politechnika łódzka

POLITECHNIKA ŁÓDZKA
INSTRUKCJA Z LABORATORIUM W
ZAKŁADZIE BIOFIZYKI
Ćwiczenie 3
ANALIZA TRANSPORTU SUBSTANCJI
NISKOCZĄSTECZKOWYCH PRZEZ
BŁONĘ KOMÓRKOWĄ
Analiza transportu substancji niskocząsteczkowych przez błonę komórkową
I. WSTĘP TEORETYCZNY
Każda komórka, zarówno roślinna, jak i zwierzęca jest otoczona błoną
komórkową, która stanowi selektywną, półprzepuszczalną barierę dla substancji
znajdujących się we wnętrzu komórki i w jej otoczeniu. Wszystkie błony
biologiczne zbudowane są przede wszystkim z lipidów oraz białek. Cząsteczki
białek zanurzone są w dwuwarstwowej błonie fosfolipidowej, której strukturę
określa się mianem płynnej mozaiki błony.
Cząsteczki fosfolipidów błonowych składają się z hydrofilowych główek i
hydrofobowych ogonków. W wodzie ogonki dążą do siebie, a główki na
zewnątrz – w ten sposób powstaje błona komórkowa (rys.1.).
Rys.1. Model struktury błony cytoplazmatycznej
B1 – białko integralne (wewnętrzne), B2–B5 - białka powierzchniowe (peryferyjne)
Błony biologiczne są strukturami dynamicznymi, zmieniającymi się w
czasie. Przez płynność błony należy rozumieć możliwość przemieszczania się
elementów tworzących błonę, szczególnie białek. Stopień płynności danego
obszaru błony zależy od czynników środowiskowych (temperatura, charakter
chemiczny roztworów stykających się z błoną) oraz strukturalnych: większą
sztywność wykazują błony o dużej zawartości płaskich cząsteczek cholesterolu i
nienasyconych kwasów tłuszczowych w fosfolipidach.
Cząsteczki białek błonowych mogą przenikać w poprzek całą błonę
(białka integralne lub transmembranowe) bądź tylko przyczepione do niej po obu
jej stronach.
1
Analiza transportu substancji niskocząsteczkowych przez błonę komórkową
Funkcje błon biologicznych są różnorodne. Lipidy błonowe nie
przepuszczają substancji rozpuszczonych w wodzie, powodując oddzielnie
roztworów znajdujących się po obu stronach błony. Transport substancji
chemicznych przez błony odbywa się głównie za pośrednictwem białek. Są
wśród nich cząsteczki tworzące kanały, które w miarę potrzeb mogą być
otwierane i zamykane. Są białka, które po pobraniu cząsteczek czy jonów po
jednej stronie błony wędrują na drugą stronę, by tam je uwolnić. Istnieją białka,
które obracają się w błonie o 180o, przenosząc tym samym cząsteczki z jednej
strony błony na drugą, niekiedy jednocześnie dwa rodzaje cząsteczek w
przeciwnych kierunkach.
Jeśli transport odbywa się zgodnie z gradientem stężeń danej substancji, tj.
z obszaru o większym stężeniu do obszaru o mniejszym stężeniu, nie sprawia to
problemów. Transport wbrew gradientowi stężeń wymaga natomiast nakładu
energii – jest to transport aktywny.
Pobieranie substancji chemicznych przez komórkę może odbywać się
także poprzez wpuklanie fragmentów błony i tworzenie pęcherzyków
zawierających obiekt, który przylegał do błony po stronie zewnętrznej.
Odpowiednio – wydzielanie substancji poza komórkę może polegać na
łączeniu się błony otaczającej pęcherzyk zawierający tę substancję z błoną
komórkową.
Oprócz pełnienia licznych funkcji ochronnych i transportowych błony
biologiczne, biorą udział w odbieraniu i przewodzeniu sygnałów. Sygnały
docierają do komórek najczęściej w postaci pewnych cząsteczek, np. hormonów.
Aby komórka mogła odebrać dany sygnał, musi mieć na powierzchni błony
swoisty receptor – białko, glikoproteinę, wiążące się z cząsteczką sygnałową.
Związanie tej cząsteczki powoduje zmiany w strukturze białka receptora,
wpływające na białka enzymatyczne we wnętrzu komórki.
