Elektroforetyczna identyfikacja enzymów amylolitycznych i

Elektroforetyczna identyfikacja enzymów amylolitycznych i

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB
SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Elektroforetyczna identyfikacja enzymów
fosforolitycznych w tkankach roślinnych.
amylolitycznych
i
Cel ćwiczenia
Ćwiczenie poświęcone jest poznaniu metody rozdzielania enzymów amylolitycznych i
fosforolitycznych w żelu poliakrylamidowym oraz badania aktywności tych enzymów w
warunkach natywnych na zymogramach.
Wprowadzenie
W celu zbadania aktywności enzymów amylolitycznych i fosforolitycznych należy po
elektroforezie w warunkach natywnych przeprowadzić reakcję enzymatyczną w żelu, po
której można wybarwić żele pod kątem aktywności interesującego nas enzymu czyli otrzymać
zymogram. Żel stosowany do badania aktywności amylolitycznej zawiera skrobię, a
stosowany do badania aktywności fosforolitycznej - glikogen. W miejscu zatrzymania się
enzymu amylolitycznego powstanie jasny prążek, a tło pozostanie ciemne (barwienie
negatywowe), natomiast w miejscu zatrzymania się fosforylazy pojawi się ciemny prążek na
jasnym tle (barwienie pozytywowe).
Wykorzystywane na ćwiczeniach substraty - skrobia oraz glikogen są polisacharydami
zbudowanymi z reszt sześciowęglowego, redukującego cukru α-D-glukozy. Cząsteczki
glukozy połączone są wiązaniami α-1,4- i α-1,6-glikozydowymi. Wskutek reakcji
polimeryzacji glukozy, w cząsteczce skrobi dochodzi do wytworzenia jej dwóch frakcji
amylozy i amylopektyny (Rys 1). Amyloza zbudowana jest z nierozgałęzionych łańcuchów
połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, podczas gdy cząsteczki amylopektyny są
rozgałęzione, a rozgałęzienia w łańcuchach utworzone przez wiązania α-1,6-glikozydowe
występują dość regularnie co 25-30 reszt glukozy. Skrobia jest typowym materiałem
zapasowym roślin. Natomiast w glikogenie magazynowanym w mięśniach i w wątrobie
zwierząt nie obserwuje się 2 frakcji różniących się stopniem polimeryzacji (Rys 1).
Rozgałęzienia w łańcuchach glikogenu utworzone są również przez wiązania α-1,6glikozydowe, ale występują one częściej niż w amylopektynie, bo co 10-12 reszt glukozy.
Częstość występowania wiązań α-1,6-glikozydowych stanowi np. o rozpuszczalności skrobi i
glikogenu – skrobia po wyizolowaniu z roślin jest praktycznie nierozpuszczalna w wodzie w
niskich temperaturach, glikogen zaś dość dobrze rozpuszcza się w wodzie.
Rys. 1. wzory amylopektyny, amylozy i
glikogenu.
1
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB
SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Cząsteczki skrobi zależnie od ilości zawartej w nich amylozy i amylopektyny
adsorbują jod na swojej powierzchni, co daje zabarwienie niebieskie lub niebieskofioletowe.
Sama amyloza lub produkty częściowej degradacji skrobi, zależnie od wielkości ich
cząsteczek, dają zabarwienie fioletowe (dekstryny wysokocząsteczkowe), czerwone i
czerwonobrunatne (dekstryny o średniej masie cząsteczkowej). Dekstryny niskocząsteczkowe
nie tworzą kompleksu z jodem. Natomiast glikogen w niskich stężeniach barwi się z jodem na
kolor żółto-pomarańczowy.
