentacyjnych do
komplementacji mutacji w innych mutantach pigmentacyjnych, rozpatrując poszczególne mutanty jako
donory lub akceptory w teście cross-feeding, na podstawie wyciągniętych wniosków uzupełnić poniższą
tabelę wstawiając + , gdy komplementacja fenotypowa zachodzi i – gdy nie zachodzi:
Akceptory
c
b1
b2
b3
m1
m2
c
b1
b2
Donory
b3
m1
m2
Literatura:
1. Baj J i Markiewicz Z. Biologia molekularna bakterii. PWN 2006
2. Morrison D. A.. 1966. Prodigiosin Synthesis in Mutants of Serratia marcesens. J. Bacteriology,
91(4): 1599-1604
3. Węgleński P. Genetyka molekularna. PWN 2000
3