2
Analiza transportu substancji niskocząsteczkowych przez błonę komórkową
III. PRZEBIEG ĆWICZENIA
Niezbędne materiały do przeprowadzenia ćwiczenia
♦
zawiesina komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae,
♦
pipety,
♦
wirówka,
♦
kapilary szklane
Odczynniki wykorzystywane podczas analizy transportu:
! FURA - 2 AM - indykator do oznaczania wolnych jonów wapnia
! EDTA – (wersenian dwusodowy) substancja wiążąca jony dwuwartościowe
! bufor fosforanowy pH 7,6
III. PRZEBIEG ĆWICZENIA
A. Metody
1) Przygotowanie materiału do badań
Drożdże należy zbierać przez odwirowanie przy 10000 x g przez 1 min.
(wirówka Micro–centrifuge type 320) w temperaturze pokojowej.
Następnie otrzymany osad przemywać trzykrotnie w buforze fosforanowym w
celu usunięcia pożywki i doprowadzić
do cytokrytu 2%(v/v)
2) Określenie cytokrytu (ilości komórek ) drożdży poddanych badaniom:
Tok postępowania:
- odwirowanie 2-krotnie, 4 probóki typu eppendorf, każdorazowo napełnianych
po 1ml zawiesiny drożdży
- zwieszenie odwirowanych drożdży w 0,1ml buforu i napełnienie kapilar
pomiarowych, następnie odwirowanie i pomiar odcinka skupienia drożdży
w stosunku do odcinka zawartości płynu w kapilarze
3
Analiza transportu substancji niskocząsteczkowych przez błonę komórkową
- podstawienie danych do zależności
c1=(ldrożdży * 100)/ lcałkowite [%]
ldrożdży – długość odcinka z płynem w kapilarze
lcałkowite - długość odcinka ze skupionymi drożdżami,
następnie należy obliczyć objętość drożdży w\g wzoru:
µl]
v2=( v1c2 )/ c1 [µ
v2 – szukana objętość drożdży
v1 – objętość drożdży odwirowanych
c2 – ilość odwirowywań
Znając objętość (v2) drożdży przeprowadzić badania:
B. Zakres badań
1. Badanie transportu FURA - 2 AM - 40 µmol
2. Badanie transportu FURA - 2 AM w obecności EDTA
(40 µmol FURA - 2 AM + 100 µl roztworu 1 mmol EDTA)
C. Tok postępowania
a) odwirować określoną ilość drożdży,
b) odmyć 3-krotnie odwirowane drożdże w buforze,
c) zawiesić w 1ml buforu, dodać odpowiedni odczynnik i odwirowywać po
upływie 0, 5, 10, 20, 30 minut,
d) po odwirowaniu zawiesić w 2ml buforu,
e) dokonać odczytu fluorymetrem (fluorymetr TKO 100),
f) zanotować wyniki w tabelach 1 i 2.
4
Analiza transportu substancji niskocząsteczkowych przez błonę komórkową
Tab.1. Badanie transportu FURA - 2 AM - 40 µmol
CZAS (min) 40 µl FURA - 2 40 µl FURA - 2 40 µl FURA - 2
AM
AM
AM
0
Średnia
5
10
20
30
Tab.2. Badanie transportu FURA - 2 AM w obecności EDTA
100µl EDTA 100µl EDTA 100µl EDTA 100µl EDTA
+
+
+
+
CZAS (min)
40 µl FURA - 40 µl FURA - 40 µl FURA - 40 µl FURA 2 AM
2 AM
2 AM
2 AM
0
Średnia
5
10
20
30
IV. SPRAWOZDANIE POWINNO ZAWIERAĆ
1. Krótki wstęp teoretyczny.
2. Cel przeprowadzonego ćwiczenia.
3. Objaśnienie symboli stosowanych w sprawozdaniu.
4. Tabele z wartościami wielkości mierzonych.
5. Wykres szybkości transportu 10µM FURA – 2 AM.
5
Analiza transportu substancji niskocząsteczkowych przez błonę komórkową
6. Dyskusję i wnioski.
V. PYTANIA KONTROLNE
1.
Budowa błony komórkowej.
2.
Rodzaje transportu przez błonę – omówić transport aktywny .
3.
Zjawisko osmozy.
4.
Zjawisko luminescencji.
LITERATURA
1. J. St. Szopa: Biologia i inżynieria komórki - laboratorium; PŁ,Łódź 1994r.
2. F. Jaroszka: Biofizyka; Wydawnictwo Lekarskie PZWL; Warszawa 2001r.
3. K. Ostrowski: J.Kawiaka: Cytofizjologia; Państwowy Zakład
Wydawnictw Lekarskich; Warszawa 1990r.
4. A. Pilawski: Podstawy biofizyki; Państwowy Zakład Wydawnictw
Lekarskich; Warszawa 1985r.
5. A. Batko, W.kofta i in.: Botanika i biologia komórki; Prószyński i S–ka;
Warszawa 1998
6