Analiza związków zaburzających działanie układu

Analiza związków zaburzających działanie układu

NOTA APLIKACYJNA Związki zaburzające działanie układu dokrewnego
Analiza związków zaburzających działanie układu
dokrewnego, farmaceutyków i kosmetyków
w wodzie rzecznej
System API 4000™ LC/MS/MS
Zarys
Grupa związków zaburzających działanie
układu dokrewnego (EDC, Endocrine
Discrupting Compounds) obejmuje
szeroki zakres zanieczyszczeń od leków
po środki pielęgnacji i higieny osobistej
(PPCP, Pharmaceuticals and Personal
Care Products), pestycydy i steroidy.
Wydaje się, że EDC zaburzają działanie
układu dokrewnego ssaków i ryb,
a konsekwencje biologiczne ich działania
stają się coraz większym problemem.
Aby prawidłowo ocenić wpływ tych
związków na środowisko, niezbędne jest
dokładne monitorowanie ich obecności.
Poniżej prezentujemy metodę LC/MS/MS
analizy 100 związków z grup EDC oraz
PPCP. Ta bezpośrednia metoda pozwala
na analizę i potwierdzanie obecności
tych związków z doskonałą czułością
i powtarzalnością.
Wstęp
Próbki wody rzecznej zebrane
w pobliżu stacji uzdatniania wody
(oczyszczalni) oceniono pod kątem
zawartości szerokiego zakresu związków
zaburzających działanie układu
dokrewnego. Oszacowano i porównano
poziom tych związków w wodzie
wpływającej i wypływającej z oczyszczalni.
Połączenie ekstrakcji na fazie stałej
(SPE, Solid Phase Extraction) z analizą
LC/MS/MS w trybie monitorowania reakcii
wielokrotnych (MRM, Multiple Reaction
Monitoring) pozwala na osiągnięcie niskich
granic wykrywalności, rzędu ppt dla
wielu klas związków, w zakresie liniowym
3-4 rzędów wielkości dla wszystkich
związków.
Dla każdego związku monitorowano dwa
przejścia MRM w cleu uzyskania czułej
i specyficznej analizy ilościowej oraz dla
potwierdzenia na podstawie stosunku par
TABELA 1. LISTA ZWIĄZKÓW UWZGLĘDNIAJĄCA PRZEJŚCIA MRM
Przejścia MRM w trybie jonów dodatnich
Jon kwantyfikator
Jon kwalifikator
Jon kwantyfikator
Jon kwalifikator
Q1
Q3
Związek
Typ
Q1
Q3
Q1
Q3
Związek
Typ
Q1
Q3
Acetaminophen
(paracetamol)
lek przeciwbólowy
152,4
110,0
152,4
65,1
Estradiol
Estrogen
255,1
159,0
Ketoprofen
lek przeciwbólowy
254,9
105,0
254,9
77,0
Etynylodiestradiol
Estrogen
279,1
133,0
Codine
lek przeciwbólowy
300,5
215,2
300,5
165,1
17a-Hydroksy-progesteron
Estrogen
331,1
97,1
Hydrokodon
lek przeciwbólowy
303,5
199,1
303,5
171,1
Progesteron
Estrogen
315,4
108,9
315,4
97,1
Amdrostendion
androgen
287,2
97,0
287,4
97,2
Ekwilina
Estrogen zastępczy 269,2
211,1
269,2
157,0
Testosterone
androgen
289,5
97,2
289,5
109,1
Dietylostilbestrol
Estrogen zastępczy 269,2
135,1
269,2
107,0
Dilantyna
lek przeciwdrgawkowy 253,0
182,0
TCEP
Materiał niepalny 285,0
222,8
285,0
238,9
Meprobramat
anksjolityk
219,5
158,1
219,5
115,1
Symazyna
herbicyd
132,0
202,1
124,1
Sulfadiazyna
antybiotyk
251,0
91,9
251,0
64,9
Izoproturon
herbicyd
207,0
71,9
Sulfametoksazol
antybiotyk
254,3
92,2
254,3
108,1
Chlorotoluron
herbicyd
213,1
72,0
213,1
140,0
Sulfatiazol
antybiotyk
256,3
156,1
256,3
92,1
Atrazyna
herbicyd
216,6
174,1
216,6
68,1
Sulfamerazyna
antybiotyk
265,4
92,1
265,4
108,0
Chlorydazon
herbicyd
222,0
104,0
222,0
92,2
Sulfametyzol
antybiotyk
271,1
156,0
271,1
92,1
Propazyna
herbicyd
230,2
146,0
230,2
188,0
Sulfametazyna
202,1
antybiotyk
279,4
92,1
279,4
124,2
Diuron
herbicyd
233,3
72,1
233,3
46,1
Sulfachloropirydazyna antybiotyk
285,1
91,9
285,1
65,0
Heksazynon
herbicyd
253,1
171,1
253,1
85,1
Trimetroprym
antybiotyk
291,4
230,2
291,4
123,2
Bromacyl
herbicyd
261,3
205,1
261,3
187,9
Sulfadimetoksyna
antybiotyk
311,3
156,2
311,3
92,1
Metazachlor
herbicyd
278,1
134,0
278,1
210,0
Cyprofloksacyna
antybiotyk
332,1
288,0
Metolachlor
herbicyd
284,2
251,9
284,2
175,1
Penicylina G
antybiotyk
335,0
176,0
335,0
217,0
DEET
środek
odstraszający owady 192,1
118,9
Amoksycylina
antybiotyk
366,3
114,0
366,3
208,1
Bezafibrat
Lek regulujący
metabolit lipidów
362,0
139,0
362,0
121,0
Linkomycyna
antybiotyk
407,5
126,1
407,5
359,1
Diazepam
Lek zwiotczający
mięśnie
285,3
154,1
285,3
193,2
Doksycyklina
antybiotyk
445,3
428,1
445,3
339,2
Noretysteron
Lek hamujący owulację 299,5
109,0
299,5
91,1
Tetracylina
antybiotyk
445,3
410,2
445,3
154,1
Teofilina
Środek pobudzający 181,4
124,1
181,4
96,1
Okstytetracyklina
antybiotyk
461,4
426,3
461,4
443,2
Teobromina
Środek pobudzający 181,4
138,1
181,4
110,0
Chlortetracyklina
antybiotyk
479,3
462,1
479,3
154,1
Kofeina
Środek pobudzający 195,5
138,1
195,5
110,1
Wirginiamycyna
antybiotyk
526,1
109,1
526,1
67,0
Oksybenzon
Ekran słoneczny 229,4
151,1
229,4
105,1
Monenzyna
antybiotyk
693,6
461,3
693,6
479,4
Sildenafil
Regulator płodności 475,1
100,1
475,1
283,1
Eryromycyna
antybiotyk
734,7
158,2
734,7
576,5
Wardenafil
Regulator płodności 490,3
72,1
490,3
114,1
Roksytromycyna
antybiotyk
837,5
679,5
837,5
158,0
Kwas salicylowy
Higiena skóry, trądzik 138,9
60,8
138,9
78,8
Tylozyna
antybiotyk
916,5
174,2
916,5
772,5
Kotynina
Metabolizm nikotyny 177,4
80,0
177,4
98,1
Sulfosalicylan
meklocykliny
antybiotyk
477,2
460,2
4-aminoantypiryna
204,0
55,9
Sulfadimetoksyna
antybiotyk
311,1
156,0
Ketorolak
Lek przedciwzapalny 256,0
104,9
256,0
76,9
Sulfachloropirydazyna antybiotyk
285,0
156,0
Fenoprop
herbicyd
269,2
180,9
269,2
84,9
296,1
278,0
296,1
243,0
95,1
332,3
121,1
358,0
74,8
Norfloksacyna
antybiotyk
320,1
276,1
Kwas meklofenamowy
Enrofloksacyna
antybiotyk
360,1
316,2
Piroksykam
Lek przedciwzapalny 332,3
Fluoksetyna
lek przeciwdepresyjny 310,0
147,6
Nifedypina
Dichydropirydyna
347,0
315,0
Antagonista kanałów wapniowych
Karbamazepina
lek przeciwdrgawkowy 237,1
194,0
237,1
193,0
Indometacyna
Lek przedciwzapalny 358,0
138,9
Pentoksyfilina
Lek obniżający
lepkość krwi
181,1
279,4
138,0
Diatrizoat
Kontrast
radiologiczny
360,8
279,4
614,7
TABELA 1. LISTA ZWIĄZKÓW UWZGLĘDNIAJĄCA PRZEJŚCIA MRM (KONTYNUACJA)
Przejścia w trybie jonów ujemnych
Związek
Typ
Jon kwantyfikator
Jon kwalifikator
Q1
Q3
Q1
Q3
Związek
Typ
Jon kwantyfikator
Jon kwalifikator
Q1
Q1
Q3
Q3
Kwas acetylosalicylowy
lek przeciwbólowy
178,8
136,9
178,8
92,9
Estron
Estrogen
269,0
145,2
Ibuprofen
lek przeciwbólowy
205,0
161,0
205,0
159,0
Estradiol
Estrogen
271,0
145,1
Naproksen
lek przeciwbólowy
228,9
183,0
228,9
154,9
Estriol
Estrogen
287,0
171,1
Warfaryna
Lek przeciwkrzepliwy 307,0
161,0
307,0
250,0
Etynyloestradiol
Estrogen
295,0
145,2
Diklofenak
Lek przeciwzapalny 294,0
249,9
294,0
213,9
Tetrabromobisfenol
Środek niepalny 442,9
102,9
442,9
238,9
Karbadoks
Antybiotyk
261,0
122,0
2,4-D
Herbicyd
218,9
160,9
218,9
125,0
Triklosan (Irgasan)
Antybiotyk
286,8
35,0
Kwas klofibrowy
Metabolit regulatora 213,0
poziomu lipidów
126,9
213,0
84,9
Chloramfenikol
Antybiotyk
321,9
257,9
Jomipryd
Środek kontrastowy rtg
790,0
127,0
Gemfibrozil
Lek obniżający 248,9
poziom cholesterolu
121,1
188,9
100,8
188,9
322,0
153,0
Kwas 2,4dichlorobenzoesowy
TABELA 2. DOLNA GRANICA OZNACZALNOŚCI WYBRANYCH ANALITÓW
Analit
LLOQ (ng/L) ppt
Analit
LLOQ (ng/L) ppt
DEET
11,6
Propazyna
0,46
Ketoprofen
3,3
Progesteron
3,9
Sulfadiazyna
13
Trimetoprym
6,4
Fluoksetyna
280
Androstendion
4,7
2, 4-D
2,3
Erytromycyna
13
ESI jony dodatnie
ESI jony ujemne
Rycina 1. Aby objąć analizą jak największą listę analitów wykorzystano zmianę polarności –
nastrzyk 50 ng/ml wzorca.
144,8
MRM (współczynnika jonowego). W skali
czasu chromatografii monitorowano
w sumie 160 przejść MRM.
Zebrano dwa zestawy próbek wody
rzecznej. Oba zestawy próbek wody
wpływającej i wypływającej zebrano
z rzeki wiejskiej (Rzeka 1) i miejskiej
(Rzeka 2) w Ameryce Północnej.
Następnie porównano wodę wpływającą
i wypływającą w obu lokalizacjach w celu
określenia wpływu środowiskowego.
Część eksperymentalna
Wykorzystano system AB SCIEX API 4000
LC/MS/MS wyposażony w automatyczny
podajnik próbek Shimadzu Prominence
i binarną pompę LC. Do jonizacji
elektrosprej (ESI) i jonizacji chemicznej
pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI)
wykorzystano źródła jonów DuoSpray™
i Turbo V™. Wszystkie związki były
monitorowane na podstawie 2 par
MRM. Czas trwania każdego przejścia
MRM wynosił 5ms. Do analizy ilościowej
wykorzystano bardziej intensywny sygnał
MRM dla pierwszego przejścia, a drugi
MRM wykorzystano do jakościowego
potwierdzenia obecności związku
w oparciu o stosunek między obiema
parami jonów. Przykłady zamieszczono
na rycinach 2 i 5. Całkowita długość
cyklu dla metody ze zmianą polarności
wynosiła około 3 sekundy. Warunki
pracy urządzenia były następujące:
CUR 20, CAD 7, GS1 75, GS2 65,
IS 5000 i TEM 600. Chromatografia
została wykonana w 30°C, na kolumnie
faz odwróconych Phenomenex
Ultracarb (20) C18 250 x 4.5 mm
5µm. Całkowita prędkość przepływu
wynosiła 600µL/min. Zastosowano
elucję gradientową, rozpoczynając
od 95% A i utrzymując gradient przez
1 minutę przed przeprowadzniem do
50% A w ciągu 24 minut. Następnie od
25 minuty, w ciągu 10 minut obniżono
gradient do 4% A i utrzymano go na tym
poziomie przez kolejne 10 minut. Czas
ponownego zrównoważenia wynosił
10 minut a pełen cykl trwał 55 minut.
Rozpuszczalnik A zwierał wodę z 0,01%
kwasem mrówkowym a rozpuszczalnik B
acetonitryl z 0,01% kwasem mrówkowym.
Do monitorowania skuteczności ekstrakcji
przygotowano laboratoryjne próbki
kontrolne i próbki oraz wzbogacone
próbki rzeczne. Po wcześniejszym
przygotowaniu kartridża SPE (20 ml
metanolu i 40 ml wody), 1 l próbki
załadowano do kasety z prędkością
25,0 ml/min. Po załadowaniu, przez
15 minut przepuszczano przez kolumnę
azot, w celu wysuszenia próbki.
Następnie dodano 5 ml acetonitrylu do
złoża SPE i odstawiono na 15 minut.
Kartridże SPE eluowano grawitacyjnie
do 12 ml probówki z brązowego szkła.
Ostatecznie do ekstraktu dodano wodę
uzyskując końcową objętość 10 ml.
Do czasu analizy próbki przechowywano
w temperaturze 4°C±1°C. Rycina 3
przedstawia schemat procedury
przygotowania próbki.
Wyniki i dyskusja
Do zaprojektowania metody analizy tak
szerokiej gamy związków wykorzystano
technikę optymalizacji ilościowej
oprogramowania Analyst®. Ostatecznie
metoda zawierała anality i przejścia
MRM wymienione w tabeli 1. Krzywa
kalibracyjna została przygotowana
z użyciem wody/acetonitrylu (1/1)
w następujących stężeniach: 0,2; 0,4; 1,6;
3,1; 6,3; 25; 100 ng/ml. Dla wszystkich
monitorowanych związków osiągnięto
zależność liniową. Przykłady liniowości
przedstawiono na rycinie 4.
diklofenak
warfaryna
kwas klofibrowy
ibuprofen
kwas
acetylosalicylowy
chloramfenikol
Rycina 2. Nałożone na siebie dwa przejścia MRM dla sześciu wybranych analitów. Najczulsze przekształcenie
dla danego analitu, zaznaczone kolorem niebieskim, wykorzystano do analizy ilościowej. Współczynnik pola
powierzchni drugiego MRM, zaznaczonego na czerwono, wykrorzystano do potwierdzenia obecności związku.
przygotowanie
SPE 20 ml MeOH,
40 ml wody
1l wody
rzecznej
filtr
1l
przefiltrowany
nowe
SPE
przygotowana
SPE
50 µL
10 mL
Rycina 3. przygotowania próbki do ekstrakcji do fazy stałej
Próbki zebrano i wyekstrahowano metodą
opisaną powyżej. Do monitorowania
skuteczności ekstrakcji przygotowano
laboratoryjne próbki kontrolne
(LCS). Próbki te składały się z wody
wodociągowej wolnej od związków
docelowych. Następnie do wody dodano
wszystkie anality docelowe. Ostateczne
stężenie wszystkich analitów w LCS
wynosiło 20 ng/ml.
Stopień odzysku z LC wynosił od 30
do 115% dla wszystkich związków.
W oparciu o te wyniki oszacowano, że
wykorzystana procedura przygotowania
próbki jest odpowiednia dla pełnej analizy
przesiewowej opisanych związków.
W przyszłości, po opracowaniu
ostatecznej listy związków, dla każdej
klasy związków zostaną wybrane związki,
które pozwolą na dokładne monitorowanie
procedury przygotowania próbek. Jeśli to
możliwe, zostaną wybrane deuterowane
formy związków, które zostaną następnie
wykorzystane do monitorowania
skuteczności przygotowania próbek ale
nie do monitorowania powtarzalności
pracy urządzenia. W poprzedniej pracy
wykazano, że przy tak dużej liście
analizowanych związków, zastosowanie
wzorca wewnętrznego do monitorowania
powtarzalności urządzenia może
wprowadzić większy błąd otrzymanych
wyników analizy ilościowej.
Poziom ten został określony teoretycznie
przy użyciu wzorców i oszacowaniu
liniowości stężeń aż do zera. Tabela 2
przedstawia listę wybranych związków i ich
LLOQ. LLOQ dla wszystkich związków
zawierała się w zakresie około części na
miliard (ppb).
Teofilina 1
Chlortoluron 1
pestycyd
Teofilina 2
Chlortoluron 2
Sulfatiazol 2
antybiotyk
Wardenafil 1
regulator płodności
Sulfatiazol 2
Wardenafil 2
Rycina 4. Przykład kalibracji dla wybranych analitów.
Erytromycyna
Średni zmierzony stosunek = 1,0368
Ketorolak
Średni zmierzony stosunek = 0.6766
Meprobramat
Średni zmierzony stosunek = 0.0772
Rzeka 2, woda wpływająca
Erytromycyna
Średni zmierzony stosunek = 1,0898
tych związków w próbkach wody przy
zachowaniu niskich granic wykrywalności
i wysokiej selektywności. Potwierdzenie
obecności związków wykonano poprzez
jednoczesne monitorowanie drugiego
przejścia MRM i automatycznie wyliczenie
przez oprogramowanie Analyst® Reporter
odpowiadającego mu współczynnika
jonowego. Jonizacja elektrosprej ze
zmianą polarności okazała się być
najlepszą z zaproponowanych metod.
Autorzy
Christopher Borton, Hesham Ghobarah,
Loren Olson (Applied Biosystems –
obecnie AB SCIEX, Foster City, CA)
Bibliografia
1
„Analysis of Endocrine Disruptors,
Pharmaceuticals, and Personal
Care Products in Water Using Liquid
Chromatography/Tandem Mass
Spectrometry”, Brett J. Vanderford,
Rebecca A. Pearson, David J. Rexing,
Shane A. Snyder, Anal. Chem. 2003, 75,
6265-6274.
2
„Persistence of pharmaceutical
compounds and other organic
wastewater contaminants in
a conventional drinking-water-treatment
plant”, Paul E. Stackelberg, Edward
T. Furlong, Michael T. Meyer, Steven
D. Zaugg, Alden K Henderson, Dori
B Reissman, Science of the Total
Environment, 329 (2004) 99-113.
3
T. Furlong, Michael T. Meyer, Steven
D. Zaugg, Alden K Henderson, Dori
B Reissman, Science of the Total
Environment, 329 (2004) 99-113. „Water
Analysis: Emerging Contaminants and
Current Issues”, Susan D. Richardson
and Thomas Ternes, Anal. Chem. 2005,
77, 3807-3838.
4
„Detection of Estrogens in Aqueous
and Solid Environmental Matrices with
the API 5000™ LC/MS/MS System”,
Loeffler D., Ramil M., Ternes T., Suter
M., Schonenberger R., Aerni H.-R,
Konig S., Besa A., Application Note
Applied Biosystems (2006).
Ketorolak
Zmierzony stosunek = 0.5248
Meprobramat
Zmierzony stosunek = 0.0705
Rycina 5. Pomiar współczynników jonowych dla trzech wybranych analitów (erytromycyna, ketorolac, meprobamat)
w próbce wzorcowej i próbce wody wypływającej pobranej z rzeki 2. Pomimo niskiego poziomu wykrywalności,
jaki widoczny jest dla ketorolaku w próbce z rzeki 2, współczynniki jonowe obu MRM są w stanie potwierdzić
obecność tego związku względem próbki wzorcowej. Potwierdzenie MRM dokonywane jest automatycznie przez
oprogramowanie Analyst Reporter™.
Wykrycie każdego z analitów
potwierdzono na podstawie stosunków
pól powierzchni dwóch zebranych
MRM. W próbkach pobranych z rzeki 2,
w przypadku zarówno wody wpływającej
jak i wypływającej, stwierdzono
obecność erytromycyny, ketorolaku
i mebrobamatu oraz 20 innych związków.
Współczynniki jonowe próbek porównano
ze współczynnikami jonowymi wzorca,
co pozwoliło na potwierdzenie obecności
tych związków. Patrz rycina 5. Ostateczne
wyniki otrzymane dla próbek pobranych
z rzeki 1 i 2 zebrano na rycinie 6.
Wnioski
Wykazano, że analiza LC/MS/MS jest
odpowiednią metodą monitorowania
szerokiej gamy związków zaburzających
działanie hormonów obejmującej wiele
kategorii i klas chemicznych. Tryb
MRM pozwala na ocenę zawartości
TABELA WYNIKÓW RZEKA 1 – OBSZAR WIEJSKI
TABELA WYNIKÓW RZEKA 2 – OBSZAR MIEJSKI
Analit
woda wpływająca [c] woda wypływająca [c]
ng/L (ppt)
ng/L (ppt)
Analit
woda wpływająca [c] woda wypływająca [c]
ng/L (ppt)
ng/L (ppt)
Erytromycyna
3,08
53,5
Oksybenzon
ND
6,25
Karbamazepina
65,5
151,5
Bromacyl
ND
7,4
2, 4-D
ND
9,35
Diazepam
ND
0,3875
DEET
1,49
7,67
Wardenafil
ND
0,93
Sulfametyzol
13,15
13,3
Triklosan (Irgasan)
5,9
31,4
Kofeina
40,95
23,5
Kodeina
17,05
77,5
Cyprofloksacyna
3,805
ND
Diuron
1,375
4,345
Kotynina
2,05
ND
Trimetroprym
58,5
122,5
Linkomycyna
1,525
3,015
Wzrost o >2x
Karbamazepina
870
1305
W zakresie 2x
DEET
24
29,9
Ketorolak
2,49
3,06
Meprobramat
85,5
97,5
Atrazyna
1,075
0,875
Sulfamerazyna
95,5
74,5
Pentoksyfilina
6,6
3,385
Kofeina
57
13,5
Kotynina
14,4
ND
Symazyna
1,01
ND
Noretysteron
1,15
ND
Eryromycyna
134,5
ND
Winian tylozyny
4,275
ND
2, 4-D
3,24
ND
NW = nie wykryto
Obniżenie o >2x
Rycina 6. W wodzie wpływającej i wypływającej w rzece 1 wykryto osiem
związków z grup EDC i PPCP. Mimo wiejskiego otoczenia tej rzeki wykryto
obecność niskich steżeń powszechnie stosowanych herbicydów i leków.
Zgodnie z oczekiwaniami w rzece 2, ze względu na jej miejski charakter, wykryto
większą liczbę związków. W sumie wykryto 23 związki z grup EDC i PPCP od
niskich po średnie stężenia (w częściach na trylion, ppt). Wyniki te wykazały,
że możliwe jest wykonanie badania przesiewowego w kierunku fukcjonalnie
różnych związków podczas jednej analizy, przy zachowaniu wysokiej czułości
i dokładności analizy ilościowej.
Wyłącznie do celów naukowych. Nie stosować w diagnostyce laboratoryjnej.
Applera Corporation is committed to providing the world’s leading technology and information for life scientists. Applera Corporation consists of the Applied Biosystems and Celera
Genomics businesses. Applied Biosystems/MDS SCIEX is a joint venture between Applera Corporation and MDS Inc.
© Copyright 2007, Applera Corporation and MDS Inc. All rights reserved. Information subject to change without notice. Applera, Applied Biosystems and AB (Design) and are registered
of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries. API 4000, DuoSpray and Turbo V are trademarks of Applied Biosystems/MDS SCIEX, a joint venture
between Applera Corporation and MDS Inc. All other trademarks are the sole property of their respective owners.
Wydrukowano w USA, 04/2007, Publikacja nr 114AP61-01
Centrala
Siedziba Główna
353 Hatch Drive Foster City CA 94404 USA
500 Old Connecticut
Path | Framingham, MA 01701 USA
Telefon 650-638-5800
Phone 508-383-7700
www.absciex.com
sciex.com
Dział Sprzedaży Międzynarodowej
Dział Sprzedaży Międzynarodowej
Informacje na temat lokalnych biur sprzedaży można
Informacje
na temat lokalnych
biur
mozna
uzyskać telefonicznie
w centrali
lubsprzedazy
na naszej stronie
uzyskac
telefonicznie
w centrali lub na naszej stronie
internetowej
www.absciex.com/offices
internetowej sciex.com/offices