Laboratorium 04

Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
ĆWICZENIE 4
PROCESY TLENOWEGO I BEZTLENOWEGO ODDYCHANIA
KOMÓRKOWEGO – WYKORZYSTANIE W INŻYNIERII
ŚRODOWISKA
/Opiekun merytoryczny: dr hab. Teodora M. Traczewska, prof. nadzw. PWr
modyfikacja: dr inż. Agnieszka Trusz-Zdybek i mgr inż. Maciej Bełcik/
1.
Zagadnienia szczegółowe:
Oddychanie: oddychanie tlenowe, oddychanie komórkowe – etapy (glikoliza, cykl
Krebsa, łańcuch oddechowy) oddychanie beztlenowe (fermentacja i oddychanie
mineralne).
2.
Literatura zalecana
Maria Pawlaczyk-Szpilowa, „Biologia i ekologia” Wrocław 1997 s. 153-179.
3.
Materiały dodatkowe
Eldra P. Solomon, Linda R. Berg, Diana W. Martin, Claude A. Villee. 1996: Biologia,
Multico Oficyna Wydawnicza, Warszawa s. 162 – 183.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
Zad. 1: Określenie intensywności oddychania roślin wyższych (nasiona grochu) poprzez
oznaczanie ilości wydzielonego dwutlenku węgla.
Materiały:
- kiełkujące nasiona grochu
- 2 kolby stożkowe poj. 250 cm3 (w tym jedna z dopasowanym korkiem gumowym)
- gaza
- biureta
- 0,02 N Ca(OH)2
- 0,02 N (COOH)2
- fenoloftaleina - wskaźnik
Wykonanie:
Do 2 kolbek stożkowych o pojemności 250 cm3 należy wprowadzić po 50 cm3 0,02 n
Ca(OH)2. W jednej kolbie przeprowadzone będzie badanie próbki, a w drugiej badana będzie
tylko próba odczynnikowa (kontrola). Próbę kontrolna należy natychmiast miareczkować 0,02
n kwasem szczawiowym wobec fenoloftaleiny (ok. 5 kropli). W drugiej kolbce należy
umieścić 5 g kiełkujących nasion grochu na gazie i zawiesić tak, aby gaza zawisła
bezpośrednio nad powierzchnią wodorotlenku wapnia. Czas inkubacji powinien wynieść
1
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
minimum 30 min. Następnie należy zmiareczkować powstałą zawiesinę 0,02 n kwasem
szczawiowym wobec fenoloftaleiny (ok. 5 kropli).
Próbka kontrolna wykonana jest w celu oznaczenia ilości wodorotlenku wapnia
niezwiązanego podczas oddychania grochu (wartość A). Inkubacja próbki potrzebna jest do
tego, aby dwutlenek węgla związał się z wapniem i wytrącił się osad węglanu wapnia według
reakcji:
Ca(OH)2 + CO2 = CaCO3↓ + H2O
W trakcie miareczkowania kwasem szczawiowym wobec fenoloftaleiny określana jest
ilość wodorotlenku wapnia niezwiązanego (wartość B), według reakcji:
Część obliczeniowa:
Ilość wydzielonego CO2 przez nasiona obliczana jest z różnicy zużytego do
miareczkowania kwasu szczawiowego (wartość A-B). Różnica ta wyraża równoważną ilość
cm3 kwasu węglowego (0,02 n) związanego przez Ca(OH)2 w CaCO3. Ze względu na to, że
1 cm3 0,02 n kwasu szczawiowego odpowiada 0,44 mg CO2, należy obliczyć ilość
wydzielanego CO2 na 1 g masy nasion na 1 godzinę. Wyniki podać w tabeli:
Masa nasion
[g]
Miareczkowanie
A [cm3]
Miareczkowanie
B [cm3]
Różnica A-B
[cm3]
Natężenie
oddychania
[mg CO2/h]
Zad. 2: Wyznaczenie ubytku CO2 w procesie fermentacji alkoholowej.
Materiały:
- drożdże Saccharomyces cerevisiae (24 godzinna hodowla)
- 50 cm3 pożywki wg Ridera w kolbach stożkowych z rurkami fermentacyjnymi
- waga
- cieplarka
Wykonanie:
Pożywkę fermentacyjną wg Ridera zaszczepić zawiesiną drożdży Saccharomyces
cerevisiae. Zamknąć kolbę rurką fermentacyjną. Zważyć zestaw i zapisać. Drożdże
inkubować 7 dni w temperaturze 26 °C, a następnie ponownie zważyć zestaw.
Z różnicy wagi zestawu przed i po fermentacji obliczyć ubytek CO2 w molach, według wzoru:
, mol
2
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Zad. 3: Wykazanie produktów fermentacji masłowej
mikroflory pochodzącej z różnych środowisk.
zachodzącej
z
udziałem
Materiały i odczynniki:
- próbka badana (gleba, osad denny, osad czynny, woda powierzchniowa, piasek)
- probówki zamknięte szczelnymi korkami gumowymi ze sterylnym 2% roztworem
sacharozy
- łaźnia wodna o temp. 75-80 °C
- probówki
- roztwór chlorku żelaza(III)
Wykonanie:
Probówkę z 2% roztworem sacharozy zaszczepić badanym materiałem. Zawartość
probówki ogrzewać przez 10 minut w łaźni wodnej w temperaturze 75-80°C. Następnie
probówkę szybko schłodzić (pod zimną, bieżącą wodą), szczelnie zakorkować. Inkubować
przez 7 dni w temperaturze 20°C. Po inkubacji określić obecność kwasu masłowego
w próbce.
Obecność kwasu masłowego można stwierdzić na dwa sposoby:
- organoleptycznie – określić charakterystyczny zapach zepsutego masła
- doświadczalnie - pobrać 3 cm3 przesączonej hodowli do probówki, dodać 5 kropel chlorku
żelaza(III), podgrzać nad płomieniem palnika. W obecności kwasu masłowego pojawia się
brązowy maślan żelaza(III).
Zad. 4: Wykrywanie bakterii denitryfikacyjnych z udziałem mikroflory pochodzącej
z różnych środowisk.
Materiały i odczynniki:
- próbka badana (gleba, osad denny, osad czynny, woda powierzchniowa, piasek)
- probówki ze sterylnym bulionem z KNO3
- szkiełka zegarkowe
- odczynnik Griessa
- odczynnik Nesslera
Wykonanie:
Podłoże dla bakterii denitryfikacyjnych – bulion z KNO3 zaszczepić badanym
materiałem. Próby inkubować w temperaturze 20-22 °C minimum trzy dni. Po inkubacji
określić w sposób pośredni obecność bakterii denitryfikacyjnych w próbce.
Obecność bakterii denitryfikacyjnych można stwierdzić poprzez wykrycie produktów procesu
denitryfikacji na dwa sposoby:
- wizualnie – zaobserwować produkt denitryfikacji – gaz zgromadzony w rurce Durhama
i/lub w całej objętości cieczy
- doświadczalnie - przez wykrycie azotanów(III) odczynnikiem Griessa lub amoniaku
odczynnikiem Nesslera, zgodnie z instrukcją nr 3.
3
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Zad. 5: Wykrywanie obecności bakterii desulfurykacyjnych z udziałem mikroflory
pochodzącej z różnych środowisk.
Materiały:
- próbka badana (gleba, osad denny, osad czynny, woda powierzchniowa, piasek)
- słupki z pożywką Starkey’a (z octanem ołowiu(II))
- igła preparacyjna.
Wykonanie:
Wykonać posiew osadu dennego metodą kłutą. W tym celu sterylną igłę preparacyjną
zanurzyć w osadzie dennym i wkłuć w zestalony słupek agarowy z pożywką Starkey’a. Próby
inkubować w temperaturze 22-23 °C przez minimum 6 dni.
Po inkubacji wokół bakterii desulfurykacyjnych powstają brunatne, prawie czarne strefy
na skutek wytwarzania PbS co świadczy o występowaniu w badanym materiale bakterii
zdolnych do redukcji związków siarki(VI).
4