Changes of gene expression of osteoblast cells stimulated by
Transkrypt
Changes of gene expression of osteoblast cells stimulated by
ANNALES 2010 !"#$ %&#!%'(')#&*% +!"'%#)!','-+#"),!.# *%+'(/3,! 2 5#!# ,#%# ! +!*$#)%' %# *6 7 /*#/&!"!*%%/%#'(8'','-+',* )"#&+'()#!)# *6 1 9 1 8:8;1 58 2 8 7 5 8 15 <: 5 1 Changes of gene expression of osteoblast cells stimulated by hydroxyapatite and hydroxyapatite composite by protein microarray – preliminary study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n vivo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enes with unchanged expression 80 Number of genes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in vivo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in vivo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