Podstawy rekonstrukcji obrazow mikroskopowych
Transkrypt
Podstawy rekonstrukcji obrazow mikroskopowych
Podstawy rekonstrukcji obrazów mikroskopowych w przestrzeni trójwymiarowej PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI (BT 231) Podstawy rekonstrukcji obrazów... BT 231 Podstawy rekonstrukcji obrazów mikroskopowych w przestrzeni trójwymiarowej Mikroskopia fluorescencyjna stanowi niezwykle uŜyteczne narzędzie w badaniach struktury i funkcji komórek. Dzięki moŜliwości zastosowania fluorochromów o zdolności wybiórczego wiązania się z badaną strukturą subkomórkową lub sprzęŜonych ze specyficznymi przeciwciałami lub sondami molekularnymi umoŜliwia ona złoŜone analizy zmian lokalizacji białek komórce w toku róŜnych procesów. Postęp technologiczny w automatyzacji sprzętu pozwolił na opracowanie urządzeń umoŜliwiających rekonstrukcje trójwymiarowe obrazów mikroskopowych, które okazały się szczególnie uŜyteczne przy badaniach preparatów, których grubość znacznie przekracza głębię ostrości optyki klasycznych mikroskopów fluorescencyjnych. Skaningowa mikroskopia konfokalna stanowi być moŜe najdoskonalsze narzędzie tego typu, które dzięki złoŜonemu układowi optycznemu odcinającemu sygnał pochodzący z rejonów preparatu pozostających poza ogniskiem obiektywu daje moŜliwość analizy struktury preparatu w osi Z, t.j. równoległej do osi optycznej układu. Jednak specyfika prowadzonych doświadczeń nie zawsze uzasadnia zakup takiego sprzętu. Rozwiązaniem pośrednim jest zastosowanie konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego szerokiego pola wyposaŜonego w zautomatyzowany układ zmieniający połoŜenie stolika zarówno w płaszczyźnie x,y jak i z, oraz moŜliwość prowadzenia rejestracji obrazów z kilku miejsc preparatu w czasie jednej sekwencji. Mikroskop Leica DM IRE jest przykładem układu mikroskopowego wyposaŜonego w oprogramowanie pozwalające jednocześnie na akwizycję obrazów mikroskopowych w trybie „z-stack” i złoŜone operacje na plikach graficznych, w tym ich dwu- i trójwymiarową dekonwolucję (w oparciu o funkcje rozproszenia (ang. point-spread function – PSF)). Celem ćwiczeń jest zapoznanie się z moŜliwościami mikroskopu Leica DM IRE2 oraz programu Leica FW4000 oraz Leica Deblur pozwalającymi na akwizycję obrazów mikroskopowych w przestrzeni trójwymiarowej i ich wstępna dekonwolucję. Cel doświadczenia: 1. Zapoznanie się z podstawowymi zasadami rządzącymi akwizycją i obróbką obrazów mikroskopowych w przestrzeni trójwymiarowej. 2. Poznanie zasad obsługi automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego Przebieg doświadczenia: Ćwiczenie podzielone jest na dwie części: 1. Wielokanałowa akwizycja obrazów preparatów fluorescencyjnych w przestrzeni trójwymiarowej 2. Zastosowanie technik dwu- i trójwymiarowej dekonwolucji do obróbki obrazów mikroskopowych Ad. 1. 1. Przygotuj do pracy mikroskop zgodnie z instrukcja z ćwiczeń p.t. „Automatyczny mikroskop fluorescencyjny - zastosowanie cyfrowych, chłodzonych kamer CCD w mikroskopii fluorescencyjnej” Uruchom program Leica FW4000 i zaloguj się jako Default 2 BT 231 Podstawy rekonstrukcji obrazów... 2. 3. 4. 5. 6. 7. BT 231 User i uruchom opcję Create New Experiment. Wprowadź nazwę doświadczenia (grupa[Nr]-1) i opis doświadczenia. Wciśnij klawisz Setup. Przyciśnij klawisz X/Y. W oknie Setup Fluorochromes wybierz odpowiednie bloki filtrów dla stosowanych fluorochrów (BrightField, DAPI, FITC i TRITC) Umieść pod mikroskopem preparat, wybierz obiektyw imersyjny x40 i ustaw przesłony do pracy w kontraście interferencyjnym Nomarskiego (przesłona kondensorowa: 40/63, pryzmat: E). Wybrać kanał dla światła przechodzącego (szara ikona). Włączyć podgląd obrazu na monitorze (ikona z zielonym kwadratem), ustawić odpowiedni czas otwarcia przesłony – taki, aby obraz na monitorze był najlepszy. Wykonać zdjęcie i zapisać obraz naciskając pole Save in LabBook. Operacje powtórzyć dla pozostałych kanałów optycznych. Z wykorzystaniem juŜ ustawionych parametrów doświadczenia (przez wybranie jako wzorca juŜ zapisanego eksperymentu) wykonać zapis innego miejsca preparatu przez kolejnych uczestników ćwiczeń -------------------------------------Dokonać wstępnego elektronicznego przetworzenia obrazów otrzymanych w trybie jednopłaszczyznowym wg następującego wzorca: 1. Obejrzeć obrazy uzyskane w trybie jednopłaszczyznowym poprzez funkcję Lab Book/Open existing exeriment/Review i wybrać najlepszy zestaw mikroforografii. 2. Uaktywnić jeden z kanałów fluorescencyjnych uruchomić następnie narzędzie deconvolution, ustawiając odpowiednie połoŜenie suwaków: haze removal, smoothing oraz spot removal ustawić najlepszy obraz dla danego kanału (podgląd przycisk review, porównanie z wyjściowym – toggle, powrót do wyjściowego obrazu reset). Po zakończeniu procedury wcisnąć przycisk „No Neighbours” 3. Operację powtórzyć dla wszystkich kanałów a następnie sporządzić obrazy złoŜone ustawiając odpowiednio intensywnść poszczególnych kanałów. Zapisać poszczególne obrazy w formacie bmp (File, save image as) w kartotece C:\pulpit\Cwiczenia\Grupa[X] ------------------------------------Akwizycja w przestrzeni trójwymiarowej 8. Wybrać kanał dla światła przechodzącego i uruchomić „Ŝywy” obraz preparatu 9. Zogniskować obiektyw w centralnej płaszczyźnie ogniskowej preparatu 10. Wyzerować pozycję stolika z górnego panelu kontrolnego (przycisnąć na około 5 sekund klawisz 2-gi z prawej) 11. Następnie przejść w tryb pracy „Z-stack”, aktywując przez naciśnięcie białego kwadratu i naciskając przycisk Z (uwaga: przy aktywnym trybie Z naleŜy powstrzymać się od „ręcznego” ustawiania ostrości preparatu !!!). 12. W oknie dialogowym „Z-stack” zidentyfikować diagram obrazujący aktualnie zadane płaszczyzny obrazu w osi Z, przyciski słuŜące zdefiniowaniu płaszczyzny granicznej górnej (set upper) i dolnej (set lower) i przycisk centrowania pozycji diagramu względem stolika. 13. Zadać odległość w osi Z między poszczególnymi płaszczyznami akwizycji na 1 µm 14. Zogniskować obiektyw w centralnej płaszczyźnie ogniskowej preparatu i przycisnąć klawisz „set to centre”. Następnie przesunąć płaszczyznę zaznaczoną kolorem zielonym w górę obserwując obraz mikroskopowy tak, aby obraz stał się nieostry (ok. 5µm ponad 3 BT 231 Podstawy rekonstrukcji obrazów... BT 231 płaszczyznę centralną-wyświetlane na panelu kontrolnym mikroskopu). Następnie przesunąć tę płaszczyznę poniŜej płaszczyzny centralnej, aby uzyskać ten sam efekt i przycisnąć klawisz „set lower”. 15. Na dole okna pojawi się wydruk liczby płaszczyzn, z których zbierany będzie obraz przy zadanym kroku. Zmienić kanał optyczny na fluorescencyjny i zweryfikować ustawienia płaszczyzn akwizycji obrazu. 16. Uruchomić zapisywanie obrazu przyciskiem - Capture 17. Obejrzeć zapisane obrazy naciskając przycisk - Review 18. Z wykorzystaniem juŜ ustawionych parametrów doświadczenia (przez wybranie jako wzorca juŜ zapisanego eksperymentu), zmodyfikować parametry stosownie do właściwości innych miejsc preparatu i wykonać jego zapis. 19. Wybrać najlepszy zestaw obrazów i wysłać do dalszej analizy (zaznaczyć wybrane obrazy klikając biały kwadrat przy nazwie i nacisnąć klawisz "Export selected Images to Image Processing" Ad.2 Przygotować obrazy uzyskane w trybie wielopłaszczyznowym do dekonwolucji w programie Leica Deblur. 1. Obejrzeć obrazy w trybie Maximum Projection (tryb ten sumuje płaszczyzny wybierając piksel o najwyŜszej wartości - intensywności) i tak jak poprzednio wybrać najlepszy zestaw obrazów uzyskanych w trybie „Z-stack”. 2. Zestaw wysłać do dalszej analizy (zaznaczyć obrazy z wybranego kanału klikając biały kwadrat przy nazwie, wejść do Menu - Gallery i nacisnąć - Export selected Images to Image Processing/Process/Send selection for processing/Send. Uruchomi się automatycznie program Leica Deblur. 3. W programie Leica Deblur moŜliwa jest nie tylko obróbka obrazów, ale równieŜ złoŜenia i obserwacje zestawu obrazów w róŜnych płaszczyznach (X,Y; XZ i YZ),w trybie Maksymalnej i Minimalnej projekcji, jego rekonstrukcje trójwymiarowe i przegląd "slice after slice". 4. Program Leica Deblur umoŜliwia przeprowadzenie kilku typów dekonwolucji, zarówno dwu-, jak i trójwymiarowej, spośród których najbardziej zaawansowana jest tzw. ślepa dekonwolucja trójwymiarowa (pkt.6). W celu porównania działania obu typów dekonwolucji wybrany zestaw mikrofotografii wyświetlić w trybie "slice viewer". 5. Otwórz menu Deconvolution i w Pasku zadań i uruchom okno okno 2-D Blind Deconvolution. W oknie dialogowym zaznacz (Multiple frames) i zdefiniuj liczbe iteracji na 20. Przyciśnij ikonkę Start. Porównaj obraz zdekonwoluowany z obrazem oryginalnym wykorzystując tryb "slice viewer" i MaxProjection 6. Uruchom okno 3D Deconvolution. W otwartym oknie dialogowym sprawdź zgodność zadanych parametrów drogi optycznej ze stanem faktycznym, zaznacz wariant Best/High/Moderate. Ustaw liczbę iteracji na 60/Save interval na 30. Przyciśnij Start. Wynik powinien pojawić się po kilku minutach. Porównaj zdekonwoluowane obrazy w trybie 2D i 3D przy uŜyciu trybu "Clice viewer" i "Crop". Operacje powtórzyć na zestawach obrazów z innych kanałów. 4 BT 231 Podstawy rekonstrukcji obrazów... BT 231 Zagadnienia: − Zasada działania mikroskopii szerokiego pola i mikroskopii konfokalnej − Podstawowe zasady obsługi mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM IRE Zalecana literatura: − Podstawy biologii komórki, Wprowadzenie do biologii molekularnej pod redakcją B. Alberts`a − Automatyczny mikroskop fluorescencyjny - zastosowanie cyfrowych, chłodzonych kamer CCD w mikroskopii fluorescencyjnej – instrukcja do ćwiczeń 5 BT 231