Technika pirolizy i mikroskopii sił atomowych w badaniu struktury

&ARM0RZEGL.AUK†
4ECHNIKAPIROLIZYIMIKROSKOPIISIŒATOMOWYCH
WBADANIUSTRUKTURYSYNTETYCZNEJMELANINYZTYROZYNY
INATURALNEJMELANINYZ3EPIAOFFICINALIS
0YROLYSISANDATOMICFORCEMICROSCOPYINSTRUCTURALSTUDIES
OFSYNTHETICTYROSINE†MELANINANDNATURALMELANIN
FROM3EPIAOFFICINALIS
%WA#HODUREK3ŒAWOMIR+URKIEWICZ!RTUR4UREK!NDRZEJ-ARCINKOWSKI"ARBARA4RZEBICKA
!NNA$ZIER˜ÃGA†,ÃCZNAR+RYSTYNA3TÃPIEÊ:OFIA$ZIER˜EWICZ
+ATEDRAI:AKŒAD"IOFARMACJI
+ATEDRAI:AKŒAD!NALIZY)NSTRUMENTALNEJ
7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
#ENTRUM-ATERIAŒÌW0OLIMEROWYCHI7ÃGLOWYCH0OLSKA!KADEMIA.AUK:ABRZE
Streszczenie
Abstract
Dokładna struktura chemiczna melanin wciąż nie jest do
końca poznana. Wynika to między innymi z silnych połączeń węgiel-węgiel pomiędzy jednostkami monomerycznymi budującymi dany pigment. W niniejszej pracy w celu
uzyskania dodatkowych informacji na temat budowy polimerów melaninowych wykorzystano nowoczesne metody
badawcze takie jak: pirolizę połączoną z chromatografią
gazową i spektrometrią mas (Py-GC/MS) oraz mikroskopię sił atomowych (AFM). Badaniom poddano syntetyczną
melaninę otrzymaną z tyrozyny (Tyr-melaninę) oraz naturalną melaninę z Sepia officinalis (sepiomelaninę), stanowiące model ludzkiego pigmentu eumelaninowego. Wyniki
pracy uwidaczniają różnice strukturalne pomiędzy Tyr-melaniną a sepiomelaniną i wskazują, że skład chemiczny zależy przede wszystkim od rodzaju substratu oraz warunków
w jakich te pigmenty powstają.
Chemical structure of melanin pigments is still not recognized accurately. This is largely due to strong carboncarbon bonds between melanin monomer units. In this study, the modern research methods, i.e. pyrolysis connected
with gas chromatography and mass spectrometry (Py-GC/
MS), and atomic force microscopy (AFM) were used to
get some additional structural information on melanin polymers. Two models of human eumelanin pigment were
studied, namely: synthetic melanin obtained from tyrosine
(Tyr-melanin) and natural melanin from Sepia officinalis
(sepiomelanin). The results revealed structural differences between Tyr-melanin and sepiomelanin, and indicated
that chemical composition of melanin depends eventually upon its precursor type and specific conditions under
which the pigment has been formed.
Słowa kluczowe: Tyr-melanina, sepiomelanina, piroliza,
termochemoliza, mikroskopia sił atomowych
Wstęp
Melaniny są barwnikami występującymi zarówno
w świecie roślin, jak i zwierząt. Należą do grupy polimorficznych i wielofunkcyjnych polimerów [1-3]. Ilość i typ
melaniny w skórze, tęczówce, włosach decyduje o ich zabarwieniu [4, 5]. Melaniny pochodzenia zwierzęcego można
podzielić na dwie główne grupy: nierozpuszczalne brązowo-czarne pigmenty – eumelaniny i rozpuszczalne w wodorotlenkach żółto-pomarańczowe feomelaniny [6, 7].
Bardzo ważnym momentem w historii badań nad melaniną było określenie przez Bertranda w 1886 roku, że
prekursorem melaniny jest tyrozyna [8]. Pomimo faktu,
że melanina została opisana ponad 100 lat temu, to jednak
Key words: Tyr-melanin, sepiomelanin, pyrolysis, thermochemolysis, atomic force microscope
jej skład chemiczny i strukturalny nadal nie jest w pełni
poznany [9, 10]. Trudności te wynikają między innymi z
faktu, że jest ona prawie nierozpuszczalna, bardzo trudno
izoluje się ją oraz oczyszcza z białkowych i lipidowych
komponentów melanosomu. Ustalono, że eumelanina
składa się głównie z jednostek indolowych i pirolowych,
natomiast feomelanina zawiera przede wszystkim jednostki benzotiazynowe i benzotiazolowe [11-13]. Jednakże,
w rzeczywistości naturalne melaniny to kopolimery zawierające w różnych proporcjach eumelaninę i feomelaninę [14,
15].
W badaniach właściwości fizykochemicznych melanin
zaleca się stosowanie dostępnego komercyjnie i dobrze
scharakteryzowanego preparatu melaninowego, co umożli-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
wia badaczom wzajemne porównywanie wyników. Melaniny otrzymane z woreczków atramentowych mątwy (Sepia
officinalis) i guzów czerniaka złośliwego (melanoma malignum) są powszechnie używanymi modelami naturalnych
eumelanin [16, 17]. Ze względu na specyficzne właściwości naturalnego pigmentu w badaniach biochemicznych
i fizjologicznych często wykorzystuje się syntetyczne melaniny, otrzymane z takich prekursorów, jak: tyrozyna, 3,4-dihydroksyfenyloalanina (DOPA), 5,6-dihydroksyindol (DHI)
i kwas 5,6-dihydroksyindolo-2-karboksylowy (DHICA) [4,
18-19].
Celem pracy było wykorzystanie techniki pirolizy i termochemolizy w różnicowaniu profili pirolitycznych syntetycznej melaniny z tyrozyny i melaniny naturalnej z Sepia
officinalis oraz obrazowanie i charakterystyka nanostruktury badanych biopolimerów za pomocą mikroskopii sił atomowych.
Materiał i metody
W badaniach wykorzystano komercyjnie dostępne wzorce pigmentu eumelaninowego:
- syntetyczną melaninę otrzymaną z tyrozyny w obecności H2O2 (SIGMA)
- naturalną melaninę z Sepia officinalis (SIGMA).
Piroliza i termochemoliza w badaniu struktury modelowych eumelanin
Do degradacji biopolimerów melaninowych wykorzystano pirolizer firmy Pye Unicam bezpośrednio zainstalowany do układu GC-MS.
Melaninę w ilości 50 μg nanoszono na drut ferromagnetyczny o średnicy 0,5 mm i długości 10 cm, o temperaturze
Curie 770 °C. Proces pirolizy prowadzono w atmosferze
helu, który pełnił także rolę gazu nośnego w rozdziale chromatograficznym. Temperatura komory pirolizera wynosiła
220 °C, a czas trwania pirolizy 8 sekund.
W technice termochemolizy dodatkowo na drut pirolityczny po nałożeniu melaniny wprowadzano 5 μl 10% wodorotlenku tetrametyloamoniowego (TMAH) jako czynnika
metylującego.
W celu rozdzielenia produktów pirolizy i termochemolizy melanin zastosowano chromatograf gazowy model HP 5890 seria II firmy Hewlett Packard. Produkty
termicznej degradacji melanin rozdzielono na kolumnie kapilarnej Rtx ®- 5MS (firmy Restek) o wymiarach:
długość 60 m, średnica wewnętrzna 0,32 mm, grubość
filmu 0,5 μm. Szybkość przepływu gazu nośnego wynosiła 1,8 cm3/min. Analizę chromatograficzną prowadzono wykorzystując programowane ogrzewanie kolumny
(początkowa temperatura 40 oC była utrzymywana przez
5 min., następnie wzrastała z prędkością 10 oC/min do
220 oC).
Identyfikacji produktów pirolizy i termochemolizy
melanin po ich rozdziale chromatograficznym dokonano
przy użyciu spektrometru mas model HP 5989A firmy
Hewlett Packard. Temperatura źródła jonów wynosiła 200 °C, a kwadrupola 100 °C. Jonizację prowadzono strumieniem elektronów przy standartowej energii
70 eV.
Obrazowanie nanostruktury modelowych eumelanin za
pomocą AFM
Obrazowanie nanostruktury biopolimerów melaninowych prowadzono za pomocą mikroskopii sił atomowych
(ang. Atomic force microscopy – AFM) przy użyciu zestawu NanoScope III d MultiMode (di-Veeco, CA). Badania
te przeprowadzono w Centrum Materiałów Polimerowych
i Węglowych Polskiej Akademii Nauk w Zabrzu.
Próbki melanin nanoszono w formie suchego zmikronizowanego proszku na szklane krążki. Skanowanie powierzchni polimerów odbywało się w temperaturze pokojowej w powietrzu przy użyciu skanera piezoelektrycznego
10 μm. W tym celu zastosowano ostrze wykonane z krzemu
(Model TESP, Veeco, CA). Częstotliwość skanowania wynosiła 1 Hz. Badania topografii naniesionych próbek wykonano techniką przerywanego kontaktu (ang. tapping mode).
Do analizy obrazów AFM wykorzystano oprogramowanie
WsxM 4.0 (Nanotec Electronica, Spain) [20]. Każdorazowo
uzyskiwano dwa rodzaje obrazów „Height” i „Deflection”.
Obraz „Height” pozwala na określenie topografii badanego
biopolimeru, natomiast obraz „Deflection” umożliwia bezpośrednią obserwację cech morfologicznych.
Wyniki
Na ryc. 1A przedstawiono chromatogram produktów
termicznej degradacji wzorca melaniny otrzymanej z tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru (Tyr-melaniny). Łatwo
zauważyć, że w obrazie chromatograficznym Tyr-melaniny
wśród produktów pirolizy dominuje związek o czasie retencji 9,43 min, zidentyfikowany jako pirydyna. Dodatkowo
pod względem ilościowym wyróżniają się: kwas octowy
(5,22 min), 3 (4)-pirydynokarbonitryle (15,41 i 16,12 min).
W mniejszych ilościach wykryto: benzen (7,07 min), pirol
(9,70 min), toluen (10,09 min), fenol (15,37 min), benzoni-
Ryc. 1. Chromatogram rozdziału produktów (A) pirolizy,
(B) termochemolizy Tyr-melaniny.
&ARM0RZEGL.AUK
Ryc. 2. Chromatogram rozdziału produktów (A) pirolizy,
(B) termochemolizy melaniny z Sepia officinalis.
4-metylofenol (17,32 min), benzylonitryl (18,78 min) oraz
3-metyloindol (23,06 min). Zaobserwowano także nieznaczny
udział produktów o czasach retencji 8,96 i 11,13 min, których
nie udało się zidentyfikować. Zastosowanie termochemolizy
(ryc. 2B), podobnie jak w przypadku Tyr-melaniny, pozwoliło na uzyskanie większej liczby produktów w formie
metylowych pochodnych. Dodatkowo w końcowym odcinku tego pirogramu (25-35 min) pojawiły się związki, które
prawdopodobnie mogą pochodzić z rozpadu lipidów. Są to
estry metylowe kwasów tłuszczowych: tetradekanowego
(27,18 min), heksadekanowego (30,08 min), oktadekanowego (33,97 min) oraz n-alkeny: 1-heksadeken (25,80 min)
i 1-oktadeken (30,48 min).
Z przedstawionego na ryc. 3 zestawienia produktów pirolizy i termochemolizy Tyr-melaniny i sepiomelaniny wynika, że zawartość procentowa produktów badanych melanin zależy od źródła pochodzenia barwnika oraz warunków
syntezy. Wśród składników pirolizatu i termochemolizatu
otrzymanego z Tyr-melaniny dominują pochodne pirydyny,
natomiast w profilu pirolitycznym melaniny wyizolowanej
z Sepia officinalis dominują pochodne pirolu. Dodatkowo
w profilu badanych melanin stwierdzono obecność pochodnych benzenu i fenolