Morfologia bakterii

Komentarze

Transkrypt

Morfologia bakterii
ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ
I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ
Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej
Wydziału Farmaceutycznego
ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII
DLA STUDENTÓW ANALITYKI
CZĘŚĆ I
POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK
Łódź 2014
1
AUTORZY:
Bożena Dudkiewicz
Anna Kwaszewska
Paweł Lisiecki
Maria Sobiś-Glinkowska
Magdalena Szemraj
Eligia M. Szewczyk
ISBN: 978-83-64344-03-9
Wydanie drugie zmienione
2
Spis treści:
Rozdział 1
Morfologia komórki bakteryjnej………………………………………………….5
Rozdział 2
Pożywki do hodowli bakterii………………………………………………....….23
Rozdział 3
Otrzymywanie czystych hodowli, ocena morfologii wzrostu
bakterii…………………………………………………………………………………..….31
Rozdział 4
Wymagania wzrostowe bakterii…………………………………….……….….41
Rozdział 5
Wykorzystanie cech biochemicznych dla identyfikacja bakterii …51
Rozdział 6
Liczenie bakterii …………………………………………………………………………75
Rozdział 7
Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów, przekazywanie
plazmidów……………………………………………………………………………….…87
Rozdział 8
Oddziaływanie na bakterie w środowisku. Dezynfekcja
i antyseptyka………………………………………………………………………………99
Rozdział 9
Sterylizacja………………………………………………………………………….……115
Rozdział 10
Bakterie w lekach i żywności – kontrola czystości
mikrobiologicznej………………………………………………………………….…125
3
4
Rozdział 1
Morfologia komórki bakteryjnej
Część teoretyczna
Bakterie to organizmy prokariotyczne. Cechą charakterystyczną komórek
bakteryjnych jest brak jądra otoczonego błoną jądrową i jąderka. Ich
materiał genetyczny w formie nukleoidu, będącego podwójną nicią DNA
styka się bezpośrednio z cytoplazmą. Nie posiadają one również dobrze
wykształconych organelli komórkowych i układu błon wewnętrznych,
takich jak retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego, lizosomy,
mitochondria. Bakterie (poza mikoplazmami) mają ścianę komórkową,
membranę cytoplazmatyczną, a w cytoplazmie zawieszone są rybosomy.
Niektóre gatunki wytwarzają otoczki, przetrwalniki, fimbrie, ziarnistości
zapasowe, a zdolność ruchu zawdzięczają rzęskom lub włóknu osiowemu.
Z punktu widzenia diagnostyki najistotniejsze są te cechy morfologii
komórek bakterii, które można uwidocznić prostymi metodami
w mikroskopie świetlnym. Mikroskop elektronowy w laboratorium
szpitalnym nie jest przydatny.
Cechy morfologiczne komórek bakterii ważne dla ich identyfikacji to:
 kształt komórek i ich charakterystyczne dla rodzaju czy gatunku układy
popodziałowe;
 budowa ściany komórkowej warunkująca różnicowe barwienie
metodą Grama;
 otoczka;
 przetrwalniki;
 ziarnistości zapasowe;
 zdolność ruchu.
5
Wielkość, kształt i układy popodziałowe
Bakterie wykazują znaczną rozpiętość wymiarów. Wymiar większości
komórek bakteryjnych wynosi od 1 µm do 10 µm. Rozmiar najmniejszych
wynosi od 0,15 µm do 0,2 µm, co jest na granicy zdolności rozdzielczej
mikroskopu świetlnego. Wymiar największych wynosi od 250 µm do
600 µm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5 µm, a średnica
1-2 µm.
Wyróżniamy następujące kształty komórek bakteryjnych: kulisty,
cylindryczny i spiralny.
Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone
pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstanie
układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie
rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii
kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe:
 dwoinki (np. dwoinki zapalenia płuc) – komórki po podziale pozostają
po dwie,
 ziarniaki czworacze (Tetracocus) – komórki dzielą się w dwóch
płaszczyznach,
 pakietowce (Sarcina) – komórki dzielą się w trzech płaszczyznach do
siebie prostopadłych tworząc sześcianki,
 paciorkowce (Streptococcus) – komórki układają się w krótsze lub
dłuższe łańcuszki,
 gronkowce (Staphylococcus) – komórki mogą się dzielić w dwóch lub
trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście
winogron.
Do form cylindrycznych bakterii zaliczamy: pałeczki (np. Pseudomonas),
laseczki
(np. Bacillus),
maczugowce
(Corynebacterium),
prątki
(Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii
cylindrycznych mogą tworzyć charakterystyczne układy przestrzenne:
dwoinki, krótsze lub dłuższe łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie
liter V, X, Y.
Do form spiralnych bakterii zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato
zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki
6
(np. Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się miedzy sobą liczbą
skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów.
Niektóre gatunki bakterii wykazują tendencję do różnorodności
morfologicznej i wielokształtności komórek. Ich komórki mogą różnić się
wielkością i kształtem. Obok form kulistych mogą występować formy
cylindryczne i odwrotnie. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem.
Kształt i układy podpodziałowe bakterii możemy zaobserwować
w preparatach przyżyciowych (np. w mikroskopie kontrastowo-fazowym
lub w ciemnym polu widzenia, a nawet w zwykłym mikroskopie
świetlnym), a także w preparatach utrwalonych, barwionych.
Ściana komórkowa
Ściana komórkowa wszystkich bakterii zawiera peptydoglikan (mureina),
który styka się bezpośrednio z błoną cytoplazmatyczną. Składa się on
z łańcuchów wielocukrowych, połączonych poprzecznie peptydami.
Tworzy się w ten sposób charakterystyczne usieciowanie peptydoglikanu.
Peptydoglikanu jest składnikiem ściany komórkowej wszystkich
tworzących ją bakterii.
Ściana komórkowa jednych bakterii (gramdodatnich) jest stosunkowo
gruba i względnie jednorodna. Zawiera kilkadziesiąt warstw
peptydoglikanu, co może stanowić 90% suchej masy ściany. W ich ścianie
występują ponadto kwasy tejchojowe, lipotejchojowe i białka.
Ściana innych bakterii (gramujemnych) jest cienka i ma budowę
wielowarstwową. Jedną do trzech warstw peptydoglikanu, który stanowi
tylko 10% suchej masy ściany, pokrywa dominujący u nich element - błona
zewnętrzna. Peptydoglikan oddzielony jest od błony zewnętrznej
przestrzenią peryplazmatyczną. Błona zewnętrzna stanowi warstwę
plastyczną ściany komórkowej; zbudowana jest z fosfolipidów, białek,
lipoproteiny Brauna oraz lipopolisacharydu (LPS).
Różnice w budowie ściany komórkowej bakterii są przyczyną różnego ich
barwienia w metodzie opracowanej przez Grama. Stało się to podstawą
do bardzo przydatnego w identyfikacji, a tym samym diagnostyce,
podziału bakterii na gramdodatnie i gramujemne.
7
Otoczka
Bakterie mogą syntetyzować i wydzielać na zewnątrz ściany
zewnątrzkomórkowe substancje o charakterze polimerów. Jeśli polimer
tworzy zbitą warstwę, ściśle otaczającą komórkę i jest mocno z nią
związaną – nazywamy go otoczką. Polimer tworzący luźną warstwę,
swobodnie przylegającą do powierzchni komórki, łatwo tracony
i znajdowany w pożywce, w której wzrastają bakterie nazywamy śluzem.
Otoczka może obejmować jedną lub dwie komórki. Warstwa śluzowa
obejmuje zwykle wiele komórek bakteryjnych. Bakteryjne otoczki i śluzy
najczęściej mają charakter polisacharydów. Otoczki tylko niektórych
bakterii mają strukturę polisacharydowo-peptydową lub peptydową.
Otoczki są tworzone w naturalnych miejscach bytowania bakterii.
W przypadku bakterii chorobotwórczych, w organizmie człowieka lub
zwierząt. Można je zobaczyć w barwionych (np. metodą Grama)
preparatach wykonanych z zakażonych tkanek. W organizmie otoczki
odgrywają ważną rolę ochronną przed aktywnością układu
immunologicznego. Tylko niektóre spośród tych bakterii wytwarzają
otoczki także w hodowlach sztucznych. Sprzyja temu duża zawartość
cukrów w pożywce.
Otoczki trudno się wybarwiają, należy zastosować specjalne metody.
Z hodowli najczęściej ogląda się je w preparatach barwionych metodą
pozytywno-negatywną, w zwykłym mikroskopie świetlnym.
W przypadku badania materiałów klinicznych otoczki mają ważne
znaczenie, gdyż ich skład u drobnoustrojów je wytwarzających (np.
Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis czy otoczkowych
Haemophilus influenzae) jest ważną cechą charakterystyczną i umożliwia
identyfikację serologiczną patogenów (także po ich rozpadzie
np. wykrywanie antygenów otoczkowych w płynie mózgowordzeniowym), a także określenie serotypów w obrębie poszczególnych
gatunków. Stosuje się tu testy lateksowe i niekiedy, metodę pęcznienia
otoczek w obecności specyficznych przeciwciał.
8
Przetrwalniki
Formy przetrwalne (endospory) tworzą tylko nieliczne bakterie. Spośród
bakterii związanych z człowiekiem są to laseczki z rodzajów Bacillus
i Clostridium. Powstają one w wyniku różnicowania się komórek
wegetatywnych – jeden przetrwalnik powstaje z jednej komórki. Proces
ten nazywamy sporulacją. Cechą charakterystyczną przetrwalników jest
stan uśpienia metabolizmu i znacznie większa niż u form wegetatywnych
oporność na działanie czynników fizyko-chemicznych. Przetrwalniki
zawdzięczają oporność swojej unikatowej budowie: płaszczom
zewnętrznemu i wewnętrznemu, z którymi wiąże się oporność na czynniki
chemiczne oraz korze, która w dużym stopniu decyduje o oporności na
wysoką temperaturę. Wiele bakterii (laseczek) odpowiedzialnych za
choroby u ludzi, bytuje w środowisku w postaci przetrwalników. Stąd
dostają się do organizmu w postaci aerozoli lub po urazach – z glebą.
Przetrwalnik w środowisku nieożywionym zachowuje przez długi czas
żywotność, a w dogodnych warunkach (np. w organizmie) kiełkuje
w komórkę wegetatywną, która wytwarza toksyny i enzymy
odpowiedzialne za chorobotwórczość tych bakterii.
W warunkach hodowli laseczki wytwarzają przetrwalniki w późnej jej fazie.
Można je wtedy oglądać w preparatach. Przetrwalnik może mieć kształt
kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie, podbiegunowo lub
biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą lub większą od
wymiaru porzecznego komórki. W przypadku, gdy jest większa, powoduje
zniekształcenie komórki, nadając jej charakterystyczny kształt.
Przetrwalniki nie barwią się zwykłymi metodami. Można je obserwować
w komórkach nie zabarwionych, szczególnie dobrze w mikroskopie
fazowo-kontrastowym, gdzie są widoczne jako struktury silniej załamujące
światło niż reszta komórki. Można je również obserwować w preparatach
barwionych np. metodą Grama. W zabarwionej komórce widać wtedy
bezbarwny przetrwalnik. Jeśli właśnie powstaje, jest czasami zabarwiony,
a gdy zostanie już uwolniony z komórki widoczny jest w preparacie jako
twór bezbarwny, czasem z cieniutką warstewką barwnika na obwodzie.
9
Ziarnistości zapasowe
W komórkach niektórych bakterii gromadzone są w cytoplazmie materiały
zapasowe, nazywane też wtrętami cytoplazmatycznymi lub ciałami
zapasowymi. Mają one charakter polimerów, które gromadzone są
w komórce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji
odżywczych, a zużywane w warunkach głodu. Do najczęściej
występujących
u
bakterii
ciał
zapasowych
należy
kwas
poli-β-hydroksymasłowy. Bakterie mogą także gromadzić polimery glukozy
– skrobię, glikogen. Wśród bakterii związanych z człowiekiem,
najważniejsze są występujące u bakterii grupy Maczugowate ziarnistości
polimetafosforanowe, które zbudowane są z nieorganicznych fosforanów.
Nazywamy je także wolutyną. Wykrywane poprzez odpowiednie
barwienie preparatów mają istotne znaczenie taksonomiczne.
Ruch bakterii
Dzięki rzęskom czy włóknom osiowym, które są elementami budowy
niektórych bakterii, zwłaszcza cylindrycznych, bakterie te wykazują
zdolność poruszania się w środowisku płynnym lub półpłynnym, a nawet
w cienkiej warstwie cieczy na podłożu stałym. Wykazanie zdolności ruchu
bakterii może być ważną cechą identyfikacyjną.
W komórkach bakterii występuje najczęściej jeden z trzech typów
urzęsienia: monotrichalny – jedna rzęska na biegunie, lofotrichalny –
pojedyncza rzęska lub ich pęczek na obu biegunach, perytrichalny – wiele
rzęsek dookoła komórki.
Ruch krętków warunkuje włókno osiowe, które składa się z pęczka
włókienek przypominających budową rzęski. Wyrastają one z bieguna
komórki i tworząc włókno osiowe, spiralnie je oplatają.
Barwienie rzęsek jest trudne i kłopotliwe. Dlatego o ich istnieniu
dowiadujemy się pośrednio, obserwując ruch bakterii. W preparatach
„mokrych” w mikroskopie świetlnym najlepiej temu służy preparat
w „kropli wiszącej”. Ruch żywych komórek bakterii można także
obserwować w mikroskopie kontrastowo-fazowym oraz w mikroskopie
10
z ciemnym polem widzenia. Ten ostatni jest szczególnie dogodny dla
obserwacji krętków w przyżyciowych preparatach.
Metody
Mikroskopowanie
Drobne wymiary bakterii sprawiają, że do oglądania ich komórek musimy
korzystać z mikroskopu. Żywe komórki bakterii najczęściej obserwujemy w
mikroskopie fazowo-kontrastowym i z ciemnym polem widzenia.
Preparaty trwałe, barwione różnymi metodami, ogląda się w zwykłym
mikroskopie świetlnym lub mikroskopie fluorescencyjnym.
Mikroskop fazowo-kontrastowy przekształca, niewidzialny dla naszego
oka, obraz fazowy na obraz kontrastowy – zróżnicowany pod względem
przechodzącego natężenia światła. Różnice te są rozpoznawalne przez
wzrok ludzki. Struktury silniej załamujące światło będą widziane jako
elementy ciemniejsze na jasnym tle. Mikroskop ten stwarza możliwości
obserwowania żywych, niezabarwionych komórek bakterii, a nawet
pewnych ich struktur, np. przetrwalników, materiałów zapasowych.
W mikroskopie z ciemnym polem widzenia bakterie widoczne są jako
jasne obiekty na ciemnym tle. Efekt taki uzyskujemy dzięki specjalnemu
kondensorowi ciemnego pola, który zapobiega przechodzeniu światła
bezpośrednio do soczewki obiektywu. Obiektyw odbiera tylko promienie
świetlne ugięte przez elementy preparatu. Ten typ mikroskopu używany
jest do oglądania bakterii żywych i ich ruchu.
Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop
świetlny z jasnym polem widzenia, ale komórki nie zabarwione są w nim
źle widoczne, więc stosuje się różne metody barwienia.
Mikroskop fluorescencyjny wyposażony jest w lampę emitującą
promieniowanie UV, co pozwala na oglądanie preparatów barwionych
różnicowo barwnikami fluorescencyjnymi. Mikroskop taki jest bardzo
przydatny w diagnostyce; pozwala na stosowanie metody
immunofluorescencji.
Preparaty zawierające bakterie należy oglądać przy użyciu obiektywu
immersyjnego dającego powiększenie 100 x i okularów powiększających
11
5-10 razy. Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 x),
jakie możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Obiektyw immersyjny
wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć
soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do oglądania preparatów.
Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko preparatu, wpadając do
warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby
soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego
niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania
z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką.
W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego
uszkodzeniem, usuwamy olejek specjalnym zmywaczem.
Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie istotny wpływ ma
oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym,
należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym lusterko
wklęsłe. Preparaty trwałe należy oglądać przy maksymalnie podniesionym
kondensorze.
Preparaty przyżyciowe mające wykazać ruch bakterii, lub zawierające inne
większe niż bakterie elementy można oglądać przy pomocy obiektywu
powiększającego 60 x , wtedy, przy obniżonym kondensorze.
Preparaty przyżyciowe - „mokre”
Preparaty takie mogą być wykonywane bezpośrednio z materiału
klinicznego – wtedy ocenia się obecność w nim leukocytów i bakterii.
W mikroskopie z ciemnym polem widzenia ogląda się przyżyciowo krętki.
Można także oglądać takie preparaty z hodowli. Więcej cech bakterii
w tym niektóre elementy ich struktury, można zobaczyć w mikroskopie
kontrastowo-fazowym.
Preparat w "kropli wiszącej" umożliwia obserwację ruchu bakterii.
Wykonuje się go używając szkiełka podstawowego z wgłębieniem ("łezką")
i szkiełka nakrywkowego.
Wykonanie
Brzeg wgłębienia na szkiełku podstawowym smarujemy cienką warstwą
wazeliny. Na środek szkiełka nakrywkowego nanosimy oczko ezy płynnej
12
hodowli bakteryjnej. Następnie odwracamy szkiełko podstawowe
i przyklejamy je do szkiełka nakrywkowego tak, aby kropla hodowli zawisła
nad wgłębieniem.
Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych
Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach
podstawowych.
Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli stałej, na szkiełko
należy nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo
niewielką ilość zebranej ezą masy bakteryjnej. Powstała zawiesina
powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie
uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem
prawidłowej oceny ich morfologii.
Przygotowanie rozmazu z hodowli płynnej polega na dwu lub trzykrotnym
naniesieniu jej ezą na szkiełko. Każdą kroplę, przed naniesieniem
następnej należy wysuszyć. Trzeba też pamiętać o przepaleniu ezy przed
powtórnym zanurzeniem jej w hodowli.
Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego
powietrza, trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem.
Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu
szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem
metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania.
W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać
w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek
w trakcie pobierania materiału.
Barwienie preparatów trwałych
Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich
zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, jak wymiar,
kształt sposób układania się komórek i pewne struktury anatomiczne.
Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii i odróżnienie ich od
składników otoczenia, w którym się znajdują. Barwniki wykorzystywane
w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwaśne i barwniki
13
zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal,
a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej wykorzystywanych należą:
nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń malachitowa i eozyna.
W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczęściej
wykorzystywanych zaliczamy: fiolet krystaliczny, fuksynę zasadową,
safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji
barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go ze związkami
chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład komórki
bakteryjnej. W pH hodowli zwykle obojętnym lub lekko zasadowym białka
bakteryjne posiadają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe, z którymi też
będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również wykazują ujemne
naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii używa się barwników
zasadowych.
Barwniki kwaśne stosowane są do barwienia tła – otoczenia, w którym
znajdują bakterie. Barwienie komórek bakteryjnych określamy
barwieniem pozytywnym. Barwienie tła, otoczenia, w którym znajdują się
komórki określamy barwieniem negatywnym.
Barwienie metodą Grama
Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym
stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy:
gramdodatnie i gramujemne.
W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki:
 barwnik podstawowy – fenolowy roztwór fioletu krystalicznego
(gencjana);
 zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola);
 odbarwiacz - alkohol etylowy;
 barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny
zasadowej (fuksyna 1:10).
Wykonanie barwienia
- Na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę
roztwór gencjany na 2 minuty;
- preparat spłukać wodą;
- nalać płyn Lugola na 1 minutę;
- spłukać wodą;
14
- odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund;
- spłukać wodą;
- dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny;
- spłukać wodą;
- osuszyć lekko odciskając w bibule.
Wynik barwienia:
Bakterie gramdodatnie – fioletowogranatowe, gramujemne - różowe.
O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy
peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii
gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet
krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem
tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor
fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę
cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną
i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również
odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę
komórkową. Grupa warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich
skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym,
który przez cienką warstwę peptydoglikanu bakterii gramujemnych
wydostaje się na zewnątrz. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia
komórki bakterii gramujemnych na różowo.
Barwienie metodą Ziehl-Neelsena
Barwienie metodą Ziehla-Neelsena umożliwia wykrycie bakterii kwasoalkoholo-opornych (Mycobacterium, Nocardia). Jedynie te przyjmują
i utrzymują w toku barwienia barwnik podstawowy.
W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki:
 barwnik podstawowy - fenolowy roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna
karbolowa);
 odbarwiacz - alkohol etylowy z dodatkiem 3% HCl (alkohol
zakwaszony);
 barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór błękitu
metylenowego (błękit metylenowy).
Wykonanie barwienia
15
- Na ułożony na statywie do barwienia, utrwalony preparat należy nalać
roztworem fuksyny zasadowej i krótko podgrzać szkiełko od spodu
płomieniem palnika. Ukaże się para, gdy zniknie, czynność powtórzyć
jeszcze dwa razy;
- po ostudzeniu preparat należy spłukać wodą;
- zalać preparat zakwaszonym alkoholem i pozostawić do całkowitego
odbarwienia na ok. 1 minutę (czas odbarwiania zależy od grubości
rozmazu);
- spłukać wodą ;
- dobarwić preparat błękitem metylenowym przez 2 minuty;
- spłukany wodą preparat należy wysuszyć odciskając go w bibule.
Wynik barwienia:
Bakterie kwaso-alkoholo-oporne - różowe, inne elementy preparatu, w
tym bakterie inne niż kwaso-alkoholo-oporne – niebieskie.
Barwienie metodą Neissera
Barwienie metodą Neissera umożliwia wykrycie w komórkach bakterii
polifosforanowych (wolutynowych) ziarnistości zapasowych.
W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki:
 barwnik Neissera złożony z dwóch składników łączonych bezpośrednio
przed barwieniem: alkoholowo-wodnego roztworu błękitu
metylenowego (Neisser I) i alkoholowo-wodnego roztworu fioletu
krystalicznego (Neisser II);
 wodny roztwór chryzoidyny.
W barwieniu tym nie spłukujemy barwników wodą.
Wykonanie barwienia
- Przed przystąpieniem do barwienia należy przygotować barwnik Neissera
przez zmieszanie w cylinderku: dwie części barwnika Neisser I i jedną część
barwnika Neisser II;
- na utrwalony preparat należy nalać wymieszany barwnik;
- po 5 minutach dokładnie zlać barwnik, nie spłukiwać wodą;
- nalać na szkiełko roztwór chryzoidyny na 10-15 sekund;
- po zlaniu barwnika preparat od razu odcisnąć w bibule.
Wynik barwienia:
Ziarnistości wolutynowe są granatowoczarne, komórki – żółte.
16
Barwione metodą negatywno-pozytywną
Barwienie metodą negatywno-pozytywną jest jedną z technik wykrywania
otoczek u bakterii.
Zabarwiana jest komórka bakteryjna i innym barwnikiem tło.
W metodzie tej można używać różnych barwników.
Dla zabarwienia komórki - najczęściej stosuje się fuksynę z dodatkiem
fuksyny karbolowej, dla zabarwienia tła - nigrozynę lub kolargol.
Wykonanie barwienia
- Na utrwalony preparat nalewamy: roztwór fuksyny i kilka kropli fuksyny
zasadowej, a następnie leżące na statywie do barwienia szkiełko
podgrzewamy od spodu płomieniem palnika do ukazania się pary;
- po ostudzeniu, preparat należy spłukać wodą i osuszyć w bibule;
- na brzeg szkiełka nanieść kroplę nigrozyny lub kolargolu i rozciągnąć
barwnik równomiernie po powierzchni rozmazu krawędzią drugiego
szkiełka podstawowego;
- preparat wysuszyć w powietrzu.
Wynik barwienia:
Komórka barwi się na różowo, tło jest szare (nigrozyna) lub żółtobrązowe
(kolargol). Otoczka pozostaje bezbarwna.
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Mikroskopowanie i ocena preparatów
Otrzymujesz gotowe preparaty wykonane z hodowli Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, które zabarwione
zostały metoda prostą.
- Nastaw je i obejrzyj pod mikroskopem wykorzystując obiektyw
immersyjny.
- Narysuj obraz preparatów widzianych w mikroskopie.
- Określ powiększenie oglądanych preparatów oraz kształt i sposób
układania się komórek bakteryjnych. Pamiętaj aby w swoich rysunkach
uwzględnić różnice w wielkości komórek oglądanych drobnoustrojów.
Do zapisania swoich obserwacji wykorzystaj poniższe tabele.
17
Obraz mikroskopowy (rysunek)
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Powiększenie:
Opis obraz mikroskopowego
Oglądany
drobnoustrój
Bacillus subtilis
Kształt bakterii
Sposób układania się
komórek
Staphylococcus
aureus
Escherichia coli
18
Zadanie 2.
Identyfikacja na podstawie morfologii komórki
Otrzymujesz hodowlę płynną nieznanych bakterii.
- Wykonaj preparat z tej hodowli, zabarw go metodą Grama i oceń pod
mikroskopem.
- Narysuj obraz mikroskopowy i zapisz obserwacje w tabeli.
- Ile rodzajów bakterii można odróżnić?
- Określ ich kształt, sposób układania się komórek i zabarwienie.
Kształt bakterii i ich układ (rysunek)
Kształt bakterii i ich układ (opis )
19
Zadanie 3.
Barwienie metodą pozytywno-negatywną
Otrzymujesz hodowlę stałą Klebsiella pneumoniae w płytce Petriego.
Bakterie posiane zostały w sposób pasmowy. Wykonaj preparat
z tej hodowli i zabarw go metodą pozytywno-negatywną. Narysuj obraz
widziany pod mikroskopem.
- Czy badany przez ciebie drobnoustrój charakteryzuje się zdolnością
wytwarzania otoczki?
20
- Dlaczego w powszechnie stosowanych metodach barwienia otoczka
pozostaje niewybarwiona?
Zadanie 4.
Kropla wisząca
Otrzymujesz płynną hodowlę Proteus vulgaris, do której dodano kilka
kropli zawiesiny czerwonych krwinek baranich.
- Wykonaj preparat w "kropli wiszącej" i nastaw go pod mikroskopem.
Pamiętaj, że tego typu preparat oglądamy przy obniżonym kondensorze
z wykorzystaniem obiektywu powiększającego 40x lub 60x.
- Oglądając preparat zwróć uwagę na różnicę w wielkości pomiędzy
poruszającymi się bakteriami, a nie wykazującymi ruchu krwinkami
czerwonymi.
21
22
Rozdział 2
Pożywki do hodowli bakterii
Cześć teoretyczna
Czynniki warunkujące wzrost bakterii na podłożach
Bakterie mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają
ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji
budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu.
Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą:
węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki te
wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących komórkę
i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne.
Pewne grupy bakterii, o wysokim stopniu pasożytnictwa, nie są zdolne do
wzrostu, jeśli nie uzyskują gotowych złożonych związków, które nazywamy
czynnikami wzrostowymi. Należą do nich witaminy, szczególnie z grupy B,
które są koenzymami lub grupami prostetycznymi niektórych enzymów.
Inną grupę czynników wzrostowych stanowią aminokwasy oraz zasady
purynowe i pirymidynowe, które wykorzystywane są jako składniki
budulcowe komórki. Czynnikami wzrostowymi niezbędnymi dla niektórych
bakterii są: cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy
tłuszczowe.
Bakterie do wzrostu i mnożenia wymagają znacznych ilości wody.
W wodzie rozpuszczone są związki odżywcze dla bakterii. Woda jest także
środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest
istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość bakterii nie wzrasta, jeśli
zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody
w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%.
Wzrost bakterii zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony
Mg2+, Fe 2+, Ca2+ , Mn 2+, Zn2+ są aktywatorami niektórych reakcji
enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Jony Mg2+
stabilizują strukturę ściany komórkowej bakterii gramujemnych.
Stabilność struktury i prawidłową czynność rybosomów zapewniają jony
23
2+
+
2+
Mg i K . Jony Ca są niezbędne w procesie wytwarzania przetrwalników.
Sole mineralne są również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne
komórki.
Podłoża do hodowli bakterii
Pożywki (podłoża) bakteriologiczne służą do hodowli bakterii
w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża
pozwala na przeniesienie bakterii z ich naturalnych środowisk (organizm
człowieka, gleba, woda) i namnożenie. Zdolność wyrastania bakterii na
określonych podłożach lub jej brak, jest bardzo ważną cechą
diagnostyczną.
Bakterie hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które
umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby
Erlenmayera, probówki). Wzrost i rozwój bakterii na pożywkach pozwala
na ich wyodrębnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych,
biochemicznych i serologicznych. Większość bakterii rośnie na sztucznych
podłożach. Nie ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej wzrost
wszystkim bakteriom.
Pożywki stosowane do namnażania bakterii powinny:
 zawierać odpowiednie składniki pokarmowe,
 mieć odpowiednią wilgotność,
 mieć odpowiednie pH,
 mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,
 być jałowe.
Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy
na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe).
Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na
czystych, chemicznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest
więc zawsze możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują
niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych.
Podłoża złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach
diagnostycznych i naukowych. Są to podłoża zawierające różne składniki,
24
w tym surowce pochodzenia naturalnego, których skład nie jest dokładnie
określony. Składniki pochodzenia naturalnego najczęściej wykorzystywane
w pożywkach złożonych przedstawiono w tabeli 1.
Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli
drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone,
które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach
odżywczych.
Tabela 1. Składniki pochodzenia naturalnego stosowane w pożywkach
złożonych.
Ekstrakty mięsne – wodne wyciągi
bogate źródło azotu, węgla
z tkanki mięsnej, serca, wątroby
i witamin
dobre źródło azotu, węgla,
Ekstrakty z drożdży
bogate źródło witamin z grupy B
Peptony – produkty częściowej,
bogate źródło azotu, węgla
enzymatycznej hydrolizy białek
Hydrolizaty enzymatyczne lub
bogate źródło wolnych
kwasowe kazeiny, białek soi, białek
aminokwasów (azotu), węgla
mięsa.
Białka – kazeina, żelatyna, białka
bogate źródło azotu, węgla,
jaja, surowicy krwi
mikroelementów
Podstawową prostą pożywką płynną jest bulion odżywczy, a stałą agar
odżywczy. Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez
dodanie 1,5-2% agaru do bulionu odżywczego otrzymujemy podłoże stałe.
Agar jest to wielocukier otrzymywany z glonów morskich. Silnie chłonie
wodę, upłynnia się w temperaturze 100°C, a zestala w temperaturze 4548°C. W temperaturze 37°C, a więc optymalnej dla wzrostu większości
bakterii, ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest
wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy
przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek
agarowych.
Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe zawierające
dodatkowe składniki. Elementami wzbogacającymi mogą być:
25
węglowodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew),
hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym
w badaniach mikrobiologicznych podłożem wzbogaconym jest agar
z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej
baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na
płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną „płytkę krwawą”. Innym często
wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy.
Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu
podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa.
Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają stymulująco
lub hamująco na rozwój hodowanych na nich bakterii.
Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy
podzielić na:
- namnażające lub namnażająco-wybiórcze,
- wybiórcze (selektywne),
- diagnostyczne (różnicujące),
- transportowe.
Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej
podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących
w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki,
w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki
hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych.
Pożywki wybiórcze (selektywne) oprócz składników odżywczych zawierają
składniki, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu pewnych
gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikiem
decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu, sole kwasów
żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej podłoża stałe.
Przykładem podłoża wybiórczego może być podłoże LoewensteinaJensena do hodowli prątków gruźlicy.
Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do
identyfikacji, różnicowanie bakterii. Zawierają one substrat diagnostyczny,
który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez określone gatunki
bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźnik, który na przykład
zmienia swoje zabarwienie w zależności od pH pożywki. Dlatego właśnie
rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia pożywki (podłoża
26
stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosłych
kolonii (podłoża stałe).
Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym
dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi.
Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella)
służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże
Chapmana służące do izolacji gronkowców.
Pożywki transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają
wodę i składniki optymalizujące środowisko dla przeżycia bakterii, w tym
roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych pożywek jest
utrzymanie żywotności bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium
mikrobiologicznego.
Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe
i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie
przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas
przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać
samodzielnie, korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym
składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie
pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających
powtarzalność ich składu, pozwalającą na porównywanie wyników
hodowli otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach.
Bezpośrednio po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić
(wysterylizować), stanowią bowiem podłoże wzrostu także dla
drobnoustrojów licznie obecnych w użytych składnikach i otoczeniu.
Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej w autoklawie lub w aparacie
Kocha, a czasem przez przesączenie przez filtr o odpowiednio małych
porach.
Czas hodowli
W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie
podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co
w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Czas generacji (okres
międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komórek
w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą charakterystyczną
27
rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża wzrostowego oraz
warunków środowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu
w laboratorium okresy międzypodziałowe większości bakterii trwają od 20
do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od kilku do kilkunastu
godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak,
aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale dla większości
bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny. Są jednak i takie, które
hodować trzeba przez wiele dni lub nawet tygodni (np. prątki).
Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej
Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli
okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają
się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do
momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub
nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich
metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w specjalnych
bioreaktorach, wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo.
Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod
postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej.
Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność
logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli
i ilustruje wzrost populacji (rycina 1).
Obraz krzywej wzrostu dla większości bakterii jest bardzo podobny
i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas trwania poszczególnych faz
wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii i warunków hodowli.
Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowuj swój
metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość
RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do
podziału.
Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny
metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe.
Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest
okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest
bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie
28
geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej
fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych
i chemicznych czynników środowiskowych.
k
e
r
ó
m
o
k
h
c
y
w
y
ż
y
b
z
c
il
lg
4
5
6
3
1
2
czas hodowli
Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju,
2 – faza przyspieszonego wzrostu, 3 – faza wzrostu logarytmicznego,
4 – faza zwolnionego wzrostu, 5 – faza stacjonarna, 6 – faza zamierania
Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje.
Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba
komórek martwych. Częstość podziałów maleje.
Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się
stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji
pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe.
Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek
spowodowane ich wymieraniem.
Faza szósta – zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się
procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem
własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna
biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych.
29
Ważne definicje
Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy
hodowlą.
Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy hodowlą
mieszaną.
Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego rodzaju (gatunku,
szczepu).
Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku wyróżniająca
się określonymi cechami.
Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komórki nazywamy klonami.
30
Rozdział 3
Otrzymywanie czystych hodowli, ocena morfologii
wzrostu bakterii
Część teoretyczna
Posiew na podłoża
Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy,
płytka agarowa) lub płynne (bulion) jałowymi: ezą, pipetą lub wacikiem.
Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii,
którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum.
Czyste hodowle
W większości przypadków przy badaniu bakteriologicznym materiałów
klinicznych, żywności, wody czy leków spodziewamy się w próbce więcej
niż jednego rodzaju drobnoustrojów. Identyfikacja drobnoustrojów
występujących w badanym materiale, może nastąpić dopiero po ich
wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje
się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocenę
morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, że każda z nich powstaje z jednej
jednostki wzrostowej. A zatem, ile typów kolonii, tyle rodzajów bakterii
w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych gatunków czy nawet
rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym w odróżnieniu kolonii
jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem diagnostycznym. Izolacja
pojedynczej kolonii z takiego posiewu prowadzi zwykle do uzyskania
hodowli czystej.
Morfologia wzrostu bakterii na podłożach
Sposób, w jaki bakterie wyrastają na pożywkach jest ważną cechą, która
może być istotna przy ich identyfikacji.
31
Na podłożach płynnych bakterie wyrastają w postaci jednolitego
zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni
płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie
przy powierzchni, a na granicy faz tworzy się przylegająca do ścianek
naczynia warstwa biofilmu.
Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii bakteryjnych.
Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności
bakterii do wzrostu mgławicowego (to cecha bakterii bardzo ruchliwych).
Kolonię bakteryjną definiujemy jako widoczne makroskopowo na
powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej
jednostki wzrostowej (jtk – jednostka tworząca kolonie; CFU – ang. colony
forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy pojedynczą
komórkę lub kilka komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po
podziale (układ popodziałowy) albo przetrwalnik.
Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż
w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich
identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli.
W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi
cechami.
Metody
Posiewy
Posiewając ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed
i po wykonaniu posiewu. Jeśli używa się jałowych pipet i wacików należy
pamiętać o ich umieszczeniu w odpowiednich naczyniach (np. w słoju
z chloraminą) po zakończeniu posiewu. W trakcie posiewania bakterii na
podłoża płynne należy także pamiętać o opalaniu wylotu naczyń
w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamknięciem. Ma to zapobiec
zakażeniu pożywki drobnoustrojami z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo
osobie pracującej.
Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału
stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia –
probówki lub kolbki.
32
Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki
konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością
inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum
stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać
pipetą wprowadzając np. 5 mL hodowli stanowiącej inokulum do 95 mL
pożywki.
Posiew na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje się w różny
sposób – zależnie od jego celu. Ważnym, często stosowanym przy izolacji
bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest
posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych
sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii.
Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1.
Rycina 1. Posiew redukcyjny
A
C
B
D
33
W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany
na kolejne (zwykle 4) sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed
rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do
takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w
postaci pojedynczych kolonii.
Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to,
że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano
materiał kliniczny – wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą
z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu.
Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który
pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy
porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci
pasma różnej długości.
Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania
wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać
wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana
z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania
odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na
powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina stanowiąca inokulum
w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana.
Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 mL można także rozprowadzić
głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą.
Przy posiewie na podłoże stałe w probówce w postaci skosu agarowego
należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na
powierzchni skosu. Zwykle prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym
ruchem od ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi
naczynia. Półskosy posiewa się wkłuwając ezę w część słupkową,
a dopiero potem wyprowadzając ją zygzakiem po powierzchni skosu ku
wylotowi.
Otrzymywanie czystych hodowli
Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych
próbek sprowadza się do następujących kroków.
34
 Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane
podłoże.
 Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze
optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się
morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie
wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną.
 Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na
oddzielne płytki.
 Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za
czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię.
 Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób)
pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla
wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych czy służących do
określenia
właściwości
fizjologicznych,
biochemicznych
i antygenowych bakterii.
Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli
płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii
w preparatach barwionych metodą Grama.
Opis kolonii
Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na podłożach, które
nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania
zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny
także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych.
Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie
był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo.
W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy:
 wielkość - średnica (mm);
 kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna, ... ;
 brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany, ... ;
 powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, ..;
 wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, grudkowata,
wrastająca w podłoże, ... ;
35



przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna, ... ;
barwę - biała, kremowa, szara, czerwona, ... ;
otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża.
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Otrzymywanie czystej hodowli
Etap I
- Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę
agarową.
- Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny).
- Wykonaj preparat barwiony metodą Grama z posiewanej hodowli.
- Narysuj i opisz obraz mikroskopowy
36
Etap II
- Obejrzyj wykonany wczoraj posiew redukcyjny, zwracając szczególną
uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu.
- Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii.
- Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama
i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki.
- Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę.
Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny).
Kolonia:
Preparat:
Kolonia:
Preparat:
37
Kolonia:
Preparat:
Oceń zgodność otrzymanych obrazów mikroskopowych z preparatem
wykonanym w pierwszym etapie doświadczenia.
Jak oceniasz znaczenie preparatu bezpośredniego z hodowli wyjściowej
dla określenia jej czystości i rodzaju drobnoustrojów w niej się
znajdujących?
38
Etap III
Jeśli na każdej z posianych płytek wyrosną kolonie tylko jednego rodzaju,
o wyglądzie zgodnym z wcześniej wykonanym opisem, otrzymałeś czyste
hodowle tych bakterii – czyli hodowle jednego gatunku pochodzące
z pojedynczej kolonii, a zatem – czyste hodowle poszczególnych szczepów
bakteryjnych.
Zadanie 2.
Ocena morfologii kolonii bakteryjnej
- Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze
kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii
i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza.
- Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając wszystkie jej cechy.
39
40
Rozdział 4
Wymagania wzrostowe bakterii
Część teoretyczna
Wymagania pokarmowe
Bakterie, podobnie jak inne organizmy żywe, potrzebują dostępu do
odpowiednich składników odżywczych, umożliwiających im prawidłowy
wzrost i rozmnażanie.
Wymagania pokarmowe bakterii są bardzo różnorodne, od bakterii
skrajnie wymagających, które mają najmniejsze zdolności biosyntetyczne
i wymagają do wzrostu związków wielkocząsteczkowych, poprzez
stanowiące największą grupę bakterie o wymaganiach pośrednich, do
których zalicza się większość bakterii chorobotwórczych, aż do skrajnie
niewymagających, które wykorzystują jako źródło węgla CO2. Wymagania
pokarmowe są w dużej mierze związane ze stopniem pasożytnictwa
poszczególnych drobnoustrojów.
Źródła węgla i azotu
Węgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmów
żywych. W zależności od źródeł, z jakich bakterie mogą go pozyskiwać
podzielono je na:
 autotrofy czerpiące węgiel tylko z CO2 i przekształcające go do
związków organicznych;
 heterotrofy czerpiące węgiel ze związków organicznych.
Heterotrofy do prawidłowego wzrostu potrzebują w środowisku co
najmniej jednego związku organicznego. Najwięcej drobnoustrojów ma
zdolność do rozkładu glukozy, ale zdarzają się także bakterie mogące
korzystać z mleczanu, bursztynianu, metanu, a także bardziej złożonych
związków, jak lignina czy węglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostały
podzielone na:
41
prototrofy – drobnoustroje o małych wymaganiach
pokarmowych, którym do wzrostu wystarczy jeden prosty związek
organiczny i sole mineralne, co świadczy o ich dużych,
gwarantujących szerokie rozprzestrzenienie, możliwościach
enzymatycznych;
- auksotrofy – drobnoustroje o dużych wymaganiach odżywczych,
rosnące jedynie w obecności co najmniej dwóch związków
organicznych stanowiących źródło węgla i azotu, których nie są
w stanie same syntetyzować, co w znacznym stopniu uzależnia je
od środowiska.
Zarówno prototrofizm, jak i auksotrofizm, mogą być wykorzystywane dla
celów diagnostycznych, na przykład w identyfikacji pałeczek z rodziny
Enterobacteriaceae, czy przy ustalaniu gatunku pałeczek z rodzaju
Haemophilus.
Bakterie auksotroficzne często wymagają do wzrostu specjalnych
czynników wzrostowych, którymi mogą być aminokwasy, puryny
i pirymidyny lub witaminy.
Azot, który jest ważnym pierwiastkiem wchodzącym w skład białek
i kwasów nukleinowych, prototrofy mogą pozyskiwać ze związków
nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanów i azotynów), a auksotrofy
wykorzystują organiczne źródła azotu.
-
Źródła energii oraz donatory elektronów
Drobnoustroje mają zdolność wykorzystywania energii słonecznej lub
energii chemicznej uwalnianej ze związków wysokoenergetycznych.
Pozwala to wyróżnić wśród bakterii:
 fototrofy – które korzystają z energii słonecznej (bakterie
fotosyntetyzujące),
 chemotrofy – korzystające z energii pochodzącej z rozkładu związków
organicznych i nieorganicznych.
W zależności od donatorów elektronów dzielimy bakterie na:
 litotrofy - korzystające z donatorów nieorganicznych,
 organotrofy - korzystające z donatorów organicznych.
42
Zatem, zależnie od wykorzystywanych przez bakterie źródeł energii
i donatorów elektronów, możemy wyróżnić cztery typy pokarmowe:
fotolitotrofy, fotoorganotrofy, chemolitotrofy i chemoorganotrofy.
Bakterie stanowiące florę człowieka i te, które są dla niego
chorobotwórcze, są chemoorganotrofami pozyskującymi węgiel ze
związków organicznych.
Wymagania tlenowe bakterii
Bakterie różnią się pomiędzy sobą zapotrzebowaniem na tlen.
Bezwzględnie tlenowe rosną tylko w jego obecności, bezwzględne
beztlenowe rosną przy jego braku, a względne beztlenowe rosną zarówno
przy dostępie, jak i braku tlenu. Różnice te wynikają ze sposobu
pozyskiwania energii przez bakterie w procesie oddychania. Oddychanie
tlenowe jest możliwe tylko u organizmów, w którym końcowym
akceptorem przenoszonych przez łańcuch oddechowy elektronów jest tlen
cząsteczkowy. W przypadku oddychania beztlenowego końcowym
akceptorem elektronów w łańcuchu oddechowym są związki
nieorganiczne: azotany, siarczany. Możliwe jest jeszcze pozyskiwanie
energii w procesie fermentacji, gdzie akceptorem elektronów jest związek
organiczny.
Bakteriom bezwzględnie tlenowym tlen jest niezbędny do prawidłowego
wzrostu i rozmnażania. W przypadku braku tlenu giną, gdyż przenoszenie
elektronów łańcucha oddechowego zostaje zahamowane i nie jest
magazynowana energia. Bakterie te mają enzymy, które chronią je przed
toksycznym działaniem tlenu. Dysmutaza nadtlenkowa wiąże wolne
rodniki z wodorem, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru. Jest on
rozkładany przez dwa inne enzymy: katalazę i peroksydazę do wody
i tlenu. Do bezwzględnie tlenowych, chorobotwórczych bakterii zaliczane
są m.in. bakterie z rodzajów Mycobacterium, Bacillus, Nocardia.
Bakterie względnie beztlenowe mogą rosnąć zarówno w obecności tlenu,
jak i przy jego braku w środowisku o obniżonym potencjale oksydacyjnoredukcyjnym. Do tej grupy należy wiele bakterii, w tym też chorobotwórczych. Jeżeli tlen jest obecny w środowisku, mogą korzystać z energii
pozyskiwanej w wyniku oddychania tlenowego. Przy braku tlenu mogą
43
przestawić metabolizm na fermentacyjny, jak np.: Escherichia coli lub na
oddychanie beztlenowe.
Bakterie bezwzględnie beztlenowe mogą się rozwijać tylko i wyłącznie
przy braku dostępu do tlenu. Jest on dla nich toksyczny, ponieważ nie
mają żadnych mechanizmów redukujących jego szkodliwe działanie.
Niektóre z nich mogą rosnąć w obecności tlenu, jednak pod warunkiem
obniżenia potencjału oksydacyjo-redukcyjnego poprzez dodanie do
hodowli glutationu, cystyny bądź tioglikolanu sodu. Do tej grupy należą
liczne bakterie chorobotwórcze dla człowieka, m.in. z rodzajów
Clostridium, Bacteroides czy Fusobacterium.
Wymagania temperaturowe bakterii
Temperatura ma istotny wpływ na rozwój bakterii. Każdy ich rodzaj ma
optymalną dla siebie temperaturę, w której wszelkie procesy
metaboliczne prowadzone są najbardziej wydajnie. Temperatury
kardynalne to temperatura minimalna, która wyznacza dolną granicę,
poniżej której wzrost danego rodzaju zanika i maksymalna, która jest
temperaturą, powyżej której bakterie już się nie dzielą. Preferencje
dotyczące temperatury dzielą bakterie na grupy.
Termofile (bakterie ciepłolubne) najlepiej rosną w temperaturze 40°C do
70°C. Bakterie takie jak Geobacillus stearothermophilus, czy
Thermoactinomyces vulgaris żyją w kompoście, glebie, nawozach
organicznych. Znane są także bakterie rosnące w wyższych
temperaturach, np. Thermus aquaticus w 65°C. Znane są i takie, które
mnożą się w temperaturze 90-110°C. Określane są one jako termofile
ekstremalne. Zainteresowanie nimi wynika z możliwości, jakie
ciepłoodporne enzymy tych bakterii stwarzają np. dla biologii
molekularnej.
Mezofile to największa grupa drobnoustrojów, rosnąca w zakresie
temperatur 25-45°C. Wśród nich są bakterie z optimum rozwoju
w temperaturze 37°C, blisko związane z człowiekiem jako patogeny
i komensale (np. rodzaje Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella).
Niektóre z mezofili mogą rosnąć w szerokim zakresie temperatur, jak na
44
przykład dobrze mnożąca się w temperaturze lodówki Listeria spp. –
o
o spektrum od 1 C do 45°C .
Psychrofile to bakterie zimnolubne, których metabolizm najefektywniej
funkcjonuje w niskich temperaturach. Są wśród nich psychrofile względne
o optymalnej temperaturze 20°C, ale mogące też rosnąć w 0°C,
występujące w głębi oceanów oraz psychrofile bezwzględne o istotnym
znaczeniu dla człowieka. Rosną one dobrze w 0°C, mnożąc się w żywności
przechowywanej w chłodniach. Powodują jej psucie i mogą być przyczyną
zachorowań. Należą tu m.in. niektóre gatunki Flavobacterium, Aerobacter,
a także Bacillus czy Lactobacillus.