Skrobia i glikogen są rozkładane przez enzymy amylolityczne. Są to jedne z
najwcześniej poznanych enzymów zaliczanych do klasy hydrolaz. Enzymy amylolityczne
występują z racji pełnionych funkcji we wszystkich organizmach żywych. Oprócz skrobi i
glikogenu hydrolizują pokrewne im oligo- i polisacharydy. Najważniejsze enzymy
amylolityczne to: α-amylaza (EC 3.2.1.1), β-amylaza (EC 3.2.1.2) oraz glukoamylaza (EC
3.2.1.3). Szczególnie wysoką aktywność enzymów amylolitycznych stwierdzono w
kiełkujących ziarniakach zbóż (słód pszenny lub jęczmienny) oraz w bulwie ziemniaka w
fazie kiełkowania. Amylazy różnego pochodzenia wykazują optimum aktywności w zakresie
pH 4,5-7,0, chociaż znane są enzymy, dla których wartość ta wynosi około 10,0. Optymalna
temperatura działania amylaz mieści się w granicach 30-50°C, a tylko dla niektórych
enzymów bakteryjnych (Bacillus licheniformis) jest bardzo wysoka (około 100°C). Amylazy
katalizują hydrolizę głównie wiązań α-1,4-glikozydowych w cząsteczkach substratu (Rys 2),
w wyniku czego zanika kompleks, jaki tworzy z jodem substrat przed hydrolizą. Zjawisko to
zostanie wykorzystane do lokalizacji pasm aktywności amylaz na zymogramie.
Rys. 2. Działanie amylaz na amylopektynę: α-amylaza hydrolizuje wiązania glikozydowe
wewnątrz cząsteczki polisacharydu, β-amylaza uwalnia β-maltozę, a glukoamylaza β-Dglukozę od nieredukującego końca cząsteczki.
Zymografia służy nie tylko badaniu aktywności enzymów hydrolitycznych. Metodę tę
stosuje się do identyfikacji innych enzymów pod warunkiem, że ubytek substratu lub przyrost
produktu można uwidocznić w postaci wyróżniających się z tła prążków. Tak jest na przykład
przy badaniu aktywności fosforylaz polisacharydów. Fosforylaza skrobiowa należy do klasy
transferaz (EC 2.4.1.1), katalizuje odwracalną reakcję przeniesienia reszty glukozy z
2
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB
SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
nieredukującego końca oligo- lub polisacharydu na fosforan (Rys. 3). W wyniku tej reakcji
powstaje o jedną resztę glukozy krótszy polisacharyd oraz glukozo-1-fosforan. Fosforylaza
skrobiowa podobnie jak zwierzęca fosforylaza glikogenowa współdziała z fosforanem
pirydoksalu (PLP) jako koenzymem. Fosforylazy różnego pochodzenia wykazują optimum
aktywności w zakresie pH 6,5-8,0. Optymalna temperatura działania fosforylaz mieści się w
granicach 30-50°C. Fosforylazy roślinne mogą wykorzystywać także glikogen jako substrat i
katalizować reakcje zarówno fosforolizy jak i dodawania reszt glukozy do cząsteczki
glikogenu. U roślin fosforylazy znajdują się w plastydach oraz w cytoplazmie. Te izoenzymy
różnią się nie tylko lokalizacją w komórce, ale również powinowactwem do substratów.
Izoenzym cytoplazmatyczny ma silne powinowactwo do skrobi i glikogenu, a izoenzym
plastydowy chętniej wykorzystuje oligosacharydy niż skrobię.
Rys 3. Reakcja katalizowana przez fosforylazę skrobiową z glikogenem jako
substratem.
W wyniku dodawania przez fosforylazę reszt glukozo-1-fosforanu do cząsteczek
skrobi lub glikogenu powstają dłuższe polimery jednak nie rozgałęzione, ponieważ
fosforylazy nie mają zdolności wytwarzania rozgałęzień w polisacharydzie. Takie wydłużone
łańcuchy np. glikogenu wykazują ciemnoniebieską barwę z jodem, inną niż
niezmodyfikowany substrat. Można to wykorzystać przy badaniu aktywność fosforylazy w
żelu po elektroforezie. Jest to lepszy sposób wizualizacji aktywności fosforylazy na
zymogramie, niż przy użyciu skrobi jako substratu, która z jodem tworzy niebieskofioletowy
kompleks.
