„Ilościowa charakterystyka elektrokinetyczna monowarstw białek
Transkrypt
„Ilościowa charakterystyka elektrokinetyczna monowarstw białek
„Ilościowa charakterystyka elektrokinetyczna monowarstw białek globularnych oraz ich oddziaływań z ligandami jonowymi” mgr Marta Kujda promotor: Prof. dr hab. inż. Zbigniew Adamczyk Streszczenie pracy doktorskiej Adsorpcja białek jest zjawiskiem powszechnym i niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania zarówno komórek jak i tkanek. Stanowi ważny etap wielu procesów biologicznych, między innymi w sygnalizacji transbłonowej oraz w procesie krzepnięcia krwi. Proces ten znalazł też szereg zastosowań, min. jest podstawą prawidłowego działania biosensorów, testów diagnostycznych, implantów, biomateriałów, czy bioreaktorów. Proces adsorpcji białek jest przedstawiany w literaturze jako zjawisko skomplikowane i wieloetapowe. Związane jest to głównie z brakiem dogłębnej wiedzy fizykochemicznej na temat tego zjawiska. Wciąż brakuje precyzyjnych informacji o mechanizmach i oddziaływaniach fizycznych odgrywających główną rolę w procesach adsorpcji. W literaturze można znaleźć niewiele informacji na temat orientacji, konformacji oraz właściwościach wiążących zaadsorbowanych białek. Brakuje również ilościowego opisu teoretycznego zarówno procesu adsorpcji białek na powierzchni nośników stałych jak i modeli opisujących wiązanie niskocząsteczkowych ligandów do otrzymanych monowarstw białkowych. Przyczyną tych niedostatków jest głównie brak precyzyjnych technik pomiarowych w warunkach in situ, systematycznych badań kinetyki adsorpcji i desorpcji białek z powierzchni oraz brak indywidualnego podejścia do procesu adsorpcji, uwzględniającego własności użytych białek, takich jak ich rozmiar, kształt, rozkład ładunku, czy punkt izoelektryczny. Mając na uwadze powyższe informacje i braki literaturowe, zostały wyznaczone następujące cele niniejszej pracy: - ilościowa charakterystyka fizykochemiczna białek globularnych, ze szczególnym uwzględnieniem zmodyfikowanych oraz nowych syntetycznych form albuminy ludzkiej, za pomocą wydajnych technik elektrokinetycznych, - rozwinięcie unikatowych metod elektrokinetycznych, umożliwiających ilościową charakterystykę fizykochemiczną procesu adsorpcji oraz otrzymanych, stabilnych monowarstw białek globularnych na powierzchniach ciało stałe / elektrolit, - opracowanie efektywnej metody elektrokinetycznej pozwalającej na pomiary oddziaływań monowarstw białek globularnych z niskocząsteczkowymi ligandami jonowymi. W ramach prac doświadczalnych dokonano syntezy nowej formy dimeru albuminy ludzkiej (dHSA). Po raz pierwszy wyznaczono właściwości fizykochemiczne tego białka takie jak: średnica hydrodynamiczna, potencjał zeta, punkt izoelektryczny oraz liczba ładunków nieskompensowanych. Podobne badania przeprowadzono również dla wybranych form albumin ze szczególnym uwzględnieniem jej postaci glikowanej. Opisano w sposób ilościowy adsorpcję białek na powierzchniach mikrosfer polistyrenowych oraz na powierzchni miki, ze szczególnym uwzględnieniem kinetyki tego procesu. Uwagę skupiono głównie na wyznaczeniu wartości pokryć maksymalnych, oraz ocenie stabilności otrzymanych monowarstw w różnych warunkach pH i siły jonowej. Do interpretacji wyników doświadczalnych zastosowano dwa modele teoretyczne: Gouya - Chapmana oraz model elektrokinetyczny 3D. Istotnym zagadnieniem pracy było także rozwinięcie technik elektrokinetycznych, ze szczególnym uwzględnieniem pomiarów potencjału przepływu, jako nowych metod pomiarowych do badań odziaływań w układzie białko – ligand w warunkach in situ. Opracowana metodyka pomiarowa została efektywnie wykorzystana do charakterystyki wiązania niskocząsteczkowych ligandów jonowych do monowarstw białek zaadsorbowanych na powierzchni miki i mikrosfer polistyrenowych. Wykazano, że połączenie metod elektrokinetycznych z mikroskopią AFM pozwala efektywnie wyznaczyć podstawowe właściwości fizykochemiczne białek rekombinowanych (stopień agregacji, rozmiar, kształt, punkt izoelektryczny, liczbę ładunków nieskompensowanych) przy minimalnym ich zużyciu. Obszerne wyniki uzyskane w ramach niniejszej pracy doktorskiej umożliwiły sformułowanie wniosków o istotnym znaczeniu. Wykazano, że oddziaływania elektrostatyczne odgrywają dominującą rolę w procesie adsorpcji białka. Stosując czułe techniki elektrokinetyczne pokazano, że prawidłowo przeprowadzona kinetyka adsorpcji i desorpcji białek pozwala na wyznaczenie pokrycia maksymalnego oraz stabilności otrzymanych monowarstw. Po raz pierwszy wyznaczono też równowagowe stałe adsorpcji oraz maksymalne pokrycia ligandów niskocząsteczkowych na monowarstwach białek.