Metody
Badanie zdolności wykorzystywania cytrynianu jako jedynego
źródła węgla
Określenie przynależności bakterii do prototrofów oraz zbadanie zdolności
do metabolizowania określonego związku organicznego jako jedynego
źródła węgla może mieć znaczenie diagnostyczne. Cechę tę można zbadać
na podłożu Simmonsa. Jest to podłoże stałe, które może zawierać
w swoim składzie cytrynian sodowy lub np. malonian jako jedyne źródło
węgła i siarczan amonowy jako źródło azotu.
Do pożywki dodany jest wskaźnik pH – błękit bromotymolowy, który
w środowisku obojętnym, jakie posiada podłoże wyjściowe, ma
zabarwienie zielone. Na podłożu wyrastają jedynie bakterie, które mają
zdolność wykorzystywania tego organicznego substratu, a alkaliczne
produkty ich metabolizmu – amoniak i aminy zmieniają jego barwę na
niebieską.
Badanie zdolności korzystania z soli amonowych lub
aminokwasów jako źródła azotu
Bakterie posiane na stałe podłoże niezawierające źródła azotu, na które
punktowo (na bibułowych krążkach czy do metalowych cylinderków)
naniesiono odpowiednio roztwory: NH4(SO4)2 i aminokwasów, wyrosną
45
tylko w pobliżu tego źródła azotu, który mogą wykorzystywać. Bakterie
o dużych możliwościach biosyntetycznych (korzystające z formy
nieorganicznej) zazwyczaj także dobrze przyswajają azot organiczny.
Metody hodowli bakterii tlenowych
Tlen jest ważnym czynnikiem warunkującym wzrost bakterii tlenowych
i względnie beztlenowych. Pobierają one tlen rozpuszczony w pożywce.
Dostępność tlenu dla bakterii w hodowlach płynnych możemy zwiększyć
przez ich napowietrzanie. Najprościej osiągnąć to przez energiczne
wstrząsanie lub mieszanie hodowli na mechanicznych wytrząsarkach.
W hodowlach płynnych prowadzonych na skalę przemysłową stężenie
tlenu zwiększa się przepuszczając przez pożywkę powietrze lub tlen.
Metody hodowli bakterii beztlenowych
Obecność tlenu może uniemożliwić wyhodowanie bakterii bezwzględnie
beztlenowych. Jest wiele sposobów usunięcia tlenu z pożywki.
W przypadku pożywki płynnej najprostszym sposobem jest jej
zagotowanie, szybkie schłodzenie i pokrycie powierzchni podłoża płynną
parafiną. Niektóre bakterie beztlenowe dobrze rosną na podłożach
zawierających tkanki zwierzęce jako absorbent tlenu. Wiele bakterii
można też wyhodować na podłożach o obniżonym potencjale oksydoredukcyjnym, co jest osiągane poprzez dodanie odpowiednich związków
chemicznych. W powszechnie używanym podłożu Brewera jest to
tioglikolan sodu, a w podłożu Schaedlera – chlorowodorek cysteiny.
Warunki atmosfery gazowej najlepiej można dostosować do potrzeb
określonych bakterii hodując je w specjalnych, szczelnych słojach,
wewnątrz których atmosferę beztlenową uzyskuje się na drodze reakcji
chemicznej zachodzącej w specjalnych saszetkach (nazwa zależy od jej
wytwórcy). Saszetka zawiera zestaw substancji, z których po jej otwarciu
wydzielane są wodór, CO2 lub mieszanina gazów optymalna dla danych
bakterii. Jeśli wydzielany jest wodór, to reaguje on z tlenem obecnym
w słoju, tworząc wodę. Reakcja ta zachodzi szybko i gwarantuje uzyskanie
warunków beztlenowych. Efektywność tego procesu sprawdza się przy
46
pomocy wskaźnika, błękitu metylenowego, który w warunkach
beztlenowych jest bezbarwny. Odczynniki zawarte w niektórych rodzajach
saszetek wymagają do swojej aktywności zetknięcia z wodą. Aby zwiększyć
szybkość łączenia się wodoru z tlenem stosuje się wtedy katalizator
palladowy umieszczany w specjalnym pojemniku przytwierdzonym do
wieka słoja.
W powietrzu atmosferycznym tlen stanowi 20%. Do namnażania bakterii
mikroaerofilnych stosuje się saszetki, które pozwalają uzyskać środowisko
o niewielkim stężeniu tlenu rzędu 7-10%. Niektóre bakterie wymagają do
swojego optymalnego wzrostu zwiększonego stężenia CO2. Znajdują
wtedy zastosowanie saszetki, które pozwalają na uzyskanie środowiska
o podwyższonym stężeniu CO2 (średnio od 3 do 6%).
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Wpływ warunków gazowych na rozwój bakterii na podłożach stałych
w słojach do hodowli beztlenowców
- Otrzymujesz hodowle bulionowe szczepów: Bacteroides fragilis
i Escherichia coli oraz podłoża – dwie płytki zawierające agar z krwią i dwie
płytki wypełnione stałym podłożem Schaedlera wzbogaconym krwią
(podłoże to stwarza dogodne warunki dla hodowli beztlenowców, gdyż
zawiera składniki obniżające potencjał oksydoredukcyjny).
- Podpisz płytki nazwami drobnoustrojów: agar z krwią i podłoże
Schaedlera dla każdego z drobnoustrojów.
- Zanurz jałowy wacik w hodowli Escherichia coli, odciśnij o ścianki
probówki i posiej metodą redukcyjną na dwie płytki (agar z krwią i podłoże
Schaedlera).
- Szczep Bacteroides fragilis posiej w identyczny sposób.
- Posiewy na płytce krwawej inkubuj w cieplarce (37°C, 20 godzin) –
warunki tlenowe.
47
- Dwie pozostałe płytki (Schaedlera) wstaw do słoja do hodowli bakterii
beztlenowych. Przed zamknięciem słoja włóż do niego saszetkę Gas Pak,
a do jego wieczka przytwierdź papierek wskaźnikowy.
- Zamknij wieko słoja i pozostaw go w temperaturze pokojowej na ok. 30
minut. Zaparowanie słoja (wytworzenie wody) wskazuje na powstanie
atmosfery beztlenowej.
- Posiewy w słoju także inkubuj w cieplarce (37°C, 20 godzin).
- Na podstawie obecności wzrostu określ wymagania tlenowe tych
bakterii.
- Wyniki zestaw w tabeli.
Tabela. Wyniki doświadczenia
Warunki
Określenie
Warunki tlenowe
beztlenowe
wymagań
tlenowych
agar
podłoże
agar
podłoże
z krwią Schaedlera z krwią Schaedlera bakterii
Bacteroides
fragilis
Escherichia
coli
- Jakie znasz związki, które dodane do podłoża wzrostowego będą
obniżały jego potencjał oksydoredukcyjny?
48
Zadanie 2.
Typy pokarmowe bakterii
Uzupełnij poniższą tabelę
Typ
pokarmowy
Źródło energii
Źródło węgla
Donatory
elektronów
Związki
nieorganiczne
CO2 i inne
związki
nieorganiczne
Związki
nieorganiczne
Związki
nieorganiczne
Związki
nieorganiczne
Chemoorganotrofy
Światło
Fotoorganotrofy
Związki
organiczne
49
50
Rozdział 5
Wykorzystanie cech biochemicznych dla
identyfikacja bakterii.
Część teoretyczna
Metabolizm bakterii
Podobnie, jak w innych żywych komórkach, metabolizm bakterii obejmuje
anabolizm (reakcje syntezy) i katabolizm (reakcje rozkładu).
Oba te procesy są ze sobą ściśle powiązane i zachodzą w komórce
jednocześnie. Reakcje rozkładu związków wysokocząsteczkowych
uwalniają energię, która następnie jest magazynowana w ATP.
W pierwszym etapie duże cząsteczki węglowodanów, białek, tłuszczy,
kwasów nukleinowych ulegają degradacji do mniejszych cząstek: heksoz
i pentoz, aminokwasów, glicerolu i kwasów tłuszczowych, nukleotydów.
W dalszych etapach procesów katabolicznych w wyniku licznych przemian
powstają proste cząsteczki, które włączane są w cykl Krebsa będący
końcowym etapem rozkładu. Ostatecznymi produktami są woda,
dwutlenek węgla i energia. Umożliwia to przebieg procesów
anabolicznych wymagających jej nakładu.
Energia uzyskiwana jest przez bakterie w procesach katabolicznych
polegających na utlenianiu biologicznym substratów oddechowych
i przenoszeniu elektronów na odpowiednie akceptory. Najbardziej
wydajnym energetycznie procesem jest angażujące cykl Krebsa
oddychanie tlenowe, w którym protony i elektrony są przenoszone
poprzez łańcuch oddechowy na tlen atmosferyczny. Zdolność bakterii do
oddychania tlenowego ma istotne znaczenie z punktu widzenia ich
identyfikacji, gdyż liczne próby biochemiczne pozwalają na wykrywanie
metabolitów pośrednich cyklu Krebsa oraz obecność enzymów łańcucha
oddechowego.
Oddychanie beztlenowe ma podobny przebieg z tym, że ostatecznym
akceptorem protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym są związki
51
nieorganiczne np.: azotany, azotyny, siarczany. Wykrywanie produktów
ich rozkładu, a także enzymów biorących udział w tych procesach także
wykorzystywane jest w identyfikacji bakterii. Przykładem jest wykrywanie
reduktazy azotanowej przekształcającej azotany do azotynów.
Oddychanie azotowe może angażować jeden z dwóch procesów:
 denitryfikację polegającą na redukcji azotanu do podtlenku azotu
(N2O) oraz uwalnianego do środowiska azotu atmosferycznego.
Bakterie posiadające takie zdolności to m.in.: Pseudomonas
denitrificans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus licheniformis.
 amonifikację polegająca na redukcji azotanów do azotynów,
+
a następnie do amoniaku w formie jonu amonowego NH4 .
Przeprowadzana jest ona m.in. przez: Escherichia coli, Klebsiella
mobilis.
Oddychanie siarkowe polega na redukcji siarczanów bądź siarki do
siarczków. Zdolność do redukcji siarczanów mają bakterie z rodzaju
Desulfovibrio, natomiast siarkę redukują bakterie z rodzaju
Desulfuromonas.
Trzeci z energiodajnych procesów – fermentacja pozwala na
metabolizowanie substratów bez udziału czynnika utleniającego,
w którym utlenienie jednego związku jest równoważone redukcją innego.
Ostatecznymi akceptorami protonów i elektronów są związki organiczne
powstałe jako produkty pośrednie, np.: etanol, mleczan, maślan,
bursztynian, izopropanol. Od tych produktów tworzone są nazwy
fermentacji. W identyfikacji bakterii znaczenie diagnostyczne mają:
fermentacja mlekowa, propionowa, masłowa i mrówkowa.
 Fermentacja mlekowa jest prowadzona przez bakterie mlekowe
(Lactobacillus spp.), ale także inne bakterie, np. gronkowce. Bakterie
mlekowe stanowią florę fizjologiczną przewodu pokarmowego
niemowląt, są wykorzystywane jako probiotyki. Stanowią też
normalną florę pochwy u kobiet.
 Fermentacja propionowa prowadzona jest przez beztlenowe pałeczki
z rodzaju Propionibacterium bytujące w przewodzie pokarmowym
przeżuwaczy, a także na skórze człowieka. Jako produkt podstawowy
tej fermentacji powstaje kwas propionowy.
52


Fermentacja masłowa prowadzona jest przez beztlenowe bakterie
przetrwalnikujące z rodzaju Clostridium, w tym laseczki zgorzeli
gazowej. Jako produkty końcowe tego procesu powstają kwasy
masłowy, octowy, alkohole oraz CO2 i H2.
Fermentacja mrówkowa jest charakterystyczna dla bakterii z rodziny
Enterobacteriaceae. Produktami końcowymi jest wiele związków,
a wśród nich kwasy organiczne, etanol, glicerol, acetoina,
2,3-butandiol, a także CO2 i H2. Możliwe są dwa szlaki przemian, a ich
cechy wykrywa się dla celów identyfikacyjnych. Pierwszy z nich
charakteryzuje się powstawaniem silnych kwasów organicznych, co
obniża pH pożywki poniżej 4,5 (próba Metyl-Red). W innym szlaku
kwasy organiczne mogą powstawać w mniejszej ilości, a głównymi
produktami są acetoina i 2,3-butandiol (próba Voges- Proskauera).
Jako substrat energetyczny bakterie mogą wykorzystywać cukry proste,
oligocukry i cukry złożone. Te ostatnie muszą ulec strawieniu
zewnątrzkomórkowemu przy udziale odpowiednich, produkowanych
przez bakterie enzymów. Dotyczy to m.in. skrobi, glikogenu czy celulozy.
Do komórki transportowane są cukry proste, które wykorzystywane są
jako główne substraty oddechowe. Jeżeli w podłożu znajduje się wiele
substratów, zwykle pierwszym rozkładanym są cukry proste. W przypadku
większości bakterii jest to glukoza.
Bakterie metabolizują węglowodany według trzech szlaków. Pierwszym
jest glikoliza, w wyniku której glukoza utlenia się do kwasu
pirogronowego, przekształcanego w warunkach tlenowych do CO2 i H2O,
natomiast w warunkach beztlenowych podlegającego dalszym
przemianom w procesie fermentacji. Drugi to cykl pentozowy. Jest on
alternatywnym sposobem spalania glukozy u bakterii. Dostarcza on
prekursorów
do syntezy węglowodanów, aminokwasów, kwasów nukleinowych. Trzeci:
szlak Entnera-Doudoroffa, występuje rzadziej, powoduje spalanie glukozy,
ale jest mniej wydajny energetycznie, dostarcza prekursorów do syntezy
nukleotydów. Metabolitem pośrednim tych szlaków jest aldehyd
3-fosfoglicerynowy, przekształcany następnie do kwasu pirogronowego.
53
Kwas ten ulega dalszym przemianom na drodze oddychania tlenowego,
beztlenowego lub fermentacji.
Także białka i lipidy są zbyt dużymi cząsteczkami, aby w stanie
niezmienionym mogły być przyswajane przez bakterie. Muszą one ulec
degradacji w środowisku przy udziale odpowiednich enzymów
proteolitycznych czy lipolitycznych. W rozkładzie białek biorą udział
endopeptydazy rozkładające je do oligopeptydów i egzopeptydazy
odłączające aminokwasy, które podlegają dalszym przemianom. Lipidy są
zwykle degradowane przez esterazy, enzymy o szerokiej swoistości
substratowej. Niektóre bakterie wytwarzają lipazy o wąskiej specyficzności
– na przykład lecytynazę. Obecność tych enzymów u bakterii jest jedną
z cech wykorzystywanych w ich identyfikacji.
Metody
Diagnostyka bakteriologiczna
Standardowe postępowanie zależy od rodzaju materiału i spodziewanych
drobnoustrojów. Zwykle rozpoczyna je charakterystyka mikroskopowa
badanej próbki. Barwienie metodą Grama pomaga ocenić materiał
i wybrać rodzaj podłoża do pierwszego posiewu.
Można posłużyć się metodami fenotypowymi, na które składają się:
 charakterystyka wzrostu na podłożach, na których dokonano izolacji
(pierwszego posiewu materiału);
 otrzymanie czystej hodowli i charakterystyka morfologii kolonii oraz
opis mikroskopowego obrazu komórek bakterii;
 próby biochemiczne badające właściwości sacharolityczne,
proteolityczne, lipolityczne, utleniająco-redukujące;
 badanie
właściwości
serologicznych
(poszukiwanie
charakterystycznych antygenów)
lub metodami genotypowymi (badającymi genom) w których stosuje się
techniki biologii molekularnej i poszukuje charakterystycznych dla danych
bakterii markerów (sekwencji nukleotydów). Znalazły one swoje miejsce w
diagnostyce bakterii odpowiedzialnych za szereg chorób uzupełniając
fenotypowe metody identyfikacyjne, skracając czas badania,
54
a w przypadku drobnoustrojów wolno rosnących na podłożach sztucznych
czy też w ogóle nie dających się na nich hodować stały się niezastąpione.
W określaniu właściwości biochemicznych wykorzystuje się przede
wszystkim reakcje kataboliczne, a więc zdolność rozkładu szeregu
związków, który możliwy jest dzięki obecności w komórkach bakterii
odpowiednich enzymów.
W identyfikacji bakterii przeprowadzanej metodami fenotypowymi, próby
oparte na wykrywaniu cech metabolicznych bakterii odgrywają bardzo
ważną rolę. Bada się źródła węgla i azotu wykorzystywane przez bakterie,
poszukuje enzymów biorących udział w procesach katabolicznych, oznacza
charakterystyczne końcowe produkty metabolizmu. Zwykle diagnostykę
prowadzi się w oparciu o wiele, zwykle kilka lub kilkanaście prób
dobranych specjalnie pod kątem identyfikacji określonych bakterii.
Tworzone są w ten sposób schematy diagnostyczne. Istotne miejsce mogą
w nich mieć także takie cechy, jak morfologia mikroskopowa bakterii
i morfologia kolonii. Dla wielu rodzajów bakterii określa się także
właściwości biologiczne. Wśród nich ważną rolę odgrywa oznaczanie
często występujących u bakterii hemolizyn (typ hemolizy na agarze
z krwią), wytwarzanie enzymów np. katalazy, oksydazy, czy też
charakterystyczne dla mniejszej liczby lub wręcz dla pojedynczych
gatunków próby, takie jak wytwarzanie koagulazy, toksyn i inne. Istotną
pomoc w identyfikacji niektórych bakterii (pałeczki jelitowe, paciorkowce)
stanowią cechy antygenowe wykrywane badaniami serologicznymi.
Próby biochemiczne wykonywane w celu identyfikacji bakterii
W praktyce określa się następujące właściwości biochemiczne:
 związane z metabolizmem azotowym,
 związane z metabolizmem węglowodanów,
 związane z metabolizmem lipidów,
 związane z procesami oddechowymi (enzymy redukująco-utleniające).
Podłoża, na których określa się właściwości biochemiczne, należą do grupy
pożywek diagnostycznych. Niektóre próby biochemiczne wykrywające
obecność tych samych enzymów lub produktów często możemy wykonać
55
w różny sposób. Poniżej przedstawiono kilkanaście podstawowych prób
w najczęściej stosowanych wariantach.
Metabolizm azotowy
Badanie enzymów proteolitycznych
Właściwości proteolityczne - rozkład żelatyny (metoda probówkowa)
Pożywka z żelatyną w temperaturze pokojowej (ok. 22°C) ma konsystencję
stałą, ale w cieplarce (37°C) jest płynna. Posiana bakteriami, które mają
enzym – żelatynazę, po długim zazwyczaj okresie inkubacji ulega stałemu
upłynnieniu i nie daje się zestalić przez obniżenie temperatury.
Właściwości proteolityczne - rozkład kazeiny mleka
Zdolność do wytwarzania kazeinazy sprawdza się posiewając bakterie na
podłoże agarowe z dodatkiem 10% odtłuszczonego mleka. Po 48
godzinach inkubacji w 37°C można zaobserwować przejaśnienie wokół
kolonii produkujących ten enzym.
Badanie rozkładu aminokwasów i wytwarzania produktów ich przemian
Deaminacja fenyloalaniny
W celu sprawdzenia zdolności bakterii do deaminacji fenyloalaniny
posiewa się je na podłoże z dodatkiem D-α-fenyloalaniny. Po 24 godzinach
inkubacji w 37°C nakrapla się 10% roztwór chlorku żelazowego. Zielone
zabarwienie świadczy o wyniku dodatnim. Próbę można wykonać na
podłożu płynnym lub stałym.
Dekarboksylacja aminokwasów na podłożu Falkowa
Podłoże Falkowa wykorzystuje się do badania zdolności bakterii do
dekarboksylacji aminokwasów w warunkach beztlenowych. Wyjściowo ma
ono barwę fioletową, a w swoim składzie zawiera glukozę oraz lizynę,
ornitynę bądź argininę jako substrat i purpurę bromokrezolową jako
wskaźnik. W celu wykonania tego testu bakterie należy posiać na dwie
probówki: jedną z pełnym podłożem Falkowa, a drugą z podłożem
kontrolnym bez badanego aminokwasu. Obie probówki należy pokryć
płynną parafiną. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C ocenia się wynik. Jeśli
po tym czasie oba podłoża są żółte - świadczy to o braku zdolności do
dekarboksylacji w tych warunkach. Za wynik dodatni przyjmuje się żółte
56
zabarwienie probówki kontrolnej i fioletowe probówki zawierającej w
podłożu badany aminokwas. W początkowym etapie wzrostu bakterie
wykorzystują glukozę, co powoduje zakwaszenie podłoża i zmianę jego
barwy na kolor żółty. Późniejsza dekarboksylacja aminokwasu powoduje
ponowną alkalizację podłoża i powrót do barwy fioletowej.
Wytwarzanie indolu z tryptofanu
Badane bakterie posiewa się na wodę peptonową zawierającą
DL-tryptofan. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C na podłoże należy
nawarstwić zmodyfikowany odczynnik Ehrlicha. Zawiera on
p-dimetyloaminobenzaldehyd, alkohol amylowy i stężony HCl. Jeżeli
bakterie rozłożyły tryptofan, pojawia się ciemnoróżowa obrączka w górnej
warstwie pożywki.
Rozkład mocznika
Zdolność bakterii do wytwarzania ureazy – enzymu rozkładającego
mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla bada się na podłożu
Christensena z mocznikiem. W podłożu zawarty jest wskaźnik pH czerwień krezolowa. Powstający amoniak alkalizuje podłoże, co powoduje
zmianę jego zabarwienia z żółtego na różowe.
Wytwarzanie H2S – na podłożu Kliglera
Podłoże Kliglera wykorzystywane jest głównie w diagnostyce bakterii
z rodziny Enterobacteriaceae. Służy ono do oceny wytwarzania przez
bakterie H2S, ale także zdolności rozkładu glukozy i laktozy. Ma ono postać
półskosu o barwie łososiowej. Bakterie należy posiać do słupka i na skos.
Wynik odczytuje się po 24 godzinnej inkubacji w 37°C. Wytwarzany
siarkowodór reaguje z jonami żelaza, a powstający siarczek żelaza
powoduje zaczernienie podłoża.
Metabolizm węglowodanów
Wykrywanie zdolności rozkładu cukrów przez bakterie o małych
wymaganiach
Bakterie posiewa się do probówek zawierających wodę peptonową
z dodatkiem 1% cukru oraz wskaźnik pH: purpurę bromokrezolową
(fioletowa w pH obojętnym; żółta w kwaśnym) lub błękit bromotymolowy
(zielony w pH obojętnym; żółty w kwaśnym). Dodatkowo do probówek
57
wkładane są dnem do góry tzw. rurki Durhama, w których niekiedy
w wyniku rozkładu cukru może zbierać się gaz. Po 24 godzinnej inkubacji
w 37°C rozkład cukru prowadzi do zakwaszenia środowiska i zmiany
zabarwienia podłoża. Zestaw prób dla kilku cukrów nazywa się zwykłym
szeregiem cukrowym.
Podłoże Schaedlera dodatkiem 1% cukru
Podłoże Schaedlera pozwala na ocenę rozkładu cukrów przez bakterie
beztlenowe. Zawiera ono wyciąg mięsny, wyciąg drożdżowy, pepton,
chlorowodorek cysteiny mający na celu obniżenie potencjału oksydoredukcyjnego oraz badany cukier w stężeniu 1%. Posiane bakterie
inkubuje się w warunkach dla nich optymalnych, po czym dodaje się
purpurę bromokrezolową jako wskaźnik pH. W przypadku fermentacji
danego cukru pojawia się, wynikające z zakwaszenia żółte zabarwienie
podłoża.
Wykorzystanie podłoża stałego dla oceny rozkładu laktozy - podłoże
MacConkeya
Podłoże MacConkeya służy do izolacji pałeczek gramujemnych. Zawiera
ono sole żółciowe i fiolet krystaliczny, które decydują o jego słabej
wybiórczości i hamują wzrost bakterii gramdodatnich. Jest to także
podłoże diagnostyczne, gdyż zawarta w nim laktoza, jeśli jest rozkładana
(przez bakterie laktozododatnie), zakwasza środowisko, co manifestuje się
różowym zabarwieniem kolonii zależnym od wskaźnika - czerwieni
obojętnej. Bakterie laktozoujemne rosną w postaci kolonii w kolorze
nieposianej pożywki.
Wykrywanie drogi rozkładu cukru: fermentacja czy utlenianie, na
podłożu Hugh-Leifsona.
Bakterie posiewa się do dwóch probówek ze świeżo przygotowanym,
wygotowanym bezpośrednio przed użyciem podłożem. Powierzchnia,
jednego z nich pokrywana jest płynną parafiną. Podłoże jako wskaźnik pH
zawiera błękit bromotymolowy. W przypadku bakterii nierozkładających
cukru, barwa podłoża się nie zmienia. Natomiast, jeśli bakterie rozkładają
cukier tylko w warunkach tlenowych, zmienia się barwa pożywki
w probówce bez parafiny. Zmiana barwy w obu probówkach świadczy
o wykorzystywaniu cukru na drodze fermentacji.
58
Określanie produktów fermentacji glukozy
- Próba Voges-Proskauera
Bakterie posiewa się na podłoże Clarka. Zawarta w nim glukoza rozkładana
jest do kwasu pirogronowego, a dalej do różnych produktów końcowych
m.in. do acetoiny. Acetoinę wykrywamy po 48-72 godzinach inkubacji
dodając 0,5 mL roztworu KOH, a po wymieszaniu 0,2 mL alkoholowego
roztworu α-naftolu. Hodowlę po ponownym wymieszaniu odstawia się na
15 minut. Pojawiające się karminowe zabarwienie powstaje w wyniku
utlenienia acetoiny w obecności tlenu do diacetylu, reagującego następnie
w obecności α-naftolu z obecną w peptonie resztą guaninową argininy.
- Próba MR (Metyl-Red)
Próbę MR wykonuje się także na podłożu Clarka. Po inkubacji należy
dodać do pożywki kilka kropli czerwieni metylowej. Pojawienie się barwy
czerwonej świadczy o zakwaszeniu podłoża do pH poniżej 4,5 powstałego
wskutek fermentacji glukozy do silnych kwasów organicznych. Barwa żółta
świadczy o pH wyższym niż 4,5 i taki wynik jest uznawany za ujemny.
Metabolizm lipidowy
Wytwarzanie lipaz (esteraz) na podłożu z Tween 80
W celu sprawdzenia zdolności bakterii do wytwarzania lipaz posiewa się je
na płytkę z podłożem agarowym z dodatkiem Tween 80
(polietylenosorbitol jednooleinowy) i chlorku wapniowego. Wynik ocenia
się po 48 godzinach inkubacji. Wokół kolonii bakterii wytwarzających
lipazy pojawia się strefa zmętnienia. Jest ona wynikiem reakcji
uwolnionych przez lipazy kwasów tłuszczowych z obecnymi w pożywce
jonami wapnia, powodującej powstanie nierozpuszczalnych mydeł
wapniowych.
Wytwarzanie lecytynazy na agarze z żółtkiem jaja kurzego
W celu sprawdzenia zdolności do wytwarzania przez bakterie enzymu –
lecytynazy, należy je posiać na podłoże agarowe zawierające żółtko jaja
kurzego. Pojawiająca się po 24 godzinach inkubacji w 37°C strefa
zmętnienia wokół linii posiewu lub kolonii świadczy o wyniku dodatnim.
59
Wytwarzanie enzymów utleniająco-redukujących
Wytwarzanie reduktazy azotanowej
Zdolność bakterii do redukcji azotanów do azotynów można sprawdzić
metodą sulfanilową, posiewając je na pożywkę zawierającą azotan potasu.
Po inkubacji (24 godziny w 37°C) do hodowli dodaje się kilka kropli
odczynnika Griessa. W skład tego odczynnika wchodzą w proporcji 1:1
roztwory kwasu sulfanilowego i α-naftyloaminy w kwasie octowym.
W środowisku kwaśnym kwas sulfanilowy ulega diazowaniu jonami
azotynowymi, po czym łącząc się z α-naftyloaminy daje ciemnoczerwoną
barwę.
Redukcja TTC
Zdolność bakterii do redukowania chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego
bada się na podłożu stałym lub płynnym zawierającym ten substrat. Jest
on redukowany do formazonu, który zabarwia kolonie lub pożywkę płynną
na kolor ciemnoczerwony.
Wytwarzanie katalazy
Katalaza rozkłada H2O2 do H2O i O2. Jej wytwarzanie sprawdza się poprzez
zawieszenie badanych bakterii w kropli 3% wody utlenionej umieszczonej
na szkiełku podstawowym. Można także dodać wodę utlenioną
bezpośrednio do hodowli. Pojawiające się pęcherzyki tlenu świadczą
o obecności katalazy.
Wytwarzanie oksydazy cytochromowej
Enzym – oksydaza cytochromowa odpowiada za przenoszenie elektronów
na tlen w końcowym etapie oddychania tlenowego. Obecność tego
enzymu sprawdza się rozcierając masę bakteryjną pobraną z podłoża przy
użyciu plastikowej pałeczki na pasku bibuły zwilżonym 1% wodnym
roztworem chlorowodorku di- lub tetra-metylo-p-fenylenodiaminy. Nie
należy używać metalowej ezy.
Próbę można także wykonać przez nalanie odczynnika bezpośrednio na
hodowlę bakterii na pożywce stałej. Granatowe zabarwienie świadczy
o wyniku dodatnim testu. Istotne jest przygotowanie odczynnika tuż przed
użyciem poprzez rozpuszczenie w probówce substancji - 10 mg w 1 mL
destylowanej.
60
Redukcja błękitu metylenowego
W stężeniach nietoksycznych dla bakterii błękit metylenowy może, pod
nieobecność tlenu, pełnić rolę sztucznego akceptora protonów. Jest wtedy
redukowany przez niektóre drobnoustroje za pomocą dehydrogenaz do
bezbarwnego leukozwiązku. Próbę przeprowadza się na podłożu płynnym
zawierającym mleko i błękit metylenowy. Hodowle inkubuje się w
temperaturze 37°C przez 48 godzin. Białe zabarwienie pożywki świadczy o
redukcji błękitu metylenowego.
Wytwarzanie fosfatazy
Fosfataza jest enzymem katalizującym odłączanie reszty fosforanowej od
takich związków, jak tłuszcze, białka czy węglowodany. Jej obecność
sprawdza się na podłożu płynnym lub stałym z dodatkiem soli sodowej
difosforanu fenoloftaleiny. O wyniku dodatnim świadczy różowa barwa
powstała po dodaniu kilku kropel NaOH lub stężonego amoniaku. Jest ona
wynikiem odłączenia przez fosfatazę reszty fosforanowej i uwolnienia
fenoloftaleiny.
Badanie zdolności hemolitycznych bakterii
Hemolizyny bakteryjne są cytolizynami, które niszczą krwinki czerwone
ludzi i zwierząt. Zdolność wytwarzania ich przez bakterie można wykazać
na podłożu agarowym zawierającym dodatek 5% odwłóknionej krwi
baraniej lub ludzkiej. Podłoże takie jest jednocześnie podłożem
diagnostycznym, jak i wzbogaconym. Bakterie posiewa się redukcyjnie,
a następnie inkubuje w optymalnych dla nich warunkach. W pobliżu
kolonii wytwarzających hemolizyny pojawiają się charakterystyczne
zmiany. Wyróżnia się dwa typy hemolizy:
 α hemoliza – widoczna jest na płytce krwawej w postaci zielonej strefy
wokół kolonii, co jest wynikiem częściowego rozpadu krwinek
(przekształcenie hemoglobiny do methemoglobiny);
 β hemoliza – widoczna na płytce krwawej jako pełne przejaśnienie
wokół kolonii, powstałe wskutek całkowitej lizy krwinek
i wyługowania barwnika.
61
Wielkość stref hemolizy może być różna dla różnych gatunków czy
szczepów.
Zestawy prób biochemicznych do identyfikacji bakterii
W laboratoriach zajmujących się rutynową diagnostyką mikrobiologiczną
do identyfikacji drobnoustrojów stosowane są gotowe, standaryzowane
zestawy testów biochemicznych. Najczęściej mają one postać płytek
pleksiglasowych z dołkami lub galeryjek z pojemniczkami wypełnionymi
substratami dostosowanymi do identyfikacji danej grupy bakterii. Zmiany
barwy zawartości studzienek po dodaniu badanego szczepu, inkubacji
i jeśli trzeba, odpowiednich odczynników, umożliwiają odczytanie
wyników i przy użyciu książki kodowej zidentyfikowanie zwykle do
gatunku.
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Badanie niektórych cech biochemiczne bakterii wykorzystywanych do ich
identyfikacji
Opisz (narysuj) wszystkie przedstawione na ćwiczeniach demonstracje:
Metabolizm azotowy
62
63
Metabolizm węglowodanowy
64
Metabolizm lipidowy
65
Enzymy oksydoredukcyjne
Właściwości biologiczne
66
Szybkie testy biochemiczne
67
Zadanie 2.
Określanie zapotrzebowań pokarmowych wybranych bakterii. Kwalifikacja
podłoży
- Otrzymujesz hodowle stałe: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Klebsiella mobilis, Salmonella enteritidis oraz pożywki:
- agar z krwią,
- agar z 7% NaCl,
- podłoże MacConkeya,
- podłoże Chapmana.
- Drobnoustroje posiej ezą w sposób redukcyjny (przed posianiem
odpowiednio podpisz płytki).
- Na agar z krwią: S. aureus i S. epidermidis;
- Na agar z 7% NaCl: S. aureus i Klebsiella mobilis;
- Na podłoże Chapmana: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis i Klebsiella mobilis;
- Na podłoże MacConkeya: Salmonella enteritidis, Klebsiella mobilis
i Staphylococcus aureus.
- Inkubuj płytki w 37°C około 20 godzin.
- Oceń posiewy, wyniki wpisz do tabeli.
Rozkład
laktozy
Podłoże
MacConkeya
Wzrost
Rozkład
mannitolu
Podłoże
Chapmana
Wzrost
Hemoliza
Wzrost
Agar
z 7%
NaCl
Agar
z krwią
Wzrost
Drobnoustrój
S.aureus
68
S.epidermidis
K.mobilis
S.enteritidis
Zakwalifikuj podłoża, na które posiewałeś do odpowiednich kategorii:
Podłoże diagnostyczne to:
Podłoże wybiórcze to:
Podłoże diagnostyczno-wybiórcze to:
69
Zadanie 3.
Analiza mieszanej hodowli w podłożu płynnym
Otrzymujesz hodowlę płynną. Scharakteryzuj możliwie jak najdokładniej
znajdujące się w niej bakterie. Badanie będziesz wykonywał przez trzy dni.
Pierwszy dzień badania
Wykonaj preparat z hodowli, zabarw go metodą Grama, oceń pod
mikroskopem.
Narysuj obraz mikroskopowy i zapisz obserwacje w tabeli. Ile rodzajów
bakterii można odróżnić?
Kształt bakterii i ich układ (rysunek)
Kształt bakterii i ich układ (opis)
70
- Posiej redukcyjnie badaną hodowlę na następujące pożywki:
- płytkę agarową,
- płytkę krwawą,
- podłoże MacConkeya,
- Posiewy umieść w cieplarce (37°C) na 20 godzin.
Cechy bakterii
Wymagania odżywcze
płytka agarowa
płytka krwawa
podłoże MacConkeya
Drugi dzień badania
- Oceń posiewy. Wpisz w tabelę najważniejsze cechy bakterii, które
możesz ocenić za pomocą zaproponowanych podłóż.
- Określ wygląd i liczbę rodzajów kolonii na każdej z płytek.
- Wykonaj z poszczególnych kolonii preparaty barwione metodą Grama
i oceń ich obrazy mikroskopowe.
Obserwacje zapisz w skonstruowanej przez siebie tabeli pokazującej
wyniki posiewów mieszanej hodowli na różne podłoża (zależność: rodzaj
podłoża, wygląd kolonii, obraz mikroskopowy)
71
72
- Posiej redukcyjnie różniące się od siebie kolonie na wybrane,
wymienione powyżej pożywki, dobierając je tak, aby zbadać wszystkie
możliwe do określenia cechy biochemiczne badanych bakterii.
- Posiej bakterie, aby następnego dnia móc zbadać wytwarzanie przez nie
tryptofanazy.
- Posiewy inkubuj w temperaturze 37°C przez ok. 20 godzin.
Trzeci dzień badania
- Oceń hodowle na płytkach i odczytaj próbę na indol. Sprawdź, czy
wytwarzana jest katalaza metodą na szkiełku podstawowym.
- Wyniki obserwacji z trzech etapów doświadczenia wpisz do tabeli.
Cechy mikroskopowe
bakterii z badanej hodowli
(wyjściowej)
kształt, układ, barwienie
Cechy fizjologiczne bakterii z badanej
hodowli (wyjściowej)
hemoliza
laktoza
katalaza
indol
73
74
Rozdział 6
Liczenie bakterii
Część teoretyczna
Oznaczenie liczby bakterii ma zastosowanie w wielu dziedzinach
mikrobiologii. Jest ono wykonywane w diagnostyce laboratoryjnej
w ocenie liczby bakterii w moczu, ale także w ocenie czystości
mikrobiologicznej leków, kosmetyków i żywności, w badaniu
bakteriologicznym wody, ścieków, powierzchni produkcyjnych i powietrza,
przy produkcji szczepionek, w kontroli skuteczności działania środków
myjących i dezynfekujących. Oznaczać można całkowitą liczbę bakterii, to
znaczy łącznie komórki żywe i martwe lub tylko liczbę żywych komórek.
Obliczanie całkowitej liczby komórek można wykonać mikroskopowo
przez bezpośrednią obserwację i liczenie komórek bakteryjnych
 w preparacie barwionym,
 w hemacytometrach, np. kamerze Thoma,
 na sączku membranowym, przez który uprzednio przesączono badaną
próbkę o określonej objętości. Bakterie obecne na sączku barwi się
najczęściej błękitem metylenowym lub roztworem erytrozyny.
Metoda stosowana jest na przykład przy badaniu wody i ścieków.
Można też posłużyć się metodami turbidymetrycznymi - porównując
zmętnienie badanych zawiesin z odpowiednimi wzorcami o znanej liczbie
komórek - wzrokowo lub za pomocą fotometru. Przy stosowaniu tych
metod potrzebne są krzywe wzorcowe odnoszące liczbę komórek
(policzonych innymi metodami) do gęstości optycznej zawiesiny.
Całkowitą liczbę bakterii można też określić metodami chemicznymi –
przez oznaczenie całkowitego azotu, fosforu, białek lub kwasów
nukleinowych. Metoda ma zastosowanie głównie w pracach badawczych.
Liczbę żywych, to znaczy zdolnych do podziału, komórek bakteryjnych
oznacza się wymienionymi poniżej metodami hodowlanymi.
75





Metoda posiewu na podłoże stałe (metoda płytkowa) – polega na
liczeniu kolonii po swobodnym (pod wpływem sił grawitacyjnych metoda Kocha) lub wymuszonym (metoda aspiracyjna, uderzeniowozderzeniowa) osiadaniu bakterii na powierzchni podłoża. Metoda
stosowana jest przy badaniu czystości mikrobiologicznej powietrza.
Metoda płytek odciskowych – wykorzystuje podłoże agarowe,
tworzące w płytce Petriego menisk wypukły, który przykłada się na
kilka sekund do badanej powierzchni. Po inkubacji liczy się wyrosłe
kolonie, a wynik ocenia w zależności od przyjętych kryteriów. Metoda
służy do monitorowania mikrobiologicznego skażenia powierzchni
szpitalnych i przemysłowych (ściany, podłogi, sprzęt).
Metoda posiewu powierzchniowego lub głębinowego (płytki lane) jest
najczęściej stosowana w praktyce laboratoryjnej. Dotyczy przede
wszystkim preparatów o spodziewanej dużej liczbie drobnoustrojów,
dlatego konieczne jest wstępne wielokrotne rozcieńczenie badanej
próbki.
Metoda posiewu na podłoże płynne (metoda probówkowa) jest
oznaczeniem najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów
(NPL).
Metoda filtrów membranowych - polega na przesączeniu określonej
objętości badanego płynnego preparatu przez odpowiedni filtr. Filtr
ten nakłada się następnie na powierzchnię podłoża stałego. Po
inkubacji liczy się wyrosłe na sączku kolonie.
Żywe bakterie można zliczyć także innymi metodami. Jedna z nich jest
metodą mikroskopową (bezpośrednia epifluorescencja), w której barwi się
barwnikiem fluorescencyjnym żywe bakterie na sączku membranowym,
przez który uprzednio przesączono badaną próbkę o określonej objętości.
Metoda ta stosowana jest w przemyśle mleczarskim do oceny
bakteriologicznej mleka surowego.
Można także zastosować metody pośrednie. Są to metody szybkie,
ponieważ skracają zwykle 24-48-godzinny (lub dłuższy) okres inkubacji
typowy dla metod hodowlanych, ale wymagają drogiej aparatury
i odczynników.
76
Jedną z nich jest luminometria - pomiar chemiluminescencji lub
bioluminescencji, będącej efektem hydrolizy adenozynotrójfosforanu ATP, obecnego w każdej żywej komórce. Metoda stosowana jest
w kontroli czystości mikrobiologicznej powierzchni produkcyjnych,
urządzeń i rękawic na rękach pracowników w przemyśle spożywczym,
kosmetycznym, farmaceutycznym, przy badaniu żywności, czystości wody
pitnej, a także kontroli skuteczności działania środków myjących
i dezynfekujących.
Można także zastosować metody manometryczne – dokonując pomiaru
zużycia O2 lub wytwarzania CO2 przez rosnące drobnoustroje.
Metoda hodowlana z użyciem pożywki o zmienionych parametrach
elektrycznych pozwala na szybkie wykrycie drobnoustrojów, które
namnażając się wytwarzają silnie zjonizowane metabolity. Znajduje ona
zastosowanie między innymi w biodetektorach służących do oceny
skażenia mikrobiologicznego środowiska.
Każda z tych metod wymaga odpowiedniej standaryzacji, aby pomiar mógł
być ilościowy.
Metody
Standaryzacja zawiesin bakteryjnych
Badania mikrobiologiczne wymagają niekiedy zastosowania standaryzacji
gęstości zawiesin czy hodowli tak, aby do badań używać próbek
o powtarzalnej liczbie bakterii. Najczęściej stosuje się standaryzację
według powszechnie przyjętego wzorca zmętnienia - skali opracowanej
przez McFarlanda. W skład zestawu tej skali wchodzi kilka probówek
zawierających mieszaniny 1% roztworu chlorku baru i 1% roztworu kwasu
siarkowego. Zmętnienie powstałe w wyniku wytrącenia się osadu
siarczanu baru optycznie przypomina bardzo zmętnienie, jakie tworzy
w wodzie zawiesina bakterii. Odpowiednia standaryzacja uzyskana
poprzez liczenie bakterii różnymi metodami pozwoliła przypisać
odpowiedniemu określonemu numerem zmętnieniu wzorca, odpowiednią
gęstość zawiesiny bakterii. Porównania zmętnienia badanej zawiesiny
bakteryjnej ze zmętnieniem w probówkach skali McFarlanda dokonuje się
77
wzrokowo lub przy użyciu prostego, przenośnego nefelometru. Pozwala
ono na oszacowanie liczby bakterii w 1 mL zawiesiny. Ważnym czynnikiem
decydującym o dokładności odczytu jest przygotowanie badanej zawiesiny
w probówce z takiego samego szkła i o takiej samej średnicy, jak probówki
ze wzorcem skali McFarlanda. Ta metoda określania całkowitej liczby
bakterii martwych i żywych jest wykorzystywana przy standaryzacji
zawiesin bakteryjnych przed wykonaniem antybiogramu czy testów
identyfikacyjnych. Wzorce zmętnienia wg skali McFarlanda można
przygotować w każdym laboratorium mikrobiologicznym mieszając
określone objętości roztworu chlorku baru z kwasem siarkowym. Można
także korzystać z gotowych numerowanych wzorców skali McFarlanda
oferowanych przez różnych producentów. Przyjęte numery wzorców
i odpowiadające im wartości CFU/mL podano dalej, w tabeli w zadaniu 1.
Rozcieńczanie hodowli bakterii dla potrzeb liczenia bakterii
żywych
Płyny zawierające dużą liczbę bakterii należy przed posiewem rozcieńczyć
metodą seryjnych rozcieńczeń tak, aby zawierały zawiesiny komórek
policzalnych metodą posiewu. Stopień rozcieńczenia musi być znaczny,
gdyż na płytkę o średnicy ok. 9 cm posiewa się 0,1 mL zawiesiny, a jako
2
osobne (policzalne) może się na niej utworzyć najwyżej 300 (3x10 )
kolonii. Tymczasem hodowla płynna większości bakterii zawiera
przeciętnie 107-1012 komórek bakterii w mililitrze. Najczęściej wykonuje
się szereg kolejnych 10- krotnych rozcieńczeń w postępie geometrycznym.
Rozcieńczenia wykonuje się następująco:
 do szeregu, najczęściej 7 do 12 probówek, nalewa się po 9 mL
fizjologicznego roztworu NaCl;
 do pierwszej dodaje się 1 mL rozcieńczanej zawiesiny;
 następnie przenosi się po 1 mL zawiesiny z probówki do probówki tak
jak pokazuje to schemat na poniższej rycinie;
 z ostatniej probówki, po wymieszaniu 1 mL wylewa się do słoja ze
środkiem dezynfekcyjnym.
Rozcieńczenia wykonuje się przy użyciu szklanych jałowych pipet lub pipet
automatycznych z jałowymi końcówkami. Trzeba pamiętać, aby po
78
wymieszaniu zawartości każdej probówki i przeniesieniu 1 mL do
następnej zmienić pipetę lub końcówkę pipety automatycznej. Unika się
w ten sposób błędu wynikającego z przylegania bakterii do szkła czy
plastiku.
W niektórych sytuacjach wykonuje się szereg 100-krotnych rozcieńczeń.
Wtedy przenosi się po 0,1 mL hodowli do kolejnych probówek
zawierających po 9,9 mL fizjologicznego roztworu NaCl. Ten sposób, choć
wymaga użycia mniejszej liczby probówek, obarczony jest jednak
większym błędem.
Rycina 1. Schemat wykonywania 10-krotnych rozcieńczeń
1 mL hodowli
9 mL roztworu NaCl
wielokrotność
rozcieńczenia
101
102
103
104
105
106
107
108
109
Liczenie bakterii żywych metodą posiewów na podłoże stałe
Liczenie żywych bakterii metodą posiewu na podłoże stałe polega na
liczeniu powstających z nich kolonii. Liczba powstających kolonii
odpowiada liczbie żywych komórek lub dokładniej - liczbie jednostek
tworzących kolonie (jtk; CFU – ang. colony forming units). Liczenia bakterii
żywych dokonuje się metodą posiewu powierzchniowego lub głębinowego
(płytki lane).
79
Posiew powierzchniowy polega na rozprowadzeniu zagiętą ezą lub
głaszczką na powierzchni płytek z podłożem po 0,1 mL wybranych
rozcieńczeń badanego materiału. Na płytki o średnicy większej niż 10 cm
można nanieść odpowiednio więcej zawiesiny. W wyniku takiego posiewu
uzyskuje się wzrost w postaci kolonii na powierzchni agaru.
Posiew głębinowy polega na wlaniu do jałowych płytek Petriego po 1 mL
zawiesiny z poszczególnych rozcieńczeń, zalaniu roztopionym
i przestudzonym agarem i wymieszaniu. W wyniku takiego posiewu
uzyskuje się wzrost w postaci kolonii zarówno na powierzchni, jak i w głębi
agaru. Kolonie w głębi agaru są znacznie mniejsze i różnią się też kształtem
(często są soczewkowate).
Najczęściej przygotowuje się płytki z trzech ostatnich rozcieńczeń. Aby
zmniejszyć błąd, którym obarczone są obie metody, z każdego
rozcieńczenia sporządza się po trzy płytki, z których wylicza się średnią
liczbę wyrosłych kolonii. Na płytce łatwo odróżnić jako pojedyncze około
300 kolonii, które można policzyć korzystając z licznika kolonii. Gdy na
płytce wyrosło więcej kolonii, należy wyliczyć średnią liczbę kolonii
2
2
przypadającą na 1 cm (zliczając kolonie z 10 cm ). Liczbę kolonii na całej
płytce oblicza się uwzględniając pole jej powierzchni (P = Пr2).
Liczba kolonii wyrosłych na płytce pomnożona przez rozcieńczenie
i przeliczona na 1 mL materiału wyjściowego daje nam liczbę żywych
komórek bakteryjnych w badanej zawiesinie.
Bakterie w zawiesinie można też policzyć metodą Milesa i Misry’ego. Jest
ona modyfikacją posiewu powierzchniowego zalecaną do badania próbek
zawierających około 100 CFU/mL. Przy spodziewanej większej liczbie
bakterii wymagane jest wstępne rozcieńczenie. Z każdego rozcieńczenia
badanego materiału pobiera się małą jego objętość (np. 5-50 L)
i nakrapla w oznaczonym miejscu powierzchni płytki z odpowiednim
stałym podłożem. Po inkubacji ocenia się wzrost bakterii w miejscu
nakroplenia. W przypadku dużej liczby bakterii będzie to wzrost w postaci
„murawy”. Wraz z kolejnymi rozcieńczeniami uzyskuje się wzrost
pojedynczych kolonii. Znając liczbę kolonii, objętość kropli i współczynnik
rozcieńczenia można obliczyć liczbę żywych bakterii w badanym materiale.
80
We wszystkich tych metodach liczbę żywych bakterii w dodanej do
podloża próbce można obliczyć ze wzoru:
Liczba żywych bakterii = liczba kolonii x rozcieńczenie/objętość próbki [mL]
Liczenie bakterii
membranowe
żywych
metodą
sączenia
przez
filtry
Metoda ta służy do określania liczby żywych bakterii w płynach
zawierających niewielką ich ilość. Znalazła ona zastosowanie w oznaczaniu
liczby bakterii w wodzie pitnej, płynnych artykułach spożywczych,
kosmetykach czy lekach zawierających substancje przeciwbakteryjne.
Metodą sączenia przez filtry membranowe możemy oznaczać całkowitą
liczbę bakterii lub, gdy zastosujemy odpowiednie podłoża diagnostycznowybiórcze, określone ich grupy – rodzaje, a nawet gatunki.
Przez filtr membranowy sączona jest próbka o określonej objętości. Filtr
następnie przenosi się na powierzchnię podłoża w płytce Petriego.
Składniki podłoża, dyfundując przez pory sączka, umożliwiają wzrost
w postaci kolonii. Po policzeniu wyrosłych kolonii przelicza się otrzymaną
wartość na jednostkę objętości (np. mL) próbki lub określa liczbę bakterii
w całej objętości sączonego płynu.
W celu zatrzymania na sączku wszystkich bakterii obecnych w badanym
materiale należy zastosować filtr membranowy o wielkości porów
0,22 µm. Na filtrze o wielkości porów 0,45 µm zatrzyma się tylko część
bakterii, ale wszystkie komórki i zarodniki grzybów.
Liczenie bakterii żywych metodą posiewów na podłoże płynne
W metodzie tej, zwanej probówkową, liczbę bakterii ocenia się na
podstawie występowania lub braku wzrostu na pożywkach płynnych, do
których uprzednio wprowadzono odpowiednie objętości rozcieńczeń
badanej próbki.
81
Jest to badanie określające najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) (ang.
most probable number, MPN) bakterii obecnych w preparacie.
Odczytywanie wyników oparte jest na statystycznym obliczeniu
prawdopodobieństwa
występowania
wzrostu
drobnoustrojów
w zależności od ich liczby w próbce. Dokładność metody NPL jest mniejsza
niż innych metod hodowlanych. Metoda NPL jest zalecana tylko
w sytuacji, gdy nie może być zastosowana inna metoda.
Badanie polega na przygotowaniu kolejnych w postępie geometrycznym,
10-krotnych rozcieńczeń badanego preparatu. Następnie próbki każdego
z nich posiewa się, w trzech powtórzeniach, na podłoża płynne. Na
podstawie wzrostu lub jego braku w próbkach z odpowiednich
rozcieńczeń wnioskuje się o ilości bakterii w preparacie. Służą do tego
tablice statystyczne, z których oblicza się najbardziej prawdopodobną
liczbę bakterii (lub grzybów) występującą w jednostce wagowej lub
objętościowej preparatu. Metoda NPL może być zastosowana zarówno do
oceny ogólnej zanieczyszczeń mikrobiologicznych badanego materiału, jak
i w badaniach ukierunkowanych, zmierzających do oznaczenia wybranych
bakterii. Metodę probówkową stosuje się do określenia prawdopodobnej
liczby bakterii grupy coli i/lub Escherichia coli w wodzie. Metoda NPL
wymieniona jest także w Farmakopei Polskiej IX przy badaniu czystości
mikrobiologicznej leków i surowców farmaceutycznych. Stosowana jest
także przy badaniu żywności.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Standaryzacja zawiesin bakteryjnych
- Zmyj ze skosu bakterie: nalej z butelki fizjologiczny roztwór NaCI (do
połowy skosu) i zawieś w nim bakterie mieszając zawartość ruchem
rotacyjnym. Nie wstrząsaj!
- Przelej jałowo zawiesinę do probówki. Twoim zadaniem jest określić
liczbę komórek w 1 mL tej zawiesiny.
82
- Odpipetuj 0,1 mL tej zawiesiny do drugiej probówki zawierającej 9,9 mL
2
roztworu NaCl (uzyskasz rozcieńczenie 10 ).
- Zmętnienie zawiesiny porównaj z wzorcami skali McFarlanda.
- Oblicz liczbę wszystkich bakterii - żywych i martwych w 1 mL badanej
zawiesiny (uwzględnij wykonane rozcieńczenie).
Skala McFarlanda
Numer wzorca standardu
0,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Liczba bakterii (CFU/ mL)
8
1,5 x 10
8
3 x 10
6 x 108
8
9 x 10
1,2 x 109
1,5 x 109
1,8 x109
2,1 x109
9
2,7 x10
9
3 x 10
Zadanie 2.
Liczenie bakterii metodą posiewu powierzchniowego i głębinowego
- Rozcieńcz hodowlę płynną Staphylococcus epidermidis 108 razy.
- W metodzie posiewu powierzchniowego posiej zawiesinę z trzech
ostatnich rozcieńczeń (po 0,1 mL).
- W metodzie posiewu głębinowego z trzech kolejnych rozcieńczeń
pobierz po 1 mL i wykonaj płytki lane.
- Po inkubacji (37°C, 24 godz.) policz kolonie wyrosłe na każdej płytce.
Zwróć uwagę, że w posiewie głębinowym kolonie wyrastają w całej
objętości podłoża.
- Wpisz swoje dane do tabeli.
83
- Uwzględniając rozcieńczenie i ilość posiewanego materiału, oblicz liczbę
bakterii w 1 mL nierozcieńczonej hodowli.
Tabela. Wyniki doświadczenia
Liczba kolonii na płytce
Rozcieńczenie hodowli
w probówce, z której
posiewano
Liczba żywych bakterii
w 1 mL hodowli
Posiew
Posiew
powierzchniowy głębinowy
Posiew
Posiew
powierzchniowy głębinowy
Posiew
Posiew
powierzchniowy głębinowy
1
2
3
Śr
.
- Otrzymane wyniki powinny być zbliżone, wylicz z nich średnią.
84
Zadanie 3.
Liczenie bakterii metodą sączenia przez filtry membranowe
- Używając jałowego zestawu przesącz przez filtr membranowy 100 mL
wody wodociągowej.
- Ułóż filtr (jałową pęsetą) na powierzchni płytki z podłożem
diagnostycznym w taki sposób, aby górna strona sączka, na której zostały
zatrzymane bakterie, zwrócona była ku górze. W przypadku badania
mikrobiologicznego wody, przy poszukiwaniu bakterii grupy coli, możemy
stosować podłoże Endo.
- Po inkubacji (37°C, 24 godz.) policz kolonie wyrosłe na powierzchni
sączka i oceń różnice w ich wyglądzie.
Gramujemne pałeczki z grupy coli: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella
i Enterobacter należące do rodziny Enterobacteriaceae wyrastają
w postaci różowych kolonii. Zwróć uwagę na kolonie o barwie różowokarminowej z metalicznym połyskiem - tak wyrasta Escherichia coli.
W 100 mL wody pitnej wymagana jest nieobecność Escherichia coli
i bakterii grupy coli.
85
Zadanie 4.
Liczenie bakterii w moczu
Badany mocz rozcieńczono 1000x i wysiano powierzchniowo (0,1 mL). Po
24 godzinach inkubacji policzono kolonie. Było ich 84. Podaj liczbę bakterii
w 1 mL moczu.
86
Rozdział 7
Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów,
przekazywanie plazmidów.
Część teoretyczna
Genom bakterii stanowi jego pojedynczy chromosom – nukleoid, a także
elementy pozachromosomalne – plazmidy.
Stanowiące wyposażenie genowe sekwencje DNA bakterii stanowią ich
genotyp. Jest to zapis informacji o wszystkich potencjalnych
możliwościach komórki. Fenotyp to obserwowana, objawiająca się
w określonym środowisku forma ekspresji tego genotypu. Genotyp zatem,
określa granice fenotypu.
Bakterie, w odróżnieniu od organizmów eukariotycznych, mają tylko jedną
kopię swego materiału genetycznego, co sprawia, że jest on bardzo
podatny na wszelkie zmiany.
Źródłem zmian w obrębie genomu i nowej aranżacji genów bakteryjnych
jest horyzontalny transfer genów związany z rekombinacją, a także
mutacje oraz ruchome elementy genetyczne takie, jak plazmidy,
bakteriofagi czy elementy transpozycyjne.
Mutacje i ich naprawa
Mutant to zmieniona postać bakterii, różna od organizmu wyjściowego –
postaci dzikiej. Różnica dotyczy genotypu i może być widoczna także na
poziomie fenotypu.
Zmiany mutacyjne mogą polegać na drobnych uszkodzeniach
pojedynczych nukleotydów (mutacje punktowe), mogą także dotyczyć
dłuższych fragmentów łańcucha DNA (mutacje chromosomowe).
Mutacje punktowe mogą prowadzić do zmiany sensu kodu genetycznego
i powodować wbudowanie innego aminokwasu do białka. Mogą one także
być nonsensowne i niespodziewanie kończyć syntezę białka, ale mogą
także zmieniać ramki odczytu, powodując duże zmiany w syntetyzowanym
87
białku. Te dwa ostatnie rodzaje mutacji punktowych prawie zawsze
objawiają się fenotypowo.
Mutacje chromosomalne prowadzą do zmian w obrębie dużych odcinków
DNA i zazwyczaj są letalne – prowadzą do śmierci komórek.
W czasie replikacji DNA może dojść do mutacji wynikających ze
wstawienia błędnych nukleotydów, czy przesunięcia matrycy w stosunku
do nowo syntetyzowanej nici. Są to mutacje spontaniczne. Występują one
dość rzadko – w jednej na kilka milionów komórek.
Częstość mutacji ulega znacznemu zwiększeniu pod wpływem różnych
czynników, zarówno fizycznych, jak i chemicznych, nazywanych
mutagenami. Ten rodzaj mutacji to mutacje indukowane. Mutacje takie
zachodzą ze znacznie większą częstością – zmutować może nawet jedna
na tysiąc komórek.
Czynnikami mutagennymi mogą być różne związki chemiczne jak też
czynniki fizyczne.
Mutacja, która utrwaliła się w komórce, może ulec odwróceniu – mamy
wtedy do czynienia z mutacją powrotną. Może ona zajść na drodze
rewersji, czyli odtworzenia pierwotnego genotypu lub supresji, czyli
zmiany prowadzącej do odtworzenia jedynie efektu fenotypowego.
Bakterie wykształciły wiele systemów naprawczych i potrafią bardzo
skutecznie bronić się przed uszkodzeniami DNA. Jest kilka mechanizmów
tej naprawy. Wśród nich jest system nazywany SOS. System ten
kontrolowany jest przez wiele genów. Ich produkty naprawiają DNA
generując jednak wiele błędów i prowadząc do nowych zmian
mutacyjnych. Często są one letalne, ale mogą też być korzystne,
umożliwiając adaptację do nowych warunków. W systemie tym działa
polimeraza DNA V zdolna do syntezy krótkich odcinków DNA bez udziału
matrycy.
Plazmidy
Dodatkowe elementy genetyczne występujące w wolnej postaci
w cytoplazmie bakterii to plazmidy. Są one autonomiczną pętlą DNA,
replikującą się niezależnie od nukleoidu i chociaż nie są niezbędne do życia
88
komórki, mogą zwiększyć jej zdolności adaptacyjne do środowiska.
Wielkość plazmidów (liczba par zasad tworzących sekwencje DNA) jest
zróżnicowana. Mogą one być nośnikami wielu genów, a co za tym idzie,
cech komórek. Plazmidy mają określony zakres komórek – gospodarzy,
w których mogą przebywać. Są plazmidy o wąskim zakresie i o szerokim
zakresie gospodarzy (BHR; ang. broad host range), mogące być
przeniesione niemal do każdej bakterii. Plazmidy mogą zawierać
+
kompletny system koniugacyjny (Tra ), który umożliwia im przenoszenie
komórki do komórki na drodze koniugacji. Są to tzw. plazmidy
koniugacyjne.
Szczególnie ważne dla praktyki klinicznej są plazmidy niosące takie cechy,
jak oporności na chemioterapeutyki i antybiotyki, sole metali ciężkich oraz
środki dezynfekcyjne. Przekazanie takich plazmidów z komórki do komórki
może zachodzić między szczepami, gatunkami, a nawet rodzajami bakterii,
prowadząc do rozprzestrzeniania się fenotypu oporności na stosowane
leki przeciwbakteryjne. Znanych jest wiele koniugacyjnych plazmidów
opornościowych określanych jako plazmidy R. Mogą one nosić geny
oporności na szereg antybiotyków jednocześnie. Należy jednak pamiętać,
że geny oporności na antybiotyki mogą być ulokowane także
w chromosomie bakterii, te rozprzestrzeniają się jednak ze znacznie
mniejszą częstością.
Metody
Badanie kancerogenności z wykorzystaniem bakterii
Ze względu na dużą wrażliwość bakterii na czynniki mutagenne i łatwość
manipulacji genami tych organizmów wykorzystuje się je do wykrywania
czy związki, które mają być wprowadzone do użytku człowieka nie mają
właściwości rakotwórczych (kancerogennych). Właściwości te bowiem
ściśle korelują ze zdolnością do powodowania mutacji (prowokowania
mutagenezy).
Popularnym testem stosowanym w takich badaniach jest test
skonstruowany w latach 70-tych przez Ames’a – amerykańskiego
genetyka. Pozwala on ocenić czy badany związek jest mutagenem,
89
a nawet określić siłę działania mutagennego. Podstawą testu są
odpowiednio skonstruowane szczepy Salmonella Typhimurium (np.TA97a,
TA98 i TA102) mające mutacje różnych typów, uniemożliwiające im
wytwarzanie w komórkach histydyny (są więc auksotrofami określanymi
jako His-). W formie dzikiej bakterie te są prototrofami (His+) zdolnymi do
syntezy tego niezbędnego do życia aminokwasu.
Mutacje w szczepach są różnych typów: punktowe, dotyczące
pojedynczych nukleotydów albo przesuwające otwartą ramkę odczytu.
Mutanty te są ponadto szczególnie wrażliwe na działanie mutagenów ze
względu na zwiększoną przepuszczalność ściany i upośledzenie
mechanizmów naprawczych.
W warunkach doświadczenia hodowle tych szczepów miesza się
z badanym związkiem w środowisku, w którym nie ma histydyny. Jeżeli
działanie badanej substancji spowoduje mutacje, będą one
wielokierunkowe, a wśród nich pojawią się i takie, które zniosą działanie
pierwotnej mutacji na drodze rewersji lub supresji i dadzą szansę syntezy
histydyny, a tym samym wzrostu kolonii tego szczepu na podłożu bez tego
aminokwasu. Im więcej takich kolonii, tym silniejsze działanie mutagenne
badanego związku.
W teście Ames’a do badanych mieszanin dodaje się frakcję mikrosomalną
wątroby, zawierającą enzymy zdolne przekształcać badaną substancję tak,
jak to się dzieje w organizmie człowieka. Pozwala to wykryć
kancerogenność także tych związków, które cechę tę zyskują dopiero po
transformacji metabolicznej.
W badaniu stosuje się kontrolę pozwalającą każdorazowo obliczyć liczbę
rewertantów powstających spontanicznie, bez obecności badanej
substancji.
Test Ames’a można przeprowadzić w sposób klasyczny posiewając
zawiesiny bakterii na płytki Petriego ze stałym podłożem minimalnym
pozbawionym histydyny. O mutacji powrotnej świadczy zdolność
wyrastania bakterii w postaci kolonii.
Test Ames’a fluktuacyjny przeprowadza się w minimalnym podłożu
płynnym, niezawierającym histydyny, w 96 lub 384-dołkowych płytkach
titracyjnych. Do podłoża dodany jest wskaźnik barwny wskazujący na
mnożenie się szczepu. O rewersji świadczy zmiana barwy podłoża w dołku.
90
Oprócz testu Ames’a są także systemy badania mutagenności
wykorzystujące inne bakterie, np. Escherichia coli i jej mutanty niezdolne
do rozkładania laktozy i tym samym wykorzystywania jej jako jedynego
źródła węgla lub mutanty, które utraciły zdolność do syntezy tryptofanu.
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Wykrywanie mutantów spontanicznych opornych na streptomycynę
wśród komórek hodowli pałeczki okrężnicy (Escherichia coli).
- Wylej po 100 μL płynnej hodowli badanych bakterii na dwie płytki:
- z podłożem Muellera-Hintona zawierającym 50 μg/mL streptomycyny,
- z tym samym podłożem bez antybiotyku
i rozprowadź materiał na powierzchni płytki zagięta ezą.
- Po inkubacji w cieplarce 37°C przez 20 godzin oceń wzrost na obu
płytkach i policz kolonie mutantów opornych na streptomycynę.
9
Przy założeniu, że w hodowli wyjściowej E. coli było około 10 żywych
komórek w mililitrze, oblicz częstość mutacji spontanicznej (C).
C = liczba mutantów w mL/ liczba wszystkich komórek w mL
91
Zadanie 2.
Otrzymywanie indukowanych promieniami UV mutantów Proteus
mirabilis ze zmienioną strukturą ściany komórkowej
Bakterie gramujemne, do których należy pałeczka odmieńca (P. mirabilis),
są z natury oporne na fiolet krystaliczny, który nie wnika do żywych
komórek. Zmiana struktury ściany komórkowej umożliwia dotarcie
barwnika do wnętrza komórek, powodując ich śmierć.
- Zbierz wacikiem z hodowli agarowej „dzikiego” szczepu P. mirabilis
bakterie rosnące w pobliżu położonego na płytce krążka z fioletem
krystalicznym (na pewno oporne na fiolet).
- Zawieś materiał w fizjologicznym roztworze NaCl.
- Wlej zawiesinę do jałowej płytki Petriego.
- Naświetlaj ją przez 15 sekund pod lampą UV.
- Zanurz wacik w naświetlonej zawiesinie.
- Posiej bakterie na kolejną płytkę, zasiewając dokładnie całą jej
powierzchnię i umieść na środku zasianej płytki krążek nasycony fioletem
krystalicznym
- Po inkubacji w cieplarce 37°C przez ok. 20 godzin zinterpretuj wynik
doświadczenia.
Zaobserwowane zmiany w hodowli naświetlanego UV P. mirabilis
w porównaniu do szczepu „dzikiego”:
92
Zadanie 3.
Wykrywanie mutagenów chemicznych.Test Ames’a (wersja uproszczona)
- Trzy płytki z podłożem minimalnym (bez histydyny) podpisz 1, 2 i K.
- Do dwóch probówek z roztopionym i ochłodzonym do temperatury
ok. 50°C agarem powierzchniowym dodaj:
- do pierwszej: 0,1 mL badanej substancji I,
- do drugiej: 0,1 mL badanej substancji II.
Trzecia probówka stanowić będzie kontrolę (nie dodajemy żadnej
substancji).
Do wszystkich trzech probówek dodaj po 0,1 mL hodowli bulionowej
szczepu testowego Salmonella Typhimurium His-..
- Wylej zawartość probówek na odpowiednie płytki (płytka „K”- kontrola
bez badanej substancji).
- Po zestaleniu w temperaturze pokojowej warstwy agaru
powierzchniowego, wstaw płytki do cieplarki 37°C i inkubuj przez 48
godzin.
+
- Policz wyrosłe kolonie rewertantów His na płytkach 1, 2 i K i oblicz
indeks mutagenności (I) dla badanych substancji:
I= Mi/ Ms
Mi- liczba kolonii rewertantów indukowanych
Ms - liczba kolonii rewertantów spontanicznych
93
Wiedząc, że:
I < 1,7 – substancja nie działająca mutagennie
1,7 ≤ I ≤ 1,9 – substancja o potencjalnym działaniu mutagennym
I > 1,9 – substancja o działaniu mutagennym
wydaj opinię o badanych substancjach.
Zadanie 4.
Wykrywanie mutagenów chemicznych. Test reperacji DNA (wersja
uproszczona)
- Posiej wacikiem materiał z hodowli bulionowej Escherichia coli PolA+
(posiadającej polimerazę DNA) i hodowli Escherichia coli PolA- (bez genu
polimerazy) na całe powierzchnie dwóch płytek agarowych.
- Podziel płytki na trzy sektory i oznacz je: K+, K- i Bz.
- Ułóż w sektorach na powierzchni zasianego agaru krążki bibułowe:
K+ (kontrola pozytywna) – krążek z mitomycyną C (mutagen hamujący
replikację DNA)
K- (kontrola negatywna) – krążek z cefalotyną (antybiotyk blokujący
syntezę ściany komórkowej, nie jest mutagenem)
Bz – badany związek (nanieś na ułożony krążek 10 µL badanej substancji).
94
- Pozostaw dla dyfuzji substancji do podłoża na około 30 minut
w temperaturze pokojowej.
- Umieść płytki w cieplarce 37°C i inkubuj ok. 20 godzin.
Podaj i zinterpretuj wynik doświadczenia
Zadanie 5.
Omówienie doświadczenia ilustrującego przekazywanie czynnika R
in vitro.
Geny determinujące oporność nabytą na antybiotyki są bardzo często
zlokalizowane w plazmidach. Mogą być one przekazywane w procesie
koniugacji od szczepu dawcy do biorcy.
1. Na podstawie antybiogramów oceń lekooporność:
- dawcy” Salmonella Enteritidis R+
95
-
”biorcy” Escherichia coli R-
2. Hodowla płynna po zmieszaniu komórek „dawcy” i „biorcy” (krzyżówka)
i inkubacji w cieplarce będzie zawierać:
96
3. Na płytce zawierającej podłoże minimalne z laktozą (jedyne źródło
węgla) i streptomycynę, na którą posiano hodowlę po krzyżówce, wyrosły
kolonie:
4. Powyższe kolonie przesiano na płytkę z pożywką diagnostyczną
MacConkeya. Zinterpretuj wygląd otrzymanej hodowli:
Jak wyglądają kolonie koniuganta (R+) na tym podłożu i czym jest to
spowodowane?
97
5. Porównaj lekooporność szczepów biorących udział w doświadczeniu:
Bakterie
streptomycyna kanamycyna
ampicylina
tetracyklina
dawca
biorca
koniugant
98
Rozdział 8
Oddziaływanie na bakterie w środowisku.
Dezynfekcja i antyseptyka.
Część teoretyczna
Na kształt ekosystemów istotny wpływ mają czynniki fizyczne takie jak:
temperatura, pH, wilgotność, ciśnienie osmotyczne, potencjał
oksydacyjno-redukcyjny, a także promieniowanie. Związki chemiczne
zawarte w środowisku mają także istotne znaczenie dla różnorodności
i liczebności populacji żyjących w nim mikroorganizmów.
Znajomość stopnia indywidualnej wrażliwości poszczególnych gatunków
bakterii na te czynniki pozwala je namnażać w warunkach laboratoryjnych,
ale także ograniczać ich rozprzestrzenianie, sprawować nad nimi kontrolę.
Temperatura jest jednym z czynników najsilniej oddziałujących na
drobnoustroje. Dla większości bakterii temperatura nieco poniżej 0oC jest
bójcza, gdyż tworzące się kryształki lodu niszczą struktury komórki. Nagłe
obniżenie temperatury do kilkudziesięciu stopni poniżej zera (–70oC),
szczególnie w obecności glicerolu, nie uszkadza komórek i pozwala
zachować żywotność przez długie okresy czasu, co wykorzystuje się przy
przechowywaniu szczepów.
Podwyższenie temperatury otoczenia powyżej maksymalnej temperatury
kardynalnej powoduje śmierć drobnoustrojów. Drobnoustroje różnią się
wrażliwością na podwyższoną temperaturę, większość z nich ginie po 30
minutach ogrzewania w temperaturze około 60oC, jednak niektóre z nich,
a także zarodniki grzybów czy przetrwalniki bakterii, znoszą nawet bardzo
wysokie temperatury.
Inne warunki środowiskowe mogą wpływać na skutek działania wysokiej
temperatury na drobnoustroje. W środowisku wodnym są one bardziej
wrażliwe na wysoką temperaturę niż w stanie wysuszenia. Obecność
węglowodanów, białek i tłuszczów chroni je przed działaniem ciepła, zaś
sole obecne w środowisku mogą podwyższać lub obniżać
ciepłoodporność, zależy to od rodzaju soli i drobnoustroju.
99
Kwasowość środowiska może stymulować lub hamować rozwój
drobnoustrojów. Optymalne dla rozwoju większości drobnoustrojów pH
mieści się w granicach 6,5-7,5. Bakterie chorobotwórcze rozwijają się
najlepiej w pH obojętnym lub lekko alkalicznym, grzyby preferują
środowisko lekko kwaśne, a wirusy zachowują zakaźność w pH 5 do 8.
Niekorzystny dla bakterii odczyn środowiska jest często czynnikiem
wspomagającym procesy dekontaminacji, np. pod wpływem temperatury.
Woda to podstawowy składnik i warunek rozwoju drobnoustrojów, ale
niektóre z nich mogą w stanie wysuszenia przetrwać wiele lat (np. prątki
gruźlicy). Oporność drobnoustrojów na wysychanie zwiększa obecność
w środowisku materii organicznej (materiał kliniczny, żywność,
kosmetyki).Wilgotne środowisko sprzyja procesom dekontaminacji.
Dla ciśnienia osmotycznego drobnoustroje wykazują dużą tolerancję, ale
tylko nieliczne bakterie mogą przeżywać i rozwijać się w środowisku
hipertonicznym. Fakt ten wykorzystuje się w praktyce do konserwacji
produktów spożywczych. Niektóre bakterie mają mechanizmy
adaptacyjne, które pozwalają im na wyrastanie w środowisku o wysokim
stężeniu soli – zjawisko nazywamy halotolerancją. Fakt ten wykorzystuje
się do konstrukcji odpowiednich podłoży wybiórczych. Wysokie ciśnienie
osmotyczne uzyskane dodatkiem cukrów także może stanowić
o wybiórczości podłoży, np. do hodowli grzybów. Są też bakterie, których
wzrostowi sprzyja podwyższone stężenie chlorku sodu – to halofile. Mają
one szczególne wymagania dotyczące stężenia sodu. Potrzeby te
zaspokaja woda morska, która stanowi optymalne środowisko ich
wzrostu.
Promieniowanie ultrafioletowe (UV) i jonizujące działa na drobnoustroje
w zależności od dawki i czasu ekspozycji mutagennie lub letalnie.
Promieniowanie ultrafioletowe działa najsilniej przy długości fali 260 nm.
Jest ono wybiórczo pochłaniane przez zasady purynowe i pirymidynowe
kwasów nukleinowych i powoduje ich uszkodzenie. Największą, chociaż
zróżnicowaną, wrażliwość na działanie promieniowania UV wykazują
formy wegetatywne bakterii, znacznie bardziej oporne są wirusy
i przetrwalniki bakterii, a najbardziej oporne są zarodniki pleśni.
100
Drobnoustroje w otoczeniu człowieka mogą stanowić zagrożenie, które
minimalizuje się stosując następujące zabiegi określane wspólnym
mianem dekontaminacji.
 Dezynfekcja to proces usuwania drobnoustrojów ze środowiska
i powierzchni przedmiotów. Zakłada się, że w procesie dezynfekcji
giną formy wegetatywne bakterii i grzybów chorobotwórczych,
a ilość pozostałych drobnoustrojów ulega maksymalnemu
zmniejszeniu. Zatem dezynfekcja nie eliminuje wszystkich
niepożądanych drobnoustrojów, w tym przetrwalników czy
niektórych wirusów. Procesem prowadzącym do usunięcia
wszystkich form życia z określonego materiału jest sterylizacja,
której dokonuje się specjalnymi metodami (rozdział 9).
 Dezynfekcję, powinna poprzedzać, jeśli to możliwe, sanityzacja.
Polega ona na zmniejszeniu liczby drobnoustrojów na
przedmiotach i skórze za pomocą środków myjących
i czyszczących.
 Antyseptyka
to
eliminacja
lub
hamowanie
rozwoju
drobnoustrojów na żywych tkankach – skórze i błonach
śluzowych.
 Aseptyka to zgodne z określonymi procedurami postępowanie,
które ma na celu zapobieganie zakażeniu. Takie postępowanie
obowiązuje w laboratoriach mikrobiologicznych, w medycynie
zabiegowej, aptekach, zakładach farmaceutycznych oraz
produkujących kosmetyki i żywność, także w gabinetach
kosmetycznych. W pracy aseptycznej wykorzystuje się procesy
sanityzacji, dezynfekcji i sterylizacji.
 Konserwacja ma na celu zapobieganie rozwojowi drobnoustrojów
i zabezpieczenie produktu przed wtórnym (w czasie użytkowania)
skażeniem. Konserwuje się m.in. żywność, leki, preparaty
biologiczne, kosmetyki.
101
Metody
Dezynfekcja, antyseptyka i konserwacja
Dezynfekcję można przeprowadzać metodami z zastosowaniem
czynników fizycznych (temperatury, promieniowania, filtracji) i przy
użyciu związków chemicznych. W antyseptyce i konserwacji stosuje się
środki chemiczne.
Dezynfekcję można osiągnąć poprzez gotowanie w temperaturze wrzenia
wody (dekoktację) – w ciągu 10 minut ginie większość form
wegetatywnych drobnoustrojów, ale przeżywają przetrwalniki i niektóre
wirusy.
Pasteryzacja – ogrzewanie w temperaturze 62oC przez 30 minut lub
gwałtowne podniesienie temperatury na 15 sekund do 72oC powoduje
zabicie form wegetatywnych drobnoustrojów chorobotwórczych, maleje
także ogólna liczba drobnoustrojów.
Dezynfekcja za pomocą promieniowania UV ze względu na
nieprzenikliwość tego promieniowania jest ograniczona do powietrza
i odkrytych gładkich powierzchni w pomieszczeniach takich jak sale
zabiegowe i operacyjne, boksy aseptyczne.
Działanie ultradźwiękami pozwala na dokładne oczyszczenie sprzętu
(sanityzacja), ale usuwane są także drobnoustroje, z których znaczna część
ginie w wyniku zniszczenia osłon komórkowych. Ta metoda czasem
poprzedza sterylizację w autoklawie.
Znaczne ograniczenie liczby drobnoustrojów w płynach lub gazach
(powietrzu) można osiągnąć przez filtrację. Stopień oczyszczenia zależy od
wielkości porów zastosowanego filtra. Większość bakterii zatrzymywana
jest przez filtry o średnicy porów 0,45 m.
Znanych jest wiele grup związków chemicznych o działaniu
przeciwdrobnoustrojowym. Wybierając najbardziej odpowiedni środek
należy uwzględnić:
- jego właściwości i spektrum działania,
- rodzaj spodziewanych zanieczyszczeń mikrobiologicznych,
102
-
dodatkowe zanieczyszczenie materią organiczną (np. płynami
ustrojowymi, pozostałościami leków, kosmetyków czy żywności),
stopień toksyczności.
Niektóre środki dezynfekcyjne mogą być antyseptykami. Związki
chemiczne, zwane konserwantami, stosowane są w celu przedłużenia
trwałości produktów, przede wszystkim tych, zawierających w składzie
wodę. Tylko nieliczne środki chemiczne mają działanie sterylizujące.
Alkohole działają bakteriobójczo powodując denaturację białek.
Najskuteczniejsze są 70% roztwory wodne. Powszechnie stosowane
alkohole to etanol i izopropanol. Oba wykorzystywane są zarówno do
dezynfekcji, jak i antyseptyki. Używane są także jako środki konserwujące.
Służą również jako rozpuszczalniki innych środków dezynfekcyjnych
i antyseptycznych wzmagając ich aktywność przeciwdrobnoustrojową.
Aldehydy to najskuteczniej działające bójczo związki chemiczne, które
mogą być wykorzystywane także do sterylizacji. Ich działanie polega na
alkilowaniu białek i kwasów nukleinowych. Do dezynfekcji i sterylizacji
narzędzi medycznych używany jest aldehyd glutarowy. Aldehyd
ortoftalowy – nowy związek tej grupy, ma podobne spektrum do aldehydu
glutarowego, ale nie działa drażniąco na oczy i śluzówki nosa i jest stabilny
w szerokim zakresie pH. Stosując go uzyskuje się wysoki poziom
dezynfekcji endoskopów i innych narzędzi stosowanych w medycynie czy
kosmetyce. Aldehyd mrówkowy (formaldehyd) m.in. ze względu na
przykry zapach ma ograniczone zastosowanie, ale użyteczne okazały się
jego kondensaty z innymi związkami. Zachowują one aktywność
formaldehydu przy zredukowanym działaniu drażniącym. Jako
konserwanty w produktach kosmetycznych stosuje się pochodne
formaldehydu: urotropinę i aminoform.
Jako środki antyseptyczne stosuje się też kwasy organiczne i ich
pochodne, np. kwas salicylowy, borowy czy działający przeciwgrzybowo
kwas undecylenowy. Są one stosowane także jako konserwanty. Mało
toksyczny kwas benzoesowy używany jest do konserwacji żywności. Jego
hydroksypochodne (estry: parabeny, nipaginy) są skuteczne przeciw
103
grzybom i bakteriom i są powszechnie stosowane jako konserwanty
w kosmetykach.
Pochodne biguanidyny – chlorheksydyna i aleksydyna to środki, które
znalazły zastosowanie głównie jako antyseptyki. Działają bójczo
uszkadzając
błonę
cytoplazmatyczną
komórek.
Działają
przeciwbakteryjnie, ale są nieaktywne w stosunku do prątków gruźlicy
i przetrwalników oraz mają ograniczoną aktywność w stosunku do
grzybów. Spektrum aktywności chlorheksydyny poszerza się w roztworach
alkoholowych lub w połączeniu z czwartorzędowymi związkami
amoniowymi. Aleksydyna znalazła zastosowanie jako składnik preparatów
do pielęgnacji jamy ustnej i stosowanych w okulistyce.
Chlorowce, głównie chlor, jod i ich związki działają skutecznie
i szerokowidmowo na bakterie, grzyby i wirusy. Chlor jako gaz lub składnik
wielu dostępnych komercyjnie związków (jako kwas podchlorawy) jest
szeroko stosowany jako środek dezynfekcyjny. Skroplony chlor jest
używany do dezynfekcji wody i ścieków, a jego połączenia nieorganiczne
(np. podchloryn sodu) i organiczne (np. chloraminy, halazon) są
skutecznymi środkami dezynfekcyjnymi. Jod to jeden z najaktywniejszych
antyseptyków; w postaci J2 działa utleniająco inaktywując białka i enzymy
komórki. Stosowany jest w postaci roztworów alkoholowo-wodnych
(jodyna) lub jodoforów. Jodyna ma szerokie spektrum działania. Jodofory
to połączenia jodu z nośnikami. Mogą nimi być organiczne polimery
zdolne do kompleksowania jodu i jego jonów lub związki powierzchniowo
czynne. Jod jest powoli uwalniany z tych połączeń. Jodofory zachowują
aktywność przeciwdrobnoustrojową, eliminują zaś niekorzystne cechy
preparatów jodu: przykry zapach, barwienie skóry, reakcje uczuleniowe
czy małą stabilność roztworów.
Związki fenolu są stosowane jako środki dezynfekcyjne. Sam fenol nie jest
używany, gdyż jest toksyczny. Dostępnych jest jednak wiele produktów
zawierających jego pochodne: krezole i dwufenole. Są one zwykle
przeznaczone do dezynfekcji podłóg w placówkach służby zdrowia.
Zsyntetyzowano też wiele nowych pochodnych o znacznie
korzystniejszych właściwościach. Najczęściej wykorzystywane to
104
chlorowcoalkilofenole: chlorokrezol (PCMC) – używany jako środek
konserwujący i para-chlorometa-ksylenol (PCMX) – stosowany do
dezynfekcji skóry. Trzy inne: 1-benzyl-4-chlorofenol, 2-fenylofenol
i paraamylofenol stanowią substancje czynne wielu środków
dezynfekcyjnych. Dwufenol – triklosan jest składnikiem mydeł i płynów do
odkażania skóry.
Związki utleniające: nadtlenek wodoru i kwas nadoctowy to silnie
działające środki, które zawdzięczają swą aktywność tworzeniu wysoce
reaktywnych rodników hydroksylowych. Ważną ich zaletą jest
nietoksyczność i zdolność ulegania biodegradacji. Nadtlenek wodoru
(woda utleniona) w stężeniu 3% stosowany jest jako słaby antyseptyk.
Stabilizowane roztwory w stężeniach od 3% do 6% działają skutecznie jako
środki dezynfekcyjne. W wysokich stężeniach (do 35%) i w podwyższonej
temperaturze nadtlenek wodoru działa bójczo, nawet na przetrwalniki.
Kwas nadoctowy ma szersze spektrum działania. Szybko działa bójczo na
bakterie, także prątki oraz grzyby, wirusy i przetrwalniki. Działa w
obecności materii organicznej. Jest zaliczany do chemicznych środków
sterylizujących. Stosowany jest do sterylizacji np. endoskopów, a w
połączeniu z nadtlenkiem wodoru do zimnej sterylizacji urządzeń do dializ.
Niestety powoduje korozję niektórych metali i działa drażniąco.
Związki powierzchniowo czynne można podzielić na kilka grup.
Aktywność przeciwdrobnoustrojową wykazują związki o charakterze
amfoterycznym, działające także jako detergenty. Są bardzo często
wykorzystywane w chirurgii do higienicznego i chirurgicznego mycia rąk,
do dezynfekcji instrumentów medycznych i odkażania podłóg
w szpitalach.
Najważniejszą
z
punktu
widzenia
aktywności
przeciwdrobnoustrojowej grupą są związki kationowe. Działają one bójczo
na bakterie, grzyby i wirusy osłonkowe. Niestety obecność materii
organicznej zmniejsza ich aktywność. Do najczęściej stosowanych do
dezynfekcji, antyseptyki, a także jako środki konserwujące należą chlorek
i bromek benzalkoniowy i cetrimid (bromek cetylotrimetyloamoniowy).
Wśród innych związków o działaniu przeciwdrobnoustrojowym na uwagę
zasługują organiczne związki azotu: dichlorowodorek oktenidyny (anilid)
105
i izotiocyjanoguanidyna (poliamina). Dichlorowodorek oktenidyny wchodzi
w
skład
preparatów
antyseptycznych
o
silnym
działaniu
przeciwdrobnoustrojowym, a izotiocyjanoguanidyna należy do nielicznych
związków
inaktywujących
priony.
Popularnym
konserwantem
stosowanym szeroko w kosmetyce jest Katon CG – heterocykliczny
związek o szerokim spektrum przeciwdrobnoustrojowymi dobrze
działający w różnym pH. Działanie odkażające mają także jony metali:
srebra, rtęci, cynku. Szczególnie korzystne działanie ma srebro np.
w roztworach koloidalnych, czy zastosowane w specjalnych opatrunkach.
Sól srebrowa sulfadiazyny znajduje zastosowanie jako środek odkażający
i ściągający w leczeniu oparzeń.
Na rynku dostępnych jest wiele środków dezynfekcyjnych
i antyseptycznych. Zwykle są to połączenia kilku substancji czynnych.
Antyseptyki najczęściej są różnymi połączeniami alkoholi, chlorheksydyny,
bromku lub chlorku benzalkoniowego, w ich skład wchodzą też związki
jodu czy chlorowodorek oktenidyny. Środki dezynfekcyjne zawierają
często związki chloru, a także aldehydy czy fenole. Wiele produktów
zawiera te same substancje czynne, choć składniki towarzyszące mogą
wyraźnie podnosić ich skuteczność i nadawać im szczególne cechy.
Związki stosowane jako środki konserwujące zawsze stosuje się
w mieszaninie kilku preparatów. Zwiększa to zakres ich działania, co jest
szczególnie ważne wobec oczekiwanej skuteczności w stosunku do
bakterii, ale także pleśni i grzybów chorobotwórczych.
Badanie środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych
Środki te ocenia się metodami mikrobiologicznymi, uwzględniając różne
czynniki wywierające wpływ na ich działanie. Trzeba wziąć pod uwagę:
naturalną oporność drobnoustrojów, spodziewaną ich liczbę, warunki
(temperaturę, pH) w jakich związek będzie stosowany, obecność
zanieczyszczeń (szczególnie organicznych) oraz określić stężenie
stosowanego środka i czas ekspozycji.
Badania takie przeprowadza się w laboratoriach przed wprowadzeniem
nowych środków do obrotu. Aktywność tych związków określa się
106
wyznaczając ich najniższe stężenia hamujące wzrost drobnoustrojów –
MIC (ang. minimum inhibitory concentration) i najniższe stężenie
powodujące śmierć drobnoustrojów – MBC (ang. minimum bactericidal
concentration) w mg/L lub g/mL.
W przypadku środków dezynfekcyjnych rozpuszczalnych w wodzie stosuje
się metodę oceny skuteczności ich działania bakteriobójczego znaną jako
„metoda zawiesinowa”. Polega ona na sporządzeniu standaryzowanej
zawiesiny testowych drobnoustrojów i wystawieniu jej na działanie
odpowiednich rozcieńczeń badanego związku w określonym czasie
i temperaturze. Drobnoustroje testowe są pochodzącymi ze specjalnie
przechowywanych kolekcji szczepami o naturalnej wrażliwości na związki
chemiczne. Wykorzystuje się bakterie Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, saprofityczne prątki
(Mycobacterium terre) i przetrwalniki Bacillus subtilis oraz grzyby Candida
albicans, Trichophyton sp.
Badanie należy także przeprowadzić w roztworze w obecności albuminy,
co pozwala na ocenę działania środka w środowisku zanieczyszczonym
materią organiczną. Ocena działania bójczego wymaga zastosowania
odpowiednich metod neutralizacji dla zahamowania działania badanego
środka i metod liczenia komórek (CFU), które przeżyły ekspozycje.
Pozwala to na ustalenie takiego stężenia środka, które spowodowało
śmierć wyznaczonej normą liczby komórek drobnoustrojów (np. 99,999%
CFU bakterii). Badanie to można przeprowadzić odnosząc efekty działania
środka badanego do znanego wzorca.
W kolejnym etapie badań nowych preparatów wykonuje się symulację
działania środka w stosunku do drobnoustrojów, którymi skażone są
powierzchnie drobnych przedmiotów (np. metalowych płytek)
w „metodzie nośnikowej”. Po określonym czasie ekspozycji na różne
stężenia badanego środka określa się stopień redukcji liczby komórek
naniesionych na powierzchnię nośnika. Można w ten sposób wyznaczyć
stężenie użytkowe, czyli takie, które pozwoli osiągać odpowiedni poziom
odkażenia w żądanym czasie.
Środki antyseptyczne badane są w podobny sposób przy czym,
w metodzie zawiesinowej przewiduje się inne wielkości redukcji inokulum
107
drobnoustrojów oraz inny czas kontaktu drobnoustrojów z antyseptykiem,
a stężenie użytkowe wyznacza się w teście sztucznego skażenia skóry
ochotników.
W praktyce, na przykład w szpitalach czy w laboratoriach, gdy stosowane
są określone procedury dezynfekcji znanymi środkami, istotne znaczenie
ma ocena skuteczności tych zabiegów. Stosuje się badanie pośrednie,
przez określenie zmniejszenia zanieczyszczenia mikrobiologicznego
powietrza czy powierzchni po zastosowaniu odpowiednich środków.
Najczęściej stosuje się metodę sedymentacji (przy ocenie skuteczności
odkażenia powietrza) i metodę odcisków (przy badaniu powierzchni).
Badanie działania środków konserwujących
Środki konserwujące są stosowane w preparatach farmaceutycznych
i kosmetykach,
szczególnie
konfekcjonowanych
w opakowaniach
wielodawkowych. W badaniu skuteczności działania konserwantów,
potencjalną możliwość skażenia leku z zewnątrz symuluje się przez
dodanie odpowiedniej dawki (inokulum) znanych drobnoustrojów.
Właściwości konserwujące preparatu są zadowalające, jeżeli w zakażonym
pojemniku w określonych odstępach czasu następuje znaczący spadek
lub nie dochodzi do wzrostu liczby żywych komórek drobnoustrojów
testowych. W badaniu wykorzystywane są wrażliwe szczepy bakterii
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i grzybów Candida
albicans, Aspergillus niger.
108
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Badanie bakteryjnego zanieczyszczenia powietrza metodą sedymentacji
- Ustaw otwartą płytkę agarową w wybranym miejscu i pozostaw przez 30
minut.
o
- Zamknij płytkę i umieść w cieplarce o temperaturze 37 C na 24 do 48
godzin.
- Po inkubacji policz wyrosłe na płytce kolonie i określ liczbę
drobnoustrojów w 1 m3 powietrza podstawiając dane do wzoru:
3
Liczba drobnoustrojów w 1 m powietrza = x · 100 · 100/Πr2 · t · 1/5
gdzie
x – liczba kolonii na płytce
r – promień płytki
t – czas ekspozycji
Zadanie 2.
Kontrola bakteryjnego zanieczyszczenia powierzchni metodą odcisków
- Płytkę odciskową przyłóż agarem do suchej kontrolowanej powierzchni
na czas 10 sekund (nacisk 500 g).
o
o
- Zamkniętą płytkę umieść w cieplarce o temperaturze 30 C lub 25 C
i inkubuj 72 godziny, gdy chcesz wyhodować grzyby przedłuż inkubację do
7 dni.
109
- Po inkubacji policz kolonie wyrosłe na płytce (powierzchnia płytki wynosi
2
25 cm ). Porównaj wyniki z normami dla różnych powierzchni.
Zadanie 3.
Określanie skuteczności działania środka antyseptycznego w stosunku do
flory bakteryjnej skóry dłoni
Badanie działania środka antyseptycznego i kontrola liczby bakterii na
skórze nieodkażanej musi być wykonane przez jedną osobę (ilość bakterii
na skórze jest cechą osobniczą zależną od wielu czynników i może wahać
się w znacznym stopniu). Zatem jedna osoba bada kolejno lewą i prawą
rękę.
Ocena liczby bakterii na skórze nieodkażanej:
- Wlej 10 mL bulionu do jałowej płytki Petriego, płucz w nim opuszki
palców jednej ręki przez 1 minutę.
- Określ liczbę żywych bakterii uwolnionych ze skóry do bulionu metodą
posiewu powierzchniowego, przenosząc 0,1 mL bulionu na płytkę krwawą
i równomiernie rozprowadź zagiętą ezą.
Ocena liczby bakterii na skórze dłoni po zastosowaniu środka
antyseptycznego (np. 1% Sterinolu, 0,5% Abacilu w etanolu,
2% Chloraminy lub Manusanu).
- Wlej 10 mL środka antyseptycznego do jałowej płytki Petriego.
- Wlej 10 mL bulionu do drugiej płytki.
- Płucz w środku antyseptycznym opuszki palców nie badanej wcześniej
ręki przez 1 minutę.
- Opłucz palce polewając je jałową wodą i wysusz w jałowym powietrzu
(w pobliżu zapalonego palnika).
- Zanurz opuszki palców w płytce z bulionem i płucz je przez 1 minutę.
110
- Określ liczbę żywych bakterii uwolnionych do tego bulionu metodą
posiewu powierzchniowego tak jak poprzednio.
- Opróżnij płytki z płynów, a pożywki z posiewami umieść w cieplarce
(37oC, ok. 20 godzin).
- Po inkubacji policz wszystkie kolonie wyrosłe na obu płytkach.
- Porównaj liczbę bakterii przed i po działaniu środka antyseptycznego.
- Oceń jego skuteczność
Zadanie 4.
Wrażliwość różnych form bakterii na działanie środków dezynfekcyjnych
- Do probówek zawierających przetrwalniki Bacillus subtilis dodaj po
0,5 mL następujących roztworów środków dezynfekcyjnych:
 0,5% glukonian chlorheksydyny w 70% etanolu
 0,5% glukonian chlorheksydyny w H2O
 0,5% fenol
 70% etanol
 2% aldehyd glutarowy
111
- Inkubuj 60 minut w temperaturze pokojowej.
- Odsiej ezą zawartość poszczególnych probówek
podpisanych nazwą środka dezynfekcyjnego.
- Wstaw buliony do cieplarki 37oC na ok. 20 godzin.
do
bulionów
- Oceń, w których probówkach pojawił się wzrost zapisz w tabeli.
Środek
dezynfekcyjny
Żywotność przetrwalników po ekspozycji na
środki dezynfekcyjne (wzrost)
0,5% chlorheksydyna
w 70% etanolu
0,5% chlorheksydyna
w H2O
0,5% fenol
70% etanol
2% aldehyd
glutarowy
112
Zadanie 5.
Wpływ materii organicznej na aktywność przeciwbakteryjną środków
dezynfekcyjnych
W tym doświadczeniu materię organiczną reprezentować będą
inaktywowane komórki drożdży. W zależności od rodzaju badań zadanie
to spełniać może także albumina, mleko lub wyciąg drożdżowy.
- Dostajesz dwie płytki agarowe, na które odsiejesz zawiesiny po kontakcie
ze środkiem dezynfekcyjnym trwającym 1, 5, 10 i 20 minut (dla mieszaniny
testowej i dla kontroli) – każdą z nich opisz dzieląc na 4 sektory.
- Dostajesz dwie probówki zawierające po 0,5 mL hodowli bulionowej
S. aureus:
- do tej, w której będziesz badać same bakterie dodaj 0,5 mL roztworu
NaCl - to twoja kontrola,
- do tej, w której będą one chronione przez materię organiczną dodaj
0,5 mL zawiesiny inaktywowanych drożdży - mieszanina testowa.
- Do probówki z mieszaniną testową i do kontroli dodaj po 0,5 mL środka
dezynfekcyjnego.
Wymieszaj delikatnie zawartość probówek. Po 1, 5, 10 i 20 minutach
odsiej materiał na odpowiednie sektory płytek. Używaj ezy o oczku tej
samej wielkości i dbaj o pobranie pełnego oczka materiału.
o
- Płytki wstaw do cieplarki 37 C na ok. 20 godzin.
- Oceń wyniki i wpisz je do tabeli używając następujących symboli:
1 - 15 lub mniej kolonii w sektorze
2 - więcej niż 15 kolonii, ale mniej niż wzrost zlewny
3 - wzrost zlewny lub niepoliczalna liczba kolonii
- Wyniki zapisz w tabeli.
113
1 minuta
5 minut
10 minut
20 minut
Mieszanina
testowa
Kontrola
114
Rozdział 9
Sterylizacja
Część teoretyczna
Wyjaławianie (sterylizacja) to proces, którego celem jest uwolnienie
wyjaławianego materiału od form życia w każdej postaci. Oznacza zatem
dekontaminację obejmującą wszystkie drobnoustroje i ich formy.
Wyjaławianie ma podstawowe znaczenie w medycynie, farmacji,
i kosmetologii. W medycynie sterylizacji podlegają wszystkie przedmioty
tzw. wysokiego i średniego ryzyka przeniesienia zakażenia: narzędzia
chirurgiczne, cewniki, wszczepy, oraz sprzęt diagnostyczny mający kontakt
z błonami śluzowymi i uszkodzonymi powłokami.
Zabiegi sterylizacji wymagają często odpowiedniego wstępnego
przygotowania materiałów. Ważny jest też wybór właściwej metody,
stosowanie jej zgodne z procedurami oraz systematyczna kontrola
sprawności urządzeń. Sterylizowane przedmioty muszą być odpowiednio
zabezpieczone (zapakowane), aby po zakończeniu procesu można je było
bezpiecznie przenieść i przechować do chwili użycia.
Metody
Sterylizację wykonuje się stosując metody z wykorzystaniem wysokiej
temperatury (wysokotemperaturowe).
Sterylizacja bieżąca parą wodną – tyndalizacja
Do sterylizacji płynów zawierających termolabilne składniki stosuje się
wyjaławianie parą wodną w ciśnieniu atmosferycznym. Przeprowadza się
je w aparacie Kocha, w którym, w bieżącej parze wodnej osiąga się
temperaturę 100oC. W tej temperaturze w ciągu 60 minut giną wszystkie
formy wegetatywne drobnoustrojów, a przetrwalniki ulegają termicznej
aktywacji i następnie, pozostawione w temperaturze pokojowej, kiełkują.
Po upływie doby, już jako formy wegetatywne zostają zabite w kolejnym
115
cyklu sterylizacyjnym. Aby uzyskać pewność, że materiał jest jałowy
ogrzewamy go po raz trzeci. Metoda ta jest stosowana prawie wyłącznie
do wyjaławiania pożywek mikrobiologicznych.
Sterylizacja parą wodną w nadciśnieniu
Jest to najczęściej stosowana metoda sterylizacji przeprowadzanej
w specjalnych urządzeniach – autoklawach. Zastosowanie nasyconej pary
wodnej w nadciśnieniu 1 Atm. pozwala osiągnąć temperaturę 121oC. Czas
sterylizacji w tych warunkach wynosi 15-20 minut. W ten sposób
sterylizuje się wiele pożywek, a także przedmioty z gumy i tworzyw
o
sztucznych. Przy nadciśnieniu 2 Atm. temperatura pary osiąga 134 C,
a czas potrzebny na wysterylizowanie materiałów wynosi od 3,5 do
7 minut. W tych warunkach jałowi się narzędzia chirurgiczne, bieliznę
operacyjną, szkło i materiały opatrunkowe oraz niektóre pożywki do
hodowli drobnoustrojów.
W autoklawie można wyjaławiać wszystkie termostabilne materiały, do
których ma szansę przeniknąć para wodna. Ma ona właściwości głęboko
penetrujące i w krótkim czasie prowadzi do zabicia drobnoustrojów,
w tym najbardziej opornych na temperaturę wirusów (HBV) oraz
zarodników grzybów i przetrwalników bakterii.
Stosowane jeszcze niekiedy (np. w gabinetach stomatologicznych czy
kosmetycznych) autoklawy przepływowe (grawitacyjne), w których
powietrze wypierane jest przez parę wodną, są zawodne i przestarzałe.
Zastępowane są one przez małe autoklawy próżniowe. Skuteczność
sterylizacji zależy w nich od całkowitego usunięcia powietrza z komory i od
jakości pary wodnej (wody).
Sterylizacja gorącem suchym
Wyjaławianie gorącym suchym powietrzem przeprowadza się
w suszarkach z wymuszonym obiegiem powietrza. Suche powietrze jest
złym przewodnikiem ciepła, sterylizację należy prowadzić w wyższej niż
w autoklawie temperaturze i w dłuższym czasie. Zwykle stosuje się
temperaturę w granicach 160-180oC w czasie do dwóch godzin.
o
Najczęściej stosuje się temperaturę 170 C przez 2 godziny. W takich
warunkach giną wszystkie drobnoustroje i ich przetrwalniki. Metoda ta
116
służy do wyjaławiania szkła, termostabilnych substancji sypkich oraz
olejów i podstaw maściowych. Sterylizacja suchym powietrzem ma
ograniczone zastosowanie i jest kosztowna. Uważana jest za przestarzałą
i w wielu krajach Unii Europejskiej jest już prawie całkowicie wycofana.
Może być z powodzeniem zastąpiona przez inne metody. Skutecznym
sposobem sterylizacji jest spalanie w płomieniu, ale ma ono wąskie
zastosowanie (np. do wyjaławiania ezy, czy niszczenia materiału
zakaźnego).
Sterylizacja promieniowaniem podczerwonym
Jest to sposób sterylizacji o zastosowaniu przemysłowym, ale
konstruowane są nowe urządzenia, które pozwolą na wykorzystanie tego
promieniowania w mniejszej skali. Sterylizacja promieniowaniem
podczerwonym o długości fali 700 nm do 1mm (ang. infrared sterilization)
wykazuje bardzo dużą skuteczność w stosunku do wszystkich
drobnoustrojów w tym wirusów zapalenia wątroby, najbardziej opornych
przetrwalników (tężca, jadu kiełbasianego, Geobacillus stearothermophilus), grzybów i ich zarodników oraz prionów. Sterylizowane przedmioty
umieszczane są w specjalnych metalowych pojemnikach. Cykl
o
sterylizacyjny nie przekracza kilku minut w temperaturze ok. 190 C.
Sterylizowane mogą być praktycznie wszystkie materiały.
Procesy sterylizacji mogą być przeprowadzane także w niskich
temperaturach (metody niskotemperaturowe).
Sterylizacja gazowa
W przemyśle medycznym sterylizacja gazowa jest stosowana
do wyjaławiania różnego sprzętu medycznego, w tym jednorazowego
użytku wykonanego z materiałów termolabilnych. Przy zastosowaniu
tlenku etylenu w przeszłości stosowano mieszaninę tego gazu z nośnikiem
(np. CO2) Obecnie urządzenia wykorzystują czysty (100%) tlenek etylenu
a proces zachodzi w podciśnieniu co zwiększa jego bezpieczeństwo. Wadą
procesu jest bowiem toksyczność gazu i stosunkowo długi czas trwania
procesu. Zaletą metody jest dobra penetracja gazu zapewniająca dużą
skuteczność oraz trwałość tworzyw sztucznych w warunkach sterylizacji.
117
Sterylizację można także przeprowadzać formaldehydem. Stosuje się jego
mieszaninę z parą wodną. Zwykle stosuje się 2-5% formaldehydu oraz
parę wodną do wilgotności przekraczającej 70%. W urządzeniach nowej
generacji proces zachodzi w temperaturze około 45oC w czasie 2-4 godzin.
Metoda ta wykorzystywana jest w warunkach szpitalnych do sterylizacji
giętkich endoskopów. Formaldehyd ma jednak słabe właściwości
penetrujące i niszczy niektóre materiały np. gumę.
Sterylizacja radiacyjna
Źródłem wykorzystywanego w tej metodzie promieniowania gamma są
zazwyczaj izotopy promieniotwórcze. Promieniowanie stosowane
w dużych dawkach nieodwracalnie niszczy DNA i błony komórkowe
drobnoustrojów. Proces zachodzi w temperaturze pokojowej, ale dla
preparatów labilnych można temperaturę znacznie obniżyć. Metoda jest
kosztowna, ale często stosowana w przemysłowej sterylizacji sprzętu
medycznego, materiałów opatrunkowych, materiałów implantacyjnych.
Sterylizacja plazmowa
Wytwarzana w warunkach próżni w polu magnetycznym plazma jest
zjonizowanym gazem, otrzymywanym z nadtlenku wodoru. Proces
o
odbywa się w temperaturze 40-60 C, co pozwala na sterylizację sprzętu
medycznego wrażliwego na wysokie temperatury, a więc trudnego do
wysterylizowania innymi metodami. Penetracja plazmy do wnętrza
urządzeń nie jest jednak najlepsza i na przykład dla sterylizacji endoskopu
trzeba wprowadzać porcje plazmy bezpośrednio do światła przewodu. Po
około godzinie sprzęt jest gotowy do użycia, co jest ważną zaletą tej
metody.
Filtracja
Filtracja to przepuszczanie płynów lub gazów przez filtry o porach na tyle
małych, aby zatrzymać drobnoustroje. Metoda ta jest powszechnie
stosowana, a szczególnie przydatna do wyjaławiania ciepłochwiejnych
płynów. Jej zaletą jest usuwanie żywych i martwych drobnoustrojów i ich
przetrwalników, a także zanieczyszczeń mechanicznych. Najczęściej
wykorzystywane są sączki membranowe. Najbardziej popularne filtry
118
o średnicy porów od 0,22 μm i 0,45 μm zatrzymują tylko grzyby i bakterie,
ale są i filtry o porach mniejszych (aż do 0,01 μm), które mogą także
zatrzymywać wirusy dając gwarancję pełnej sterylności. Filtry
membranowe znalazły zastosowanie w aptekach, zakładach
farmaceutycznych, szpitalach, także do filtracji powietrza w salach
operacyjnych, gabinetach zabiegowych czy boksach do pracy aseptycznej.
Metody kontroli urządzeń sterylizujących
Niesterylność pożywek może wynikać z niewłaściwie przeprowadzonego
procesu ich sterylizacji, wadliwie działających urządzeń sterylizujących lub
być wynikiem późniejszego zakażenia w wyniku nieprzestrzegania zasad
aseptyki w trakcie ich przechowywania lub wykonywania posiewów.
Urządzenia sterylizujące muszą podlegać okresowej kontroli. Skuteczność
procesu sterylizacji bada się za pomocą wskaźników fizycznych,
chemicznych i biologicznych.
Wskaźniki fizyczne - termometry, manometry, zegary, mierniki
wilgotności, mierniki zawartości gazu i inne przyrządy wmontowane do
urządzenia sterylizującego informują tylko o jego stanie technicznym.
Mierzą punktowo dany parametr. Oprócz obserwacji wskazań tych
przyrządów, coraz częściej stosuje się system rejestracji podstawowych
parametrów fizycznych w postaci wydruków, wykresów lub raportów.
Wskaźniki chemiczne zawierają substancje chemiczną, która trwale
zmienia swoje zabarwienie, kiedy zostaną osiągnięte właściwe parametry
sterylizacji. Testy te mają postać rurek, pasków czy taśm. Wskaźniki
chemiczne informują jedynie, czy w danym cyklu pracy zostały osiągnięte
warunki sterylizacji, nie dają one gwarancji, że poddany sterylizacji
materiał został wyjałowiony. W tak zwanych wskaźnikach
jednoparametrowych zmiana barwy następuje pod wpływem osiągnięcia
jednego z parametrów sterylizacji, najczęściej temperatury. Nie wykazują
one jednak, jak długo ta temperatura się utrzymywała. Chemiczne
wskaźniki wieloparametrowe wykazują, że w trakcie sterylizacji zostały
osiągnięte wartości wszystkich lub kilku (przynajmniej dwóch)
119
parametrów sterylizacji. Informują one zatem o prawidłowości przebiegu
procesu sterylizacji.
Wskaźniki biologiczne - zawierają określoną liczbę żywych, zdolnych do
przejścia w formy wegetatywne, wysoce opornych na działanie
temperatury przetrwalników bakteryjnych. Wykorzystywane są
przetrwalniki Geobacillus stearothermophilus lub Bacillus subtilis zawarte,
odpowiednio w zestawach testowych Sporal A (kontrola autoklawów)
i Sporal S (kontrola suszarek). Wskaźniki te informują o fakcie zabicia
przetrwalników. Wskaźniki biologiczne dają gwarancję jałowości - jeżeli
użyte w teście przetrwalniki zostały zabite oznacza to, iż zostały zabite
wszystkie
bardziej
wrażliwe
drobnoustroje
zanieczyszczające
sterylizowany materiał.
Dla uzyskania pełnej informacji o urządzeniu niezbędne jest
monitorowanie procesu sterylizacji za pomocą wszystkich trzech metod.
Skuteczność urządzeń sterylizujących powinna być kontrolowana przy
użyciu wskaźników fizycznych i chemicznych w czasie każdego procesu
sterylizacji. Ponadto okresowo należy je kontrolować przy użyciu
wskaźników biologicznych.
Zdania do wykonania
Zadanie 1.
Wpływ promieniowania UV na bakterie
W tym doświadczeniu bakterie (Escherichia coli) będą eksponowane
na działanie promieniowania UV przez okres 1 minuty i przez 30 minut.
- Opisz dwie płytki agarowe (nazwa bakterii, czas naświetlania – 1 min.,
30 min.)
- Zanurz waciki w hodowli płynnej Escherichia coli, odciśnij nadmiar płynu
o ścianki probówki i zasiej nimi gęsto całą powierzchnię płytek agarowych.
120
- Przykryj część posianej powierzchni płytki układając na niej jałową pęsetą
papierowy szablon.
- Naświetlaj pod lampą UV powierzchnię otwartych płytek: jednej
przez 1 minutę, drugiej przez 30 minut.
- Po naświetlaniu zdejmij jałową pęsetą szablony i wrzuć je do słoja
z chloraminą.
o
- Umieść płytki w cieplarce (37 C na ok. 20 godzin).
- Po inkubacji oceń działanie promieniowania UV na Escherichia coli
po różnym czasie ekspozycji.
Jaki czas naświetlania jest konieczny do zabicia bakterii?
Jakie są jego zalety i wady tego promieniowania?
121
Zadanie 2
Kontrola skuteczności sterylizacji w suszarce za pomocą testu
biologicznego Sporal S
- Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem
Sporalu S.
o
- Sprawdź temperaturę suszarki (180 C) i umieść w niej torebkę
w szklanym otwartym naczyniu. Zanotuj czas.
- Po 30 minutach sterylizacji wyjmij Sporal S z suszarki.
- Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą i jałowo
(przy palniku) przenieś krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą.
- Po inkubacji (37oC, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost
(zmętnienie, kożuch), czy też bulion jest klarowny.
- Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia
122
Zadanie 3
Kontrola skuteczności sterylizacji w autoklawie (lub urządzeniu o takim
samym działaniu) za pomocą testu biologicznego Sporal A
- Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem
Sporalu A.
- Włóż torebkę do probówki i umieść ją autoklawie.
- Po zakończonym procesie sterylizacji otwórz autoklaw i wyjmij z niego
Sporal A.
- Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą jałowo przenieś
krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą.
- Po inkubacji (55oC, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost
(zmętnienie, kożuch), czy bulion jest klarowny.
Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia
123
124
Rozdział 10
Bakterie w lekach i żywności – kontrola czystości
mikrobiologicznej
Część teoretyczna
Zanieczyszczenie mikrobiologiczne żywności
Produkty żywnościowe i surowce są dogodnym środowiskiem do rozwoju
drobnoustrojów. Ich obecność może przyczyniać się do procesów psucia,
ale także stać się przyczyną zakażeń i zatruć pokarmowych. Czynniki, które
wpływają na częstość zachorowań i zatruć pokarmowych ciągle się
zmieniają. Należą do nich: nawyki żywieniowe, dbałość o higienę
w procesie przygotowania produktów żywnościowych, światowy obrót
żywnością, rozwój firm oferujących gotowe posiłki oraz nowe metody
produkcji i przechowywania żywności. W procesie produkcji żywności
coraz większy nacisk kładzie się na kontrolę mikrobiologiczną przetwórni
i podnoszenie higieny procesów produkcji, ponieważ ten rodzaj nadzoru,
sprawowany przez laboratoria przyzakładowe daje lepsze wyniki niż
wyrywkowe badanie gotowych produktów. W tym celu w ciągu
produkcyjnym określa się punkty wymagające szczególnej kontroli, gdzie
występują warunki sprzyjające skażeniu mikrobiologicznemu (HACCP-ang.
hazard analysis critical control point).
Problem mikrobiologicznego skażenia żywności jest poważny, pojawiają
się nowe czynniki chorobotwórcze szerzące się tą drogą, jak na przykład
Escherichia coli O157:H7, ale także zwiększa się częstość zakażeń
patogenami dobrze znanymi, jak np. Campylobacter jejuni.
W zapobieganiu bakteryjnym zatruciom pokarmowych, wśród których
w Polsce dominują salmonellozy odzwierzęce, największą rolę odgrywa
wyeliminowanie źródła zakażenia i właściwe postępowanie z surowcami
pochodzenia zwierzęcego przed ich wykorzystaniem.
125
Podstawowe
żywności
wymogi
dotyczące czystości
mikrobiologicznej
Przy ocenie stanu higienicznego wszystkich produktów spożywczych
istotne jest oznaczenie stopnia skażenia pałeczkami z grupy coli. Ich
obecność łączy się z możliwością skażenia pałeczkami chorobotwórczymi
z rodziny Enterobacteriaceae, a także innymi drobnoustrojami szerzącymi
się drogą fekalno-oralną.
Szczególną uwagę przywiązuje się do pokarmów specjalnego
przeznaczenia, jak na przykład preparaty do żywienia niemowląt. W ich
przypadku wymagania mikrobiologiczne wyznaczają limity obecności
drobnoustrojów tlenowych mezofilnych, bakterii z grupy coli, bakterii
beztlenowych przetrwalnikujących redukujących siarczyny, Bacillus cereus,
pleśni i drożdży, Salmonella oraz Staphylococcus aureus. W pracach
Kodeksu Żywnościowego FAO/WHO zwrócono ponadto uwagę na nowe
bakterie, które mogą stanowić potencjalne zagrożenie dla zdrowia
niemowląt. Należy do nich Cronobacter sakazakii (dawniej Enterobacter
sakazakii), izolowany z infekcji związanych z podawaniem preparatów
w proszku do początkowego żywienia niemowląt.
Przyczyny zanieczyszczenia mikrobiologicznego leków
Czystość mikrobiologiczna leków zależy od:
 zanieczyszczenia surowców,
 technologii produkcji,
 zanieczyszczenia urządzeń produkcyjnych i powietrza,
 higieny personelu,
 sposobu konfekcjonowania, czystości opakowań i warunków
przechowywania gotowych preparatów.
Głównym źródłem zanieczyszczenia leków produkowanych zarówno przez
przemysł, jak i w aptece są surowce farmaceutyczne, substancje
pomocnicze oraz woda destylowana. Stwierdzono na przykład, że
podstawowym źródłem obecności Escherichia coli w tabletkach
i drażetkach jest skrobia. Drobnoustrój ten znajdowano także w wielu
innych surowcach pochodzenia roślinnego. Znaczne ilości bakterii
126
zawierają surowce pochodzenia zwierzęcego, na przykład te, które służą
do produkcji organopreparatów. Typowymi są tu bakterie z rodzaju
Clostridium, Escherichia coli, Enterococcus faecalis.
Na poziom zanieczyszczenia leków drobnoustrojami duży wpływ ma także
technologia ich produkcji. Przykładem mogą być leki w postaci
granulatów. Temperatura 40°C w jakiej przebiega proces granulowania i
duża wilgotność sprzyjają mnożeniu się drobnoustrojów, które mogą
znaleźć się w łączonych składnikach. Niektóre preparaty, na przykład
maści, stwarzają szczególnie dogodne warunki dla przetrwania
drobnoustrojów, a inne przeszkadzają skutecznej sterylizacji.
Zagrożenia ze strony drobnoustrojów obecnych w lekach
Obecność drobnoustrojów w leku może być przyczyną zakażenia
pierwotnego lub wtórnego. W lekach niebezpieczeństwo stanowią
zarówno bakterie chorobotwórcze, jak i oportunistyczne. Do najczęściej
spotykanych należą bakterie z rodzaju Escherichia, Pseudomonas,
Staphylococcus, Klebsiella, Salmonella i Clostridium. Niebezpieczeństwo,
jakie stwarza obecność tych bakterii w lekach, zależy między innymi od
sposobu podania leku, a wraz z nim, drogi wprowadzenia bakterii do
organizmu. W lekach doustnych szczególnie groźne są pałeczki z rodziny
Enterobacteriaceae. W lekach do użytku zewnętrznego szczególne
niebezpieczeństwo stanowią bakterie z rodzaju Pseudomonas i
Staphylococcus.
Drobnoustroje wytwarzają toksyny i enzymy, które są wydzielane do
środowiska lub uwalniane w wyniku rozpadu komórki. Nagromadzenie
lipopolisacharydu (endotoksyny)
w lekach parenteralnych może
prowadzić do wystąpienia groźnego dla życia pacjenta wstrząsu
endotoksycznego. Pseudomonas aeruginosa namnażając się w lekach do
oczu wytwarza enzymy proteolityczne, niszczące kolagen rogówki oka.
Możliwość wywołania zakażenia przez lek zawierający drobnoustroje jest
tylko jednym z aspektów szkodliwego ich działania. Drobnoustroje mogą
również rozkładać substancje lecznicze, inaktywując je lub zmieniając ich
działanie farmakologiczne. Wiele bakterii znanych jest ze zdolności
przebudowywania cząsteczki sterydów, rozkładu glikozydów, a nawet
127
alkaloidów.
Szereg
antybiotyków,
środków
dezynfekujących
i konserwujących ulega degradacji w wyniku działania drobnoustrojów,
tracąc swą aktywność biologiczną. Obecności bakterii w leku można zatem
przypisywać niepowodzenia w terapii.
Leki należy zatem wytwarzać w warunkach aseptycznych. Zasada ta musi
dotyczyć nie tylko leków, dla których wymagana jest jałowość (np.
preparaty parenteralne i do oczu), ale także leków, dla których przepisy
nie wymagają jałowości (np. leki doustne lub stosowane zewnętrznie).
Postępowanie aseptyczne jest konieczne nawet w przypadku tych leków,
które są następnie poddawane wyjaławianiu, z obawy przed produktami
metabolizmu drobnoustrojów lub związków uwalnianych w wyniku
rozpadu komórek.
Normy (wymagania) czystości mikrobiologicznej leków
Biorąc pod uwagę wymagania czystości mikrobiologicznej i zastosowanie
oraz sposób podawania, pewne leki powinny być jałowe - całkowicie
wolne od żywych drobnoustrojów, inne mikrobiologicznie czyste we
wskazanym dla kategorii zakresie.
Tabela 1. Kryteria akceptacji dla mikrobiologicznej jakości niejałowych
produktów farmaceutycznych i substancji do celów farmaceutycznych
wg FP IX
Grupa preparatów
Preparaty doustne nie
zawierające wody
Preparaty doustne
zawierające wodę
Preparaty doodbytnicze
Preparaty:
-na skórę i błony śluzowe
-do nosa, uszu i gardła
Wymagania
3
2
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1mL.
Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL
2
1
3
2
2
1
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność Escherichia coli w 1g lub 1 mL
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL
Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa w 1 g lub 1 mL.
128
Preparaty dopochwowe
Systemy transdermalne
Preparaty wziewne (jeżeli
nie mają wymagań
jałowości)
Leki doustne zawierające
surowce pochodzenia
naturalnego (zwierzęcego,
roślinnego lub
mineralnego), których nie
poddaje się wstępnej
obróbce zmniejszającej
liczbę drobnoustrojów i dla
których dopuszcza się
zanieczyszczenie
mikrobiologiczne
3
surowców większe niż 10
drobnoustrojów w 1g lub
1mL
Roślinne produkty
lecznicze, zawierające
substancje roślinne, z
dodatkiem lub bez
substancji pomocniczych,
poddawane przed użyciem
działaniu wrzącej wody.
2
1
2
1
2
1
4
2
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL
Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa , Candida albicans w 1 g lub 1 mL.
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów (na jeden plaster
łącznie z warstwą adhezyjną i zewnętrzną warstwą nośną).
Nieobecność Staphylococcus aureus i Pseudomonas
aeruginosa
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1mL.
Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa w 1g lub 1 mL.
Nieobecność bakterii gramujemnych tolerujących żółć
w 1 g lub 1 mL
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1g lub 1mL.
2
Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących żółć
w 1g lub 1mL.
Nieobecność Salmonella w 10g lub 10 mL.
Nieobecność Escherichia coli, Staphylococcus aureus
w 1 mL
7
Nie więcej niż 10 bakterii w 1g. Maksymalna dopuszczalna
7
liczba bakterii 5x10 CFU/g.
3
Nie więcej niż 10 Escherichia coli w 1 g.
Nieobecność Salmonella w 25 g.
5
Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g.
5
Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU/g.
129
4
Roślinne produkty
lecznicze, zawierające np.
wyciągi i/lub substancje
roślinne, z dodatkiem lub
bez substancji
pomocniczych, dla których
metoda wytwarzania
(np. ekstrakcja) lub
wstępne postępowanie,
prowadzi do obniżenia
liczby drobnoustrojów
Roślinne produkty
lecznicze, zawierające np.
wyciągi i/lub substancje
roślinne, z dodatkiem lub
bez substancji
pomocniczych, dla których
metoda wytwarzania
(np. ekstrakcja) lub
wstępne postępowanie,
nie prowadzi do
wystarczającego obniżenia
liczby drobnoustrojów
Substancje do celów
farmaceutycznych
Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL.
4
Maksymalna dopuszczalna liczba bakterii 5x10 CFU w 1 g
lub 1 mL.
2
Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących żółć
w 1g lub 1mL.
Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL
Nieobecność Salmonella w 25 g lub 25 mL.
2
Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
2
Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU w 1 g
lub 1 mL.
5
Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL.
5
Maksymalna dopuszczalna liczba bakterii 5x10 CFU w 1 g
lub 1mL.
4
Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących żółć
w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL
Nieobecność Salmonella w 25 g lub 25 mL.
4
Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
4
Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU w 1 g
lub 1 mL.
3
Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL.
2
Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
W mikrobiologicznej ocenie leków jałowych obowiązuje analiza jałowości
określana metodami farmakopealnymi (Farmakopea Polska IX). Dla
pozostałych leków stopień skażenia drobnoustrojami określa się ilościowo
i przeprowadza ich identyfikację.
130
Metody
Badanie skażenia żywności
Próby produktów żywnościowych przeznaczonych do badań
mikrobiologicznych muszą być pobierane w sposób wykluczający
dodatkowe zakażenie.
Produkty płynne należy przed pobraniem dokładnie wymieszać.
Z produktów stałych pobiera się próbę możliwie z całego przekroju.
Produkty stałe i płynne o niejednolitej konsystencji należy przed
posiewem zhomogenizować, dodając uprzednio jałowy rozcieńczalnik, aby
otrzymać rozcieńczenie 1:10. Z przygotowanych prób sporządza się
preparaty mikroskopowe i wykonuje posiewy umożliwiające liczenie
drobnoustrojów (patrz rozdział 6) i ich identyfikację. Należy stosować
aktualne normy wskazywane przez odpowiednie akty prawne,
a w szczególności stosować się do aktualnie obowiązującej Ustawy
o warunkach zdrowotnych żywności i żywienia.
Badanie jałowości leków
Definicja jałowości jest trudna do weryfikacji doświadczalnej, a wyniki
kontroli jałowości są względne, gdyż dają odpowiedź tylko w ścisłych
granicach zastosowanych metod.
Lekami, które muszą być jałowe są wszystkie leki podawane parenteralnie
i leki stosowane w okulistyce. Jałowe muszą być także materiały
opatrunkowe, nici chirurgiczne, igły, strzykawki, cewniki, zestawy
kroplówkowe, narzędzia chirurgiczne.
W badaniu jałowości można wyróżnić kilka podstawowych zasad, od
których zależy uzyskanie wiarygodnych danych. Są to:
 aseptyczne postępowanie w czasie badania, w celu uniknięcia
wprowadzenia wtórnych zakażeń do pierwotnie jałowego materiału;
 ustalenie odpowiedniej wielkości badanej próbki, reprezentatywnej
dla całości badanego materiału;
 właściwy dobór pożywek wzrostowych, warunków inkubacji oraz
usunięcie wszystkich czynników hamujących rozwój drobnoustrojów,
gdyż podstawą badania jałowości jest obserwacja wzrostu
drobnoustrojów.
131
Standardowe badanie jałowości bierze pod uwagę tylko część bakterii
tlenowych, beztlenowych i grzybów i nie obejmuje wirusów ze względu na
trudną i kosztowną technikę.
Tabela 2 pokazuje wielkość próbek, które muszą być pobrane do kontroli
jałowości. Zależy ona od objętości pojemnika i liczebności tzw. serii
bakteriologicznej. Seria bakteriologiczna jest to partia pojemników
określonego
leku
wyjaławianych
podczas
jednego
procesu
sterylizacyjnego lub zawierających lek sterylizowany drogą filtracji
bakteriologicznej przez jeden sączek.
Tabela 2. Minimalna ilość leku posiewana na każde podłoże wg FP IX
Ilość w pojemniku
Wielkość próbki
Płyny:
Mniej niż 1 mL
Cała zawartość pojemnika
Połowa zawartości każdego
1 mL-40 mL
pojemnika, jednak nie mniej niż 1 mL
Więcej niż 40 mL, lecz nie więcej
20 mL
niż 100 mL
10% zawartości każdego pojemnika,
Więcej niż 100 mL
jednak nie mniej niż 20 mL
Płynne preparaty antybiotyków
1 mL
Nierozpuszczalne preparaty,
Cała zawartość każdego pojemnika,
kremy i maści, które zawiesza się
nie mniej niż 200 mg
lub emulguje
Substancje stałe:
Mniej niż 50 mg
Cała zawartość każdego pojemnika
50 mg lub więcej, lecz mniej niż
Połowa zawartości każdego
300 mg
pojemnika, jednak nie mniej niż 50 mg
Od 300 mg do 5g
150 mg
Więcej niż 5g
500 mg
Katgut i inne nici do użytku
3 odcinki zwoju (każdy o długości
weterynaryjnego
30 cm)
132
Pożywki stosowane w kontroli jałowości muszą spełniać następujące
warunki:
 zapewniać rozwój możliwie szerokiego zakresu bakterii i grzybów,
 umożliwiać rozwój bakterii tlenowych i beztlenowych,
 umożliwiać szybki rozwój drobnoustrojów.
Używa się dwóch podstawowych pożywek płynnych: tioglikolanowej
(Brewera), zapewniającej wzrost bakterii beztlenowych i tlenowych oraz
kazeinowo-sojowej, odpowiedniej zarówno dla grzybów, jak i bakterii
tlenowych.
Kontrole, które musza towarzyszyć każdemu badaniu jałowości to:
 kontrola jałowości pożywek polegająca na inkubacji przez 14 dni
nieposianych pożywek: tioglikolanowej w temp.30-35°C, kazeinowosojowej w temp.20-25°C;
 kontrola przydatności pożywek uzyskana przez posianie na pożywki
szczepów wzorcowych w zawiesinach zawierających około 100
CFU/mL; na podłoże tioglikolanowe należy posiać: Clostridium
sporogenes, Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, a na
podłoże kazeinowo-sojowe: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis i
Candida albicans, a następnie je inkubować nie dłużej niż 3 dni w
przypadku bakterii i nie dłużej niż 5 dni w przypadku grzybów;
 kontrola wzrostu drobnoustrojów w obecności leku – walidacja
badania, polegająca na posianiu wyżej wymienionych szczepów
wzorcowych na pożywki zawierające badany lek. Kontrola ma na celu
sprawdzenie, czy lek nie hamuje wzrostu bakterii lub grzybów i pozwala na
wybór odpowiedniej metody badawczej. Po wykonaniu prób wszystkie
pożywki należy inkubować nie dłużej niż 5 dni.
Metody przeprowadzenia badania jałowości:
Posiew bezpośredni polega na wprowadzeniu do podłoża hodowlanego
produktu badanego tak, aby objętość produktu stanowiła nie więcej niż
10% objętości podłoża, o ile nie ma innych wymagań. Jeżeli badany
produkt posiada właściwości przeciwdrobnoustrojowe, należy je najpierw
133
zneutralizować odpowiednią substancją neutralizującą lub rozcieńczyć lek
w wystarczająco dużej objętości podłoża. Maści, kremy i płyny olejowe
należy przenieść do podłoża emulgującego, np. pożywki z Tweenem 80.
Sączeniem przez filtry membranowe bada się preparaty wodne,
alkoholowe i olejowe oraz preparaty rozpuszczalne w wodzie lub
rozpuszczalnikach olejowych pod warunkiem, że rozpuszczalniki te nie
wykazują w warunkach badania działania przeciwdrobnoustrojowego.
Metoda ta zalecana jest także w przypadku badania leków, które ze
względu na wielkość pojemnika, muszą być zbadane w dużej objętości –
powyżej 100 mL. Próbkę leku należy przesączyć przez filtr bakteriologiczny
o wielkości porów nie większej niż 0,45 μm. Jeżeli produkt posiada
właściwości przeciwdrobnoustrojowe, po przesączeniu leku filtr należy
przepłukać co najmniej trzema porcjami (po 100 mL) jałowego
rozcieńczalnika (np. obojętny roztwór peptonu). Sączek należy przenieść
do jednej z pożywek lub po przecięciu na dwie równe części do dwóch
różnych podłoży.
Badane leki, których jałowość bada się jedną z wymienionych metod,
powinny być posiane na pożywki dla bakterii i grzybów. Czas inkubacji
wynosi 14 dni. Warunki hodowli próbek przedstawia Tabela 3.
Tabela 3.Temperatura i czas inkubacji pożywek
Pożywka
Temperatura inkubacji
Tioglikolanowa
30 – 35°C
(Brewera)
Podłoże z hydrolizatem
20 – 25°C
kazeiny i soi
Czas inkubacji
14 dni
14 dni
O wyniku badania świadczy obecność lub brak wzrostu drobnoustrojów w
pożywce. Wzrost objawia się zmętnieniem, obecnością kożucha na
powierzchni pożywki lub osadu na dnie naczynia. Nie zawsze zmętnienie
lub osad jest wynikiem wzrostu. Mogą one powstawać wskutek
reagowania składników pożywki z lekiem. Aby uniknąć błędnej oceny,
należy wykonać preparat barwiony metodą Grama oraz dokonać
przesiewu z danego podłoża (przynajmniej 1 mL) na nową pożywkę.
134
Próbka powinna być inkubowana co najmniej 4 dni. Jeżeli w tym czasie nie
będzie wzrostu drobnoustrojów, badany produkt spełnia wymagania
jałowości. W przypadku obecności drobnoustrojów należy, w miarę
możliwości przeprowadzić ich identyfikację. Jeżeli niekorzystny wynik
badania budzi wątpliwości, należy przeprowadzić ponowne badanie,
używając takiej samej liczby pojemników, jak w badaniu pierwotnym.
Jeżeli w powtórzonym badaniu brak jest wzrostu drobnoustrojów, badany
produkt jest jałowy.
Badanie mikrobiologiczne leków, które muszą spełniać kryteria czystości
mikrobiologicznej
Podobnie, jak w badaniach jałowości, wyniki tych oznaczeń są względne,
uzależnione z jednej strony od wybranych warunków hodowli, z drugiej
zaś od charakteru zanieczyszczeń mikrobiologicznych znajdujących się
w badanym materiale.
Celem tych badań jest określenie liczby żywych bakterii i grzybów,
tzn. drobnoustrojów zdolnych do wzrostu i rozmnażania w zastosowanych
warunkach hodowli w niejałowych produktach farmaceutycznych
(Tabela 1). Ukierunkowane badania identyfikacyjne, muszą wykluczyć
obecność wskazanych dla danej grupy bakterii oportunistycznych lub
wskaźnikowych dla stanu higienicznego (Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella spp., bakterie
gramujemne tolerujące żółć) oraz Candida albicans.
Licząc żywe drobnoustroje wykorzystuje się fakt, że z jednej jednostki
wzrostowej (jtk, CFU) powstaje na pożywce stałej jedna kolonia. Zatem
liczba powstających kolonii odpowiada liczbie CFU wprowadzonych
z lekiem na płytkę (patrz rozdział 6).
Porównanie otrzymanego wyniku z kryterium określonym dla danej grupy
leków pozwala na ocenę badanej partii leków.
Podobnie, jak przy badaniu jałowości, wszystkie czynności w przebiegu
określania czystości mikrobiologicznej leków powinny być wykonane
w aseptycznym pomieszczeniu lub boksie z laminarnym przepływem
powietrza.
Jeżeli badany produkt posiada aktywność przeciwdrobnoustrojową, musi
być ona zneutralizowana. W przypadku zastosowania substancji
135
neutralizującej należy sprawdzić jej skuteczność oraz brak działania
toksycznego w stosunku do drobnoustrojów.
Sposób pobrania i wielkość próbki są, podobnie jak w badaniu jałowości,
określone pewnymi zasadami. W analizie czystości mikrobiologicznej
konieczne jest pobranie 10 g lub 10 mL próbki. Próbkę należy pobrać
losowo z materiału przed rozporcjowaniem lub spośród dostępnych
pojemników z preparatem.
Produkty rozpuszczalne w wodzie należy rozpuścić lub rozcieńczyć
w jałowym rozcieńczalniku (np. w zbuforowanym roztworze chlorku sodu
z peptonem o pH 7,0) przygotowując rozcieńczenie 1:10. Jeżeli to
konieczne, można użyć innych rozcieńczeń. Jeżeli wiadomo, że produkt ma
aktywność przeciwdrobnoustrojową, do rozcieńczalnika powinna być
dodana substancja neutralizująca. W przypadku produktów
nierozpuszczalnych w wodzie, do rozcieńczalnika można dodać substancję
powierzchniowo czynną, np. Tween 80. Produkty zawierające tłuszcze
wymagają wstępnego zhomogenizowania, np. z Tweenem 80 i dodatkowo
ogrzania do temp. 40-45°C.
Do badania systemów transdermalnych konieczna jest próbka licząca
10 sztuk. Po usunięciu osłonki chroniącej warstwę adhezyjną systemy
transdermalne przenosi się do 500 mL zbuforowanego roztworu NaCl
z peptonem o pH 7,0, zawierającego odpowiednią substancję
neutralizującą, np. Tween 80 i/lub lecytynę i wytrząsa przez około
30 minut.
Podłoża i warunki hodowli badanych próbek muszą być tak dobrane, aby
wynik analizy dawał możliwie pełną informację o stopniu zanieczyszczenia
leku drobnoustrojami rosnącymi w warunkach tlenowych (bakteriami
i grzybami). Dla bakterii stosuje się agar z hydrolizatem kazeiny i soi,
umożliwiający wzrost drobnoustrojów o typowych wymaganiach
odżywczych. Dla grzybów jest to stałe podłoże Sabouraud z dekstrozą.
Inkubację obu podłoży przeprowadza się w ciągu 3-5 dni, w temperaturze
30-35°C, a podłoża Sabouraud z dekstrozą 5-7 dni w temperaturze
20-25°C.
Wybór metody badania zależy od rodzaju produktu i spodziewanej liczby
drobnoustrojów. Stosuje się ogólnie przyjęte metody liczenia
drobnoustrojów (patrz rozdział 6).
136
W metodzie płytkowej po odpowiednim rozcieńczeniu badanej próbki
dokonuje się posiewu powierzchniowego lub głębinowego znanej
objętości materiału. Należy przygotować co najmniej po dwie płytki na
każde rozcieńczenie i każde podłoże. Po inkubacji zlicza się kolonie,
a uwzględniając współczynnik rozcieńczenia określa się liczbę CFU w 1 mL
lub 1 g leku.
W metodzie filtracji używa się dwóch sączków membranowych o średnicy
porów nie większej niż 0,45 μm. Wybór materiału, z którego wykonany
jest sączek, zależy od rodzaju sączonej substancji (roztwory wodne,
olejowe, etanolowe). Po przesączeniu próbek preparatu, każdy z dwóch
sączków należy przemyć jałowym rozcieńczalnikiem (np. zbuforowanym
roztworem NaCl). Jeśli to potrzebne, dodaje się Tween 80 lub związków
inaktywujących działanie przeciwdrobnoustrojowe. Każdy z sączków
należy następnie przenieść na powierzchnię odpowiedniego podłoża (dla
bakterii i grzybów) tak, aby powierzchnia na której osadziły się
drobnoustroje była zwrócona ku górze. Po inkubacji liczy się wyrosłe na
sączku kolonie. Ich liczba odpowiada liczbie CFU w 1 g lub 1 mL leku.
Przy badaniu systemów transdermalnych należy przesączyć dwie porcje
po 50 mL przygotowanej próbki.
Metodę oznaczania najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów
(NPL) (patrz rozdział 6) stosuje się tylko wtedy, gdy nie jest możliwe
wykonanie badania innymi metodami. Należy przygotować co najmniej
trzy kolejne 10-krotne rozcieńczenia produktu, a następnie z każdego z
nich pobrać po trzy próbki odpowiadające 0,1 g/mL, 0,01 g/mL,
0,001 g/mL, wprowadzić do probówek zawierających bulion
z hydrolizatem kazeiny i soi. Inkubować w temp. 30-35°C przez 3-5 dni. Na
podstawie obliczeń statystycznych uważa się, że wzrost drobnoustrojów w
pożywce, przy wprowadzeniu znanej wielkości próby jest miarą określonej
liczby drobnoustrojów w jednostce wagowej lub objętościowej preparatu.
Badanie
czystości
mikrobiologicznej
obejmuje
postępowanie
identyfikacyjne. W badaniach identyfikacyjnych bakterii izolowanych
z leków poszukuje się drobnoustrojów, których obecność nie jest
dozwolona: S.aureus, P.aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella spp.,
bakterie gramujemne tolerujące żółć oraz Candida albicans. Próbki do
badania przygotowuje się w taki sam sposób, jak do oznaczania liczby
drobnoustrojów. Badanie wykonuje się metodą bezpośredniego posiewu
137
lub metodą filtracji. W pierwszym etapie badania próbkę leku wprowadza
się do odpowiedniej płynnej pożywki namnażającej. Jeżeli korzystano z
metody filtracji próbki leku, sączek przenosi się do właściwej płynnej
pożywki namnażającej. Po uzyskaniu wzrostu bakterii na pożywkach
namnażających dokonuje się przesiewu na pożywki diagnostycznowybiórcze. Szczegółową identyfikację przeprowadza się za pomocą testów
biochemicznych i serologicznych.
Wykonanie każdego badania czystości mikrobiologicznej musi poprzedzić
walidacja metody oznaczania. Celem walidacji jest potwierdzenie, że
badany produkt nie hamuje wzrostu drobnoustrojów, a wybrana metoda
badania nie wpłynie na wynik analizy.
Walidacja polega na porównaniu wzrostu szczepów testowych
w obecności badanych leków i bez leków. Jako testowe wykorzystuje się
trzy wzorcowe szczepy bakterii: Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Bacillus subtilis, posiewane na podłoże kazeinowo-sojowe i dwa wzorcowe
szczepy grzybów: Candida albicans i Aspergillus brasiliensis, posiewane na
podłoże Sabouraud z dekstrozą. Po wykonaniu posiewów pożywki dla
bakterii inkubuje się w temp. 30-35°C, a pożywki dla grzybów w temp. 2025°C, przez 5 dni.
Metodę uznaje się za zwalidowaną, jeżeli liczba drobnoustrojów (CFU)
w zawiesinach z próbkami jest najwyżej dwukrotnie większa od liczby
każdego z drobnoustrojów testowych w zawiesinach w chwili ich dodania
(drobnoustrój się swobodnie mnoży), a jeśli jest mniejsza, to nie mniej niż
dwukrotnie (drobnoustrój przeżywa w leku, ale się nie mnoży).
Zadania do wykonania
Na ćwiczeniach należy dbać o warunki aseptyczne, wykonując wszystkie
zadania w bezpośrednim sąsiedztwie palnika. W zadaniach metody
farmakopealne zostały nieco uproszczone, tak by można je było wykonać
w czasowym wymiarze ćwiczeń.
138
Zadanie 1.
Kontrola jałowości wody do iniekcji
- Odkaź powierzchnię ampułki (objętość 10 mL) watą zwilżoną 70%
etanolem.
- Pobierz jałową strzykawką 4 mL wody i wprowadź po 2 mL do dwóch
kolbek; jednej, zawierającej: 20 mL pożywki tioglikolanowej Brewera
i drugiej, zawierającej 20 mL pożywki kazeinowo-sojowej.
- Umieść pożywkę tioglikolanową Brewera w cieplarce w 35°C, a pożywkę
kazeinowo-sojową w 25°C na 24 godziny.
Zadanie 2.
Kontrola jałowości roztworu NaCl (objętość 21-100 mL)
- Przetrzyj powierzchnię gumowego korka watą zwilżoną 70% etanolem.
- Pobierz jałową strzykawką roztwór soli i wprowadź po 10 mL
do pożywki tioglikolanowej Brewera i pożywki kazeinowo-sojowej
(pożywki po 100 mL powinny być przygotowane w kolbkach).
- Umieść pożywkę tioglikolanową Brewera w cieplarce w 35°C, a pożywkę
kazeinowo-sojową w 25°C na 24 godziny.
139
Zadanie 3.
Kontrola jałowości materiałów opatrunkowych (gazy)
- Odetnij jałowymi nożyczkami 2 próbki gazy po około 10 cm2 (1g).
Jałową pęsetą umieść kolejne próbki gazy w 50 mL pożywki
tioglikolanowej Brewera i w 50 mL pożywki kazeinowo-sojowej.
- Umieść pożywkę tioglikolanową Brewera
w cieplarce w 35°C,
a pożywkę kazeinowo-sojową w 25°C na 24 godziny.
Zadanie 4.
Określenie liczby drobnoustrojów w lekach (tabletki, leki płynne) metodą
bezpośredniego posiewu, techniką płytkową
Do badania należy pobierać taką objętość próbki, która zawiera 1 g lub
1 mL leku. Należy wykonać kilka wzrastających 10-krotnych rozcieńczeń
próbki.
- Z przygotowanych rozcieńczeń leku pobierz jałowo po 0,1 mL i posiej
powierzchniowo na agar z hydrolizatem kazeiny i soi i pożywkę Sabouraud
z dekstrozą.
- Oblicz jakie rozcieńczenia leku znalazły się na płytkach.
- Po inkubacji (podłoże agar z hydrolizatem kazeiny i soi – 35°C, podłoże
Sabouraud z dekstrozą – 25°C, 24 godziny) policz kolonie wyrosłe na
każdej płytce.
- Oblicz ile bakterii i grzybów było w 1 g lub 1 mL badanego leku.
- Zinterpretuj wynik.
- Wpisz wyniki wykonanych przez siebie i kolegów badań do odpowiednich
rubryk tabeli.
140
Nazwa leku
Dopuszczalna
liczba
drobnoustrojów
wg FP IX
Liczba
drobnoustrojów
w badanej
próbce
Wynik
1............................
(leki do nosa, uszu
i gardła)
2............................
(leki stosowane
doustnie)
141
142

Podobne dokumenty