WPŁYW RÓśNYCH CZYNNIKÓW NA POZIOM AKTYWNOŚCI

WPŁYW RÓśNYCH CZYNNIKÓW NA POZIOM AKTYWNOŚCI

Biotechnologia 4(1-2) 2005, 3-12
WPŁYW RÓśNYCH CZYNNIKÓW
NA POZIOM AKTYWNOŚCI AMINOPEPTYDAZOWEJ
U BAKTERII PSEUDOMONAS SP.
Urszula Jankiewicz, Monika Sępowicz, Dorota Sawicka1
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
Streszczenie: W prezentowanej pracy przeprowadzono badania mające na celu ustalenie
wpływu składników poŜywki hodowlanej oraz warunków hodowli na poziom aktywności
dwóch aminopeptydaz: alanylowej i fenyloalanylowej syntetyzowanych przez bakterie
Pseudomonas sp. Stwierdzono, Ŝe poziom aktywności badanych enzymów jest zaleŜny od
składu podłoŜa hodowlanego. Wysoki poziom aktywności aminopeptydazowej uzyskiwano podczas hodowli w poŜywce mineralnej wzbogaconej 1% tryptonem, o pH 6,8, w temperaturze 27 ˚C, w drugim dniu hodowli. Wzbogacenie podłoŜa hodowlanego w niektóre
cukry i sole mineralne spowodowało wzrost poziomu aktywności obu enzymów. Obecność w poŜywce glukozy w stęŜeniu 4% powodowała spadek poziomu aktywności aminopeptydazy fenyloalanylowej. Stosunkowo niską aktywność badanych enzymów uzyskiwano w poŜywkach zawierających jedynie nieorganiczne źródła węgla i azotu.
Słowa kluczowe: aminopeptydazy, enzymy proteolityczne, Pseudomonas sp., glebowe
bakterie
WSTĘP
Aminopeptydazy EC (3.4.11) są to peptydazy katalizujące odłączanie N-końcowej
reszty aminokwasowej w substratach białkowych i peptydowych. Enzymy te występują
w kaŜdej komórce zarówno prokariotycznej, jak i eukariotycznej, pełniąc istotne funkcje kataboliczne i regulatorowe. UwaŜa się, Ŝe aminopeptydazy mogą być zaangaŜowane zarówno w etap poprzedzający degradację białek wewnątrzkomórkowych, jak i w
etap finalny prowadzący do uzyskania wolnych aminokwasów. NiezaleŜnie od rozkładu
białek do aminokwasów w komórce bakteryjnej zachodzi ograniczona proteoliza białek,
w której waŜną rolę odgrywają takŜe aminopeptydazy [Yen i in. 1980, Taylor 1993].
Aminopeptydazy bakteryjne zostały poddane szczególnie intensywnym badaniom stymulowanym potrzebami przemysłu, szczególnie spoŜywczego. Dzięki takim właściwoAdres do korespondencji – Corresponding author: Urszula Jankiewicz, Katedra Biochemii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa, e-mail:
[email protected]
4
U. Jankiewicz i in.
ściom, jak poprawa wartości smakowych dojrzewających serów, usuwanie gorzkich
peptydów z produktów mlecznych czy teŜ tolerancja na wysokie stęŜenia soli, enzymy
te znalazły szerokie zastosowanie w mleczarstwie. Bakteryjne preparaty enzymatyczne
stosuje się obecnie w niemal wszystkich gałęziach gospodarki, ze względu na wielką
ich róŜnorodność i niską cenę procesów biotechnologicznych ich otrzymania. Ponadto
enzymy produkowane przez mikroorganizmy są stabilne i posiadają często właściwości
i zakres działania, których nie wykazują enzymy pozyskiwane z surowców roślinnych
czy zwierzęcych. Wiadomo, Ŝe synteza produkowanych przez mikroorganizmy enzymów zaleŜna jest od składu podłoŜa oraz od czynników fizycznych. Niekorzystne czynniki zewnętrzne mogą hamować wzrost hodowanych bakterii i tym samym obniŜać
ogólne nagromadzenie enzymów, zwłaszcza konstytutywnych. Dotychczasowe badania
wskazują na złoŜoność i róŜnorodność mechanizmów syntezy aminopeptydaz, wiele z
tych mechanizmów nie zostało jeszcze poznanych. Z literatury naukowej wynika, Ŝe
większość opisanych dotychczas aminopeptydaz ma charakter indukcyjny [Gonzales i
Robert-Baudouy 1996]. Przedmiotem naszych badań były dwie aminopeptydazy syntetyzowane przez glebowy szczep bakterii Pseudomonas sp. Enzymy te zostały oczyszczone i scharakteryzowane przez Jankiewicz i Bielawski [2001, 2002a,b]. Celem badań
było ustalenie wpływu róŜnych składników poŜywki hodowlanej oraz czynników fizykochemicznych na poziom aktywności aminopeptydazy alanylowej i fenyloalanylowej
syntetyzowanych przez szczep glebowych bakterii Pseudomonas sp.
MATERIAŁ I METODY
I. Materiał doświadczalny: glebowy szczep bakterii Pseudomonas sp. zdolny do wykorzystywania lupaniny jako źródła węgla i azotu został wyizolowany i scharakteryzowany przez MoŜejko-Toczko [1960].
PodłoŜe hodowlane: Podstawowym składnikiem wszystkich stosowanych podłoŜy
była poŜywka mineralna wg Bassalika [MoŜejko-Toczko M. 1960] wzbogacona róŜnymi źródłami węgla i azotu.
1. Wpływ źródła węgla: PoŜywka mineralna (zawierała 1% NH4Cl jako źródło azotu) została wzbogacona:
– 1% tryptonem, sacharozą, fruktozą, bursztynianem sodu, gliceryną, glutaminianem sodu i w stęŜeniu 1% oraz mieszaniną aminokwasów(Ala, Phe, Glu o
stęŜeniach kaŜdego 0,33%).
2. Wpływ źródła azotu: PoŜywka mineralna z dodatkiem 0,3% cytrynianu sodu jako źródła węgla – podstawowa, została wzbogacona:
– glutaminianem sodu, chlorkiem amonu, tryptonem, mocznikiem, azotanem
sodu w stęŜeniu 1%.
3. Wpływ dodatku sacharydów:
PoŜywka mineralna z dodatkiem 1% tryptonu została wzbogacona:
– glukozą, mannozą, fruktozą, arabinozą, ksylozą lub celobiozą w stęŜeniach
0,4 % i 4 %. Roztwory cukrów sterylizowano oddzielnie i łączono z pozostałymi składnikami podłoŜa po sterylizacji.
4. Wpływ dodatku soli nieorganicznych:
PoŜywka mineralna z dodatkiem 1% tryptonu została wzbogacona:
Acta Sci. Pol.
Wpływ róŜnych czynników na poziom aktywności aminopeptydazowej...
5
– MgSO4, NaCl, CaCl2 w stęŜeniach 0,25% i 0,50%, (NH4)2HPO4 w stęŜeniach
0,10% i 0,25%, K2HPO4 + KH2PO4 (w stosunku 1:1) w stęŜeniach 0,10%
i 0,20%,mieszaniną soli zawierająca: 0,001% MnSO4, 0,01% FeSO4, 0,1%
NH4Cl, 0,25% MgSO4, 0,50% KH2PO4.
5. Wpływ czasu hodowli, temperatury oraz pH poŜywek hodowlanych.
Hodowle prowadzono przez odpowiednio jeden do sześciu dni w poŜywce mineralnej z dodatkiem 1% tryptonu. Próby do oznaczeń pobierano sterylnie począwszy od pierwszego dnia, co 24 godziny.
II. Hodowla bakterii:
Kultura macierzysta bakterii Pseudomonas sp. prowadzona była na skosie agarozowym zawierającym podstawową poŜywkę mineralną z dodatkiem 0,1% lupaniny.
Komórki bakteryjne przenoszono w warunkach sterylnych do płynnej poŜywki mineralnej wzbogaconej 1% tryptonem i 0,25% ekstraktem droŜdŜowym. Następnie po
24 godzinach hodowli przeszczepiano uzyskane inokulum sterylnie do 50 ml ww.
podłoŜy w 250 ml kolbach. Statyczne hodowle prowadzono w temp. 27 °C.
III. Pomiar liczby komórek bakterii
Liczbę komórek bakterii określano fotometrycznie na podstawie wzrostu gęstości
optycznej (OD670) poŜywek hodowlanych. Wzrost bakterii przedstawiono jako liczbę komórek x ml-1 poŜywki, korzystając ze skali McFarlanda.
IV. Przygotowanie preparatów do oznaczeń aktywności aminopeptydazowej
Po określonym czasie hodowli płynne kultury bakteryjne wirowano przy 12000 x g
przez 12 min w temp. 4 °C. Osad komórek dwukrotnie przemywano roztworem soli
fizjologicznej i zawieszano w 20 mM buforze Tris- HCl o pH 6,8, ultradźwiękami
rozbijano struktury komórkowe (dezintegrator ultradźwiękowy UD-20, Techpan).
Sonikację prowadzono łącznie przez 1,5 min. Uzyskany homogenat odwirowywano
i w uzyskanym supernatancie oznaczano aktywność aminopeptydazową.
V. Oznaczanie aktywności aminopeptydazy alanylowej i fenyloalanylowej
Aktywność aminopeptydazową oznaczano metodą kolorymetryczną [Magboul, Mc
Sweeney, 1999] z zastosowaniem L-alanylo-p-nitroanilidu i L-fenyloalanylo-pnitroanilidu jako substratów. Jako jednostkę aktywności przyjęto 1 mmol p- nitroaniliny uwalnianej w ciągu 1 minuty przez enzym uzyskany ze 100 ml hodowli.
Wszystkie wyniki przedstawione w niniejszej pracy są średnią, co najmniej trzech
powtórzeń.
OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW
Zmiany poziomu aktywności aminopeptydazy alanylowej i fenyloalanylowej u bakterii Pseudomonas sp. w zaleŜności od składu poŜywki hodowlanej.
a) Wpływ dodatku róŜnych źródła węgla i azotu
Zbadano wpływ róŜnych źródeł węgla na poziom dwóch aktywności aminopeptydazowych syntetyzowanych przez bakterie Pseudomonas sp. (rys. 1). PodłoŜem podstawowym była poŜywka mineralna z dodatkiem 1% NH4Cl jako źródłem azotu. NajwyŜszy poziom aktywności zarówno aminopeptydazy alanylowej, jak i fenyloalanylowej
uzyskano podczas hodowli bakterii w poŜywkach wzbogaconych tryptonem, znacznie
niŜszy w poŜywkach z glutaminianem sodu, kwasem bursztynowym i gliceryną jako
źródłem węgla. Szczególnie niski poziom aktywności aminopeptydazowej uzyskano w
Biotechnologia 4(1-2) 2005
U. Jankiewicz i in.
6
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
liczba komórek/cell numer
9
11x
x 10
109
ml-l
ml-1
jednostki aktywności /
activity units
obecności 1% mieszaniny aminokwasów. Poziom badanej aktywności był ściśle skorelowany z tempem wzrostu bakterii. Podobne wyniki uzyskano w badaniach nad szczepem Bacillus subtilis IBTC-3, gdzie wykazano, Ŝe peptydaza syntetyzowana przez ten
szczep wykazywała bardzo małą aktywność w poŜywkach wzbogaconych aminokwasami [Trzmiel i in. 1994]. Takie zjawisko zostało równieŜ zaobserwowane u kilku
szczepów bakterii z rodzaju Pseudomonas [McKellar 1982, Fairbairn i Law 1987,
Al- Saleh i Zahran 1997].
e
ds
e
ol
ne
ate
ros
aci
ntr
ton
eri
t am
yp
no
lyc
su c
u
r
/ co
i
l
t
g
/
g
a
/
n
a/
ol
/ am
oza
ium
yn
n tr
p to
sy
har
ko
cer
so d
t ry
wa
/
sa c
k
g li
ino
odu
am
ns
nia
i
tam
g lu
źródła węgla 1% / carbon sources 1%
akt.a.alanylowej / alanyl a.activity
akt.a.fenyloalanylowej / phenylalanyl a.activity
wzrost / growth
Rys. 1. Wpływ róznych źródeł węgla w poŜywce hodowlanej na poziom aktywności aminopeptydazowej
Fig. 1. Influence of different carbon sources in culture medium on the level aminopeptidase
activity
Wpływ róŜnych źródeł azotu na poziom aktywności badanych aminopeptydaz prowadzono w poŜywce mineralnej wzbogaconej 0,3% cytrynianem sodu jako źródłem
węgla (rys. 2). NajwyŜszą aktywność aminopeptydazową i tempo wzrostu bakterii uzyskano w hodowlach prowadzonych w poŜywkach zawierających trypton jako jedyne
źródło azotu. Ciekawych obserwacji dostarczyły hodowle bakterii w poŜywkach wzbogaconych chlorkiem amonu i glutaminianem sodu, gdzie poziom aktywności aminopeptydazowej nie zaleŜał od tempa wzrostu bakterii. W tych hodowlach, pomimo intensywnego wzrostu bakterii, wykryto niską aktywność obu badanych aminopeptydaz.
Mogło to być wynikiem spowolnienia syntezy aminopeptydaz w obecności w podłoŜu
łatwo dostępnych źródeł azotu. Uzyskane w tych doświadczeniach wyniki pozwalają
przypuszczać, Ŝe trypton stanowi dobrze przyswajalne organiczne źródło węgla lub/i
jest czynnikiem indukującym syntezę aminopeptydaz u tego szczepu bakterii. Malik i
wsp. [1985] zaobserwowali podobne zaleŜności w badaniach nad peptydazą u szczepu
Pseudomonas sp. B-25, gdzie po zastąpieniu tryptonu w poŜywce innymi składnikami
Acta Sci. Pol.
Wpływ róŜnych czynników na poziom aktywności aminopeptydazowej...
7
co
a/
rol
t
n
ko
ol
ntr
n
pt o
try
%
e1
t on
p
y
/ tr
c
mo
,2%
a0
ure
/
k
zni
ik /
c zn
o
m
%
a2
ure
tan
az o
u/
sod
ium
sod
a te
nitr
1x 109 ml1-
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
liczba komórek/cell numer
jednostki aktywnośc / activity units
otrzymywano znacznie niŜszą aktywność enzymu [Malik i in. 1985]. Za pomocą indukcji regulowana jest m.in. synteza subtilizyny i metaloproteinazy u Bacillus subtilis
[Trzmiel, Szczęsna, 1994], aminopeptydazą u Lactobacillus casei ssp. casei [Choi i in.
1996] oraz dipeptydazy u bakterii z rodzaju Lactobacillus [Abo- Elnaga i Plapp, 1987,
Atlan i in.1989].
1%
źródła azotu / nitrogen sources
akt.a.alnylowej / alanyl a.activity
akt.a.fenyloalanylowej / phenylalanyl a.activity
wzrost / growth
Rys. 2. Wpływ róŜnych źródeł azotu w poŜywce hodowlanej na poziom aktywności aminopeptydazowej
Fig. 2. Influence of different nitrogen sources in culture medium on the level of aminopeptidases
activity of different nitrogen sources in culture medium on the level aminopeptidase
activity
b) Wpływ dodatku cukrów i soli mineralnych
Zbadano takŜe wpływ dodatku cukrów o stęŜeniach 0,4% i 4% do podstawowej poŜywki hodowlanej na poziom aktywności aminopeptydazowej syntetyzowanej przez
Pseudomonas sp. (tab. 1). Wzrost poziomu aktywności aminopeptydazowej fenyloalanylowej uzyskano we wszystkich poŜywkach wzbogaconych podanymi w tabeli cukrami. NiŜszą około 40% aktywność tej aminopeptydazy uzyskano w poŜywce z dodatkiem 4% glukozy. W poŜywkach wzbogaconych 4% ksylozą nie wykryto aktywności
enzymu pomimo intensywnego wzrostu bakterii. NajwyŜszy poziom aktywności aminopeptydazy alanylowej uzyskano w hodowli bakterii prowadzonych na poŜywkach z
dodatkiem 0,4% mannozy oraz 0,4% i 4% fruktozy, natomiast wyraźny spadek tej aktywności odnotowano w poŜywkach z mannozą i ksylozą o stęŜeniu 4%. Niski poziom
aktywności aminopeptydazowej zaobserwowany w poŜywkach wzbogaconych 4%
mannozą i ksylozą mógł być efektem niskiego pH w poŜywce lub wystąpieniem represji
katabolicznej. W badaniach prowadzonych nad regulacją syntezy enzymów proteolitycznych u kilku szczepów Pseudomonas i Bacillus wykazano, Ŝe obecność niektórych
form węgla, m.in. fruktozy, moŜe być czynnikiem indukującym syntezę enzymów
Biotechnologia 4(1-2) 2005
U. Jankiewicz i in.
8
proteolitycznych [McKellar, 1982, Malik i in. 1985, Razak i in. 1994]. Z analizy danych
literaturowych wynika, Ŝe represja kataboliczna, czyli hamowanie syntezy enzymów,
głównie zewnątrzkomórkowych u bakterii hodowanych w podłoŜach zawierających
glukozę lub inne przyswajalne źródło węgla, jest obok indukcji jednym z podstawowych mechanizmów kontroli biosyntezy enzymów proteolitycznych. Jednak do tej pory
został opisany tylko jeden przykład tego typu regulacji biosyntezy aminopeptydaz
[Conlin i in. 1994]. Taki mechanizm natomiast został opisany dla wielu endopeptydaz
m.in. szczepów. Pseudomonas, Bacillus, Nesternkonia [Johnvesly i Naik 2001, Gessesse i in. 2003]. Dla kontrastu dodatek glukozy, nawet w stęŜeniu 6% do podłoŜa hodowlanego nie wpływał na wydajność biosyntezy proteinaz u Bacillus subtilis IBTC-3
[Trzmiel i in. 1994].
Tabela 1. Zmiany aktywności aminopeptydazowej w obecności cukrów w poŜywce hodowlanej
Table 1. Changes of the activity of aminopeptidases in the presence of saccharides in the
culture medium
StęŜenie cukru
Concentration of saccharides
[%]
Aktywność aminopeptydazy,
Aminopeptidase activity [%]
alanylowej
fenyloalanyl.
alanylphenylalanyl-
Liczba komórek
Cell numer
[1 x 109 ml -1]
Kontrola – Control
100
100
1,69
Glukoza – Glucose 0.4
131
177
1,45
Glukoza – Glucose 4.0
111
61
1,63
Celobioza – Cellobiose 0.4
99
128
1,64
Celobioza – Cellobiose 4.0
134
154
1,58
Mannoza – Mannose 0.4
174
236
1,82
Mannoza – Mannose 0.4
39
169
1,92
Fruktoza – Fructose 0.4
173
250
1,81
Fruktoza – Fructose 4.0
186
236
1,78
Arabinoza – Arabinose 0.4
119
147
1,62
Arabinoza – Arabinose 4.0
144
203
1,55
Ksyloza – Xylose 0.4
156
196
1,65
Ksyloza – Xylose 4.0
3
0
1,80
Zbadano takŜe zmiany aktywności aminopeptydazowych pod wpływem soli nieorganicznych (rys. 3). Hodowle bakterii prowadzono na poŜywce podstawowej wzbogaconej solami nieorganicznymi. Wyraźny wzrost aktywności aminopeptydazy alanylowej w stosunku do próby kontrolnej uzyskano w obecności 0,25% chlorku sodu,
0,50% siarczanu magnezu oraz mieszaniny soli, natomiast zahamowanie w obecności
0,50% chlorku wapnia w podłoŜu hodowlanym. Wzrost aktywności aminopeptydazy
fenyloalanylowej zaobserwowano w przypadku hodowli bakterii na poŜywkach wzbogaconych siarczanem magnezu oraz mieszaniną soli.
Acta Sci. Pol.
Wpływ róŜnych czynników na poziom aktywności aminopeptydazowej...
k
25
20
15
10
5
0
rol a
ont
/ co
1x109 ml-1
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
30
liczba komórek/cell numer
jednostki aktywności / activity units
35
9
l
re
ntro l 0,25% l 0,50% 0,25% 0,50% 0,10% 0,25% 0,10% 0,20% 0,25% 0,50% mixt u
2
4
4
s
l2
4
4
O4
O4
NaC
N aC CaCl
PO
PO M gSO MgSO i / sa lt
2
2
CaC )2H P )2HP
H
H
l
4
4
+K
+K
a so
(NH
(N H P O 4
O4
ni n
H
HP
s za
e
K2
K2
i
m
sole nieorganiczne / inorganic salts
akt.a.alanylowej / alanyl a.activity
akt.a.fenyloalanylowej / phenylalanyl a.activity
wzrost / growth
Rys. 3. Wpływ dodatku soli nieorganicznych do poŜywki hodowlanej na poziom aktywności
aminopeptydazowej
Fig. 3. Influence of inorganic salt additive to the culture medium on the level of aminopeptidase
activity
c) Wpływ czasu hodowli, temperatury oraz pH poŜywek na poziom aktywności aminopeptydazowej u bakterii Pseudomonas sp.
NajwyŜszą aktywność uzyskano po 48 godzinach hodowli w stacjonarnej fazie
wzrostu bakterii. W kolejnych dniach aktywność stopniowo malała, nie towarzyszył
temu jednak spadek tempa wzrostu bakterii (rys. 4). Podobne wyniki zostały uzyskane
dla innych szczepów z rodzaju Pseudomonas [Myhara i Skura 1990]. Wysoka aktywność aminopeptydazowa utrzymywała się podczas hodowli bakterii w poŜywkach w
szerokim zakresie pH (5,5–8,5), przy czym szczyt aktywności aminopeptydazy alanylowej przypadał na pH 7,5, natomiast fenyloalanylowej na pH 6,5. Szczególnie niską
aktywność badanych enzymów odnotowano w poŜywkach o odczynie poniŜej 5,5 oraz
powyŜej 9,0 (rys. 5). Wyniki te są potwierdzeniem wcześniejszych badań i wskazują, Ŝe
optymalne pH hodowli bakterii odpowiada odczynowi optymalnemu dla działania aminopeptydazy alanylowej i fenyloalanylowej [Jankiewicz i Bielawski 2001, Jankiewicz i
Bielawski 2002a]. Wysoką aktywność proteolityczną w poŜywkach o pH 5,5–8,0 z
maksimum aktywności przypadającym na pH 7,0 oraz jej spadek w poŜywkach o odczynie kwaśnym stwierdzono takŜe u szczepu Pseudomonas fragi [Myhara i Skura
1990].
NajwyŜszą aktywność obu aminopeptydaz uzyskano podczas hodowli bakterii w zakresie temperatur 27 ºC – 30 ºC. NiŜszy o około 30% poziom aktywności uzyskano w
hodowlach prowadzonych w temperaturze 15 ºC i 20 ºC. Poziom aktywności aminopeptydazowej był uzaleŜniony od tempa wzrostu bakterii.
Biotechnologia 4(1-2) 2005
U. Jankiewicz i in.
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
liczba komórek/cell numer
1x109ml-1
jednostki aktywności / activity units
10
0
1
2
3
4
5
6
czas hodowli / growth time
akt.a.alanylowej / alanyl a.activity
akt.a.fenyloalanylowej / phenylalanyl a.activity
wzrost / growth
9
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
8
7
6
5
4
3
2
1
0
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
liczba komórek/cell numer
1x 109 ml-1
jednostki aktywności / activity units
Rys. 4. Zmiany aktywności aminopeptydazowej w zaleŜności od długości czasu hodowli
Fig. 4. Influence of the growth time on the level of aminopeptidase activity
9,5
pH
akt.a.alanylowej / alanyl a.activity
akt.a.fenyloalanylowej / phenylalanyl a.activity
wzrost / growth
Rys. 5. Wpływ pH poŜywki hodowlanej na poziom aktywności aminopeptydazowej
Fig. 5. Influence of the pH of the culture medium on the level aminopeptidase activity
Acta Sci. Pol.
Wpływ róŜnych czynników na poziom aktywności aminopeptydazowej...
11
PODSUMOWANIE
NajwyŜszy poziom aktywności aminopeptydaz alanylowej i fenyloalanylowej uzyskano podczas hodowli bakterii Pseudomonas sp. w poŜywce mineralnej wzbogaconej
1% tryptonem jako źródłem węgla i azotu, w temperaturze 27 ºC, w drugim dniu hodowli bakterii.
Optymalny odczyn poŜywki hodowlanej, gdzie uzyskiwano najwyŜszy poziom aktywności aminopeptydazy alanylowej, wynosił pH 7,5, natomiast fenyloalanylowej
pH 6,5. Szczególnie wysoki poziom aktywności aminopeptydaz alanylowej i fenyloalanylowej uzyskiwany w poŜywkach wzbogaconych m.in. 0,4% mannozą oraz 0,4% i 4%
fruktozą moŜe wskazywać, iŜ związki te mogą być czynnikami indukującymi syntezę
tego enzymu. Z drugiej strony, zaobserwowany w przypadku aminopeptydazy fenyloalanylowej spadek poziomu aktywności w poŜywkach wzbogaconych 4% glukozą sugeruje zahamowanie syntezy tej aminopeptydazy w obecności tego łatwo dostępnego
źródła energii. Uzyskane wyniki wskazują na złoŜoność mechanizmu regulacji syntezy
aminopeptydaz u badanego szczepu bakterii. Skorelowany ze wzrostem bakterii poziom
aktywności obu badanych enzymów uzyskany w doświadczeniu badającym wpływ
temperatury i pH hodowli moŜe świadczyć o częściowo konstytutywnym charakterze
badanych enzymów. Dokładne scharakteryzowanie mechanizmów regulacji syntezy
tych aminopeptydaz wymaga dalszych badań.
PIŚMIENNICTWO
Abo- Elnaga I.G., Plapp R., 1987. Peptidases of Lactobacillus casei and Lactobacillus plantarum.
J. Basic Microbiol., 27, 123-130.
Al- Saleh A.A., Zahran A.S., 1997. Protease production by Pseudomonas fluorescens CM12 isolated from raw camel milk, Egyptian J. Dairy Sci., 25, 327-336.
Atlan D. Laloi P., Portalier R. 1989. Isolation and characterization of aminopeptidase–deficient
Lactobacillus bulgaricus mutants. Appl. Environ. Microbiol. 55: 1717-1723.
Choi H., Laleye L., Amantea G. F., Simard R. E., 1996. Production of aminopeptidase from skim
milk whey permeate medium by Lactobacillus casei ssp. casei, J. Dary Sci. 79, 956-963.
Conlin C.A., Hakensson K., Liljas A. i Miller C.G. 1994. Cloning and nucleotide sequence of the
cyclic AMP receptor protein- regulated Salmonella typhimurium pepE gene and crystallization of its product, an a- aspartyl dipeptidase. J. Bacteriol., 176, 166-172.
Fairbairn D.J., Law B.A., 1987. The effect of nitrogen and carbon sources on proteinase production by Pseudomonas fluorescens. J. Appl. Bacteriol., 62, 105-113, 7.
Gessesse A., Haiti–Kaul R., Gashe B. A., Mattiason B., 2003. Novel alkaline proteases from
alkaliphilic bacteria grown on chicken feather. Enz. Microbiol Technol. 32, 519-524.
Gonzales T., Robert- Baudouy J. 1996. Bacterial aminopeptidase’s: properties and function.
FEMS Microbiol. Rev., 18, 319-344.
Jankiewicz U., Bielawski W., 2001. Production, purification and characterization of intracellular
alanylaminopeptidase of Pseudomonas sp. Folia Microbiol. 46: 515-518.
Jankiewicz U., Bielawski W.,. 2002a. Purification and properties of phenylalanyl aminopeptidase
synthesized by Pseudomonas sp. J. Basic Microbiol. 42:260-267.
Jankiewicz U., Bielawski W., 2002b. Regulation of the activity of intracellular alanylaminopeptidase synthesized by Pseudomonas sp. Folia Microbiol. 47:230-234.
Biotechnologia 4(1-2) 2005
12
U. Jankiewicz i in.
Johnvesly B., Naik G.R., 2001. Studies on production of thermostable alkaline protease from
thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. JB-99 in a chemically defined medium. Proc. Biochem., 37, 139-144.
Magboul A.A., McSweeney P.L.H., 1999. Purification and characterization aminopeptidase from
Lactobacillus curvatus DPC2024. Int. Dairy J., 9, 107-116.
Malik R.K., Prasad R., Mathur D.K., 1985. Effect of some nutritional and environmental factors
on extracellular protease production by Pseudomonas sp. B- 25. Le Lait, 65, 169-183.
McKellar R.C. 1982. Factors influencing the production of extracellular proteinase by Pseudomonas fluorescens, J. Appl. Bacteriol., 53, 305-316.
MoŜejko-Toczko M., 1960. Rozkład lupaniny przez Pseudomonas lupanini. Acta Microbiol.
Polon., 9, 157-171.
Myhara R.M., Skura B., 1990. Centroid search optimization of cultural conditions affecting the
production of extracellular proteinase by Pseudomonas fragi ATCC 4973., J. Appl. Bacteriol.,
69, 530-538.
Razak N.A., Samad M.Y.A., Basri M., Yunus W.M.Z.W., Ampon K., Salleh A.B., 1994. Thermostable extracellular protease of Bacillus stearothermophilus: factors affecting its production. J. Microbiol. Biotechnol., 10, 260-263.
Taylor A., 1993. Aminopeptidases: Structure and function. Faseb J. 7:290-298.
Trzmiel T., Szczęsna M., Galas E. 1994. Regulacja biosyntezy niektórych pozakomórkowych
enzymów u Bacillus subtilis IBTC- 3. Wpływ składu podłoŜa hodowlanego. Biotechnologia,
1(24), 149-155.
Yen, C., Green, L., Miller, C.G., 1980. Peptide accumulation during growth of peptidase deficient
mutants. J. Mol. Biol. 143: 35-48.
EFFECT OF VARIOUS FACTORS ON THE LEVEL OF AMINOPEPTIDASE
ACTIVITY IN PSEUDOMONAS SP.
Abstract. The aim of the present study was to determine the effect of medium components and culture conditions on the activity of alanyl and phenyloanalyl aminopeptidases
synthesised by Pseudomonas sp. It was observed that the enzymatic activity is dependent
on the composition of the culture medium. The high level of the aminopeptidase activity
was achieved on the second day of growth at pH 6.8 at 27 °C in the mineral medium
enriched with 1% of tryptone. The enrichment of the culture medium with some carbohydrates and mineral salts resulted in the increase of the activity level for both enzymes. The
presence of 4% glucose in the medium resulted in a fall of the phenyloanalylaminopeptidases’ activity. In the medium with inorganic carbon and nitrogen, relatively low enzymatic activity was observed.
Key words: aminopeptidases, proteolytic enzyme, Pseudomonas sp., soil bacteria
Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 14.11.2005
Acta Sci. Pol.