Hydroliza skrobi i jej rozkład fosforolityczny nie przebiegają równocześnie w
komórkach. Rozkład hydrolityczny ma największe znaczenie dla degradacji skrobi
asymilacyjnej w chloroplastach, jak również podczas rozkładu skrobi zapasowej w trakcie
kiełkowania nasion czy też bulw ziemniaka. Fosforoliza natomiast, przeważa w warunkach
niekorzystnych dla wzrostu roślin, jakimi są zasolenie, chłód, susza.
Odczynniki
1. Bufor ekstrakcyjny: 50 mM jabłczan pH 5,4, zawierający 2,5 mM CaCl2 50 mm NaCl,
i 0,005% azydek sodu.
2. Gotowy do użycia 40% w/o roztwór mieszaniny akryloamidu N,N-metyleno-bisakryloamidu – w proporcji odpowiednio 37,5: 1
3. 0,5% roztwór skrobi (w/o)
4. 1% roztwór glikogenu (w/o)
5. 0,2 M bufor Tris-Gly pH 9,1
6. TEMED – N,N,N’,N’-tertrametyloetylenodiamina
7. APS (nadsiarczan amonowy) - 10% roztwór w/o
8. Woda dejonizowana
9. Bufor rozwijający - 0,05 M bufor Tris-Gly pH 9,1
10. 0,05% błękit bromofenolowy w 0,05 M buforze Tris-Gly pH 9,1
11. Glicerol
3
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB
SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
12. 0,006% roztwór jodu w jodku potasu – roztwór podstawowy do barwienia żeli na
aktywność fosforylaz oraz – 10-krotnie rozcieńczony jego roztwór do barwienia żeli
na aktywność amylaz
13. 0,2 M bufor cytrynianowy o pH 6,5, zawierający 10 mM glukozo-1-fosforan.
Wykonanie
Przygotowanie aparatu i żelu
Do wszystkich prac zaleca się stosowanie rękawiczek jednorazowych. Aparat do
elektroforezy (np. wyprodukowany przez Firmę Bio-Rad) przygotować zgodnie z zaleceniami
prowadzącego ćwiczenia, zwykle należy upewnić się czy mamy do dyspozycji wszystkie
ruchome elementy aparatu oraz odtłuścić szybki przy pomocy stężonego etanolu lub acetonu.
Kolejnym etapem jest złożenie szybek w statywie, aby powstały komory do wylania płytek z
żelem poliakryloamidowym (PA) zawierającym substrat (skrobię – enzymy amylolityczne
lub glikogen - fosforylazy).
Przygotowanie żelu rozdzielającego z substratem
Enzymy amylolityczne (7% PA z 0,05% skrobią): do czystej probówki typu Falcon
lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć następujące odczynniki (objętość całkowita
wynosić będzie 9,0 ml): 1,6 ml 40% roztworu mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu, 2,25
ml 0,2M buforu Tris-Gly (pH 9,1), 0,9 ml 0,5% roztworu skrobi rozpuszczalnej, 4,65 ml
wody dejonizowanej. Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować pipetę do
nakładania żelu wyskalowaną na 3,2 ml z czystą końcówką. Następnie dodać 10 µl TEMEDu
oraz 80µl 10% nadsiarczanu amonu (APS), wszystkie składniki szybko wymieszać i przenieść
do komór formujących żel 2x po 3,2 ml. Na koniec, na wylane między szybkami żele
nawarstwić 0,5 ml dejonizowanej wody w celu odcięcia dopływu powietrza i pozostawić bez
ruchu na 45 minut, możliwie nie narażając polimeryzujących żeli na szybkie zmiany
temperatur (np. otwarte okno).
Enzymy fosforolityczne (7% PA z 0,1% glikogenem): do czystej probówki typu
Falcon lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć następujące odczynniki (objętość całkowita
wynosić będzie 9,0 ml): 1,6 ml 40% roztworu mieszaniny akryloamidu i bisakryloamidu, 2,25
ml 0,2M buforu Tris-Gly (pH 9,1), 0,9 ml 1% roztworu glikogenu, 4,65 ml wody
dejonizowanej. Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować pipetę do nakładania żelu
wyskalowaną na 3,2 ml z czysta końcówką. Następnie dodać 10 µl TEMED`u oraz 80µl 10%
nadsiarczanu amonu (APS), wszystkie składniki szybko wymieszać i przenieść do komór
formujących żel 2x po 3,2 ml. Na koniec, na wylane między szybkami żele nawarstwić 0,5 ml
dejonizowanej wody w celu odcięcia dopływu powietrza i pozostawić bez ruchu, możliwie
nie narażając polimeryzujących żeli na szybkie zmiany temperatur (np. otwarte okno), na 45
minut.
Przygotowanie 4% żelu zagęszczającego (na dwie płytki)
Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, zlać ostrożnie nawarstwioną wcześniej
wodę do zlewu – przechylając ostrożnie zablokowane w statywie komory do formowania żelu
(wcześniej przechylić delikatnie żeby przekonać się, czy zaszła polimeryzacja). Do komór
włożyć pod kątem ok. 30-45 stopni grzebienie, tak aby po wlaniu żelu można było łatwo
wcisnąć je do komory – czynność tą przećwiczyć „na sucho”. Następnie do czystej probówki
typu Falcon lub zlewki o objętości 25-50 ml odmierzyć następujące odczynniki (objętość
całkowita wynosić będzie 10,0 ml): 1,0 ml 40% roztworu mieszaniny akryloamidu i
bisakryloamidu, 2,5 ml 0,2 M buforu Tris-Gly (pH 9,1), 6,39 ml wody dejonizowanej.
4
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB
SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
Składniki te dobrze razem wymieszać, przygotować pipetę wyskalowaną np. na 4,0 ml z
czysta końcówką. Następnie dodać 10 µl TEMED`u oraz 100 µl 10% nadsiarczanu amonu.
Wszystkie składniki szybko wymieszać i nanieść na żel rozdzielający poniżej 1-2 mm górnej
krawędzi niższej płytki. Płynnie wcisnąć grzebień, począwszy od końca niżej zanurzonego w
żelu, tak aby pod krawędziami grzebienia nie zebrały się pęcherzyki powietrza, nadmiar żelu
powinien wypłynąć z komory. Tak przygotowane płytki pozostawić do polimeryzacji.
Otrzymywanie ekstraktu z preparatów roślinnych lub mąki
a. Rozetrzeć w moździerzu 0,75 g drobno pociętej bulwy ziemniaka, a następnie zawiesić w 3
ml buforu ekstrakcyjnego. Uzyskany homogenat przenieść do 2 probówek Eppendorfa (po 1,5
ml homogenatu), wirować przez 5 min przy 10 tys. obrotów/min w 4°C. Uzyskany po
wirowaniu supernatant przenieść pipetą do czystej probówki Eppendorfa, opisać i pozostawić
w łaźni z lodem lub w lodówce do czasu naniesienia na przygotowany żel.
b. Ekstrakty z liści groszku zielonego lub kukurydzy przygotować analogicznie jak z bulwy
ziemniaka.
c. Odważyć 0,05 g wzorcowej mąki, naważkę przenieść do probówki typu Falcon dodać 10
ml buforu ekstrakcyjnego, wytrząsać przez 10 sekund, następnie pozostawić do sedymentacji.
Czynność tą powtórzyć w ciągu 15 minut 5-krotnie. Część zawiesiny odwirować w 2
probówkach na 1,5 ml i postąpić dalej jak w pkt a.
Rozdział elektroforetyczny ekstraktów
Upewniwszy się że nastąpiła polimeryzacja żelu wyciągnąć grzebienie, na podstawie
wskazówek prowadzącego ćwiczenia umieścić płytki z żelem w aparacie do elektroforezy
(zaznaczyć która płytka zawiera skrobię, a która glikogen). Następnie przepłukać studzienki
buforem rozwijającym i wlać bufor do odpowiedniego poziomu w komorze aparatu do
elektroforezy.
Przed naniesieniem na żel zmieszać uzyskany ekstrakt z glicerolem w proporcji 9:1
np. 450 µl ekstraktu i 50 µl glicerolu (otrzymując 10% o/o stężenie glicerolu), co ułatwi
nanoszenie prób do studzienek, do jednej studzienki bez ekstraktu, dodać roztwór błękitu
bromofenolowego o stężeniu 0,05%. Nanieść do studzienek różne ilości uzyskanych
ekstraktów (wg wskazówek prowadzącego np. 5 i 40 µl). Aparat do elektroforezy wstawić do
pojemnika z buforem rozwijającym i umieścić ostrożnie w pudełku styropianowym
wypełnionym lodem lub wstawić do lodówki. Elektroforezę prowadzić przy stałym napięciu
150V do momentu całkowitego wyjścia barwnika z żelu.
Wykrywanie aktywności enzymów amylolitycznych i fosforolitycznych
Na podstawie wskazówek prowadzącego ćwiczenia wyjąć płytki z żelem, rozdzielić
szybki, przy pomocy szerokiej łopatki odkleić żel od szybki i przenieść na szalkę Petriego.
Nie oddzielać żelu zagęszczającego od żelu rozdzielającego.
Żel zawierający glikogen (wykrywanie aktywności fosforylaz w kierunku syntezy
polisacharydu) po przepłukaniu dwukrotnym wodą destylowaną umieścić w 50 ml 0,2 M
buforu cytrynianowego o pH 6,5, zawierającego 10 mM glukozo-1-fosforan na 30-60 minut w
temperaturze pokojowej. Po tym czasie bufor zlać, żel przepłukać wodą destylowaną i
przenieść do wcześniej przygotowanego roztworu jodu w jodku potasu. Żel barwić do
momentu uzyskania kontrastu (ok. 10 sekund). Po tym czasie roztwór barwiący jodu w jodku
potasu zlać. Tło powinno być lekko żółte, miejsca gdzie znajdują się fosforylazy
5
Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB
SGGW w Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.
ciemnoniebieskie. Żel przepłukać wodą destylowaną i obejrzeć na transiluminatorze,
sfotografować.
Żel zawierający skrobię (wykrywanie aktywności amylolitycznej) po przepłukaniu
dwukrotnym wodą destylowaną umieścić w 50 ml 0,2 M buforu octanowego o pH 4,5 na 3045 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie bufor zlać, żel przepłukać wodą
destylowaną i przenieść do wcześniej przygotowanego roztworu jodu w jodku potasu. Żel
barwić do momentu uzyskania kontrastu (ok. 10 sekund). Tło powinno być ciemne, miejsca
aktywności amylaz- bezbarwne. Po tym czasie roztwór barwiący jodu w jodku potasu zlać,
żel przepłukać wodą destylowaną i obejrzeć na transiluminatorze, ewentualnie sfotografować.
Opracowanie wyników
Na podstawie analizy zymogramu porównać aktywności enzymatyczne badanych
ekstraktów, wskazać liczbę izoform amylaz lub fosforylaz zidentyfikowanych na podstawie
różnej mobilności w polu elektrycznym. Sprawdzić czy intensywność prążków obrazujących
aktywność enzymów jest proporcjonalna do ilości naniesionych ekstraktów.
1.
2.
3.
4.
5.
Literatura.
Albrecht T., Greve B., Pusch K., Kossmann J., Buchner P., Wobus U., Steup M. (1998)
Homodimers and heterodimers of Pho1-type phosphorylase isoforms in Solanum
tuberosum L. as revealed by sequence-specific antibodies. Eur J Biochem. 251: 343-352.
Alpha-amylase assay procedure (Ceraplha Method) for measurement of plant and
microbial alpha-amylases – Megazyme International Ireland 2011
Brust H, Orzechowski S, Fettke J., Steup M. (2013) Starch synthesizing reactions and
paths: in vitro and in vivo studies. J. Appl. Glycosci. 60: 3-20
Orzechowski S. (2008) Starch metabolism in leaves. Acta Biochm. Pol, 55: 435–445.
Weise S.E., Schrader S.M., Kleinbeck K.R., Sharkey T.D. (2006) Carbon balance and
circadian regulation of hydrolytic and phosphorolytic breakdown of transitory starch. Plant
Physiol 141: 879-886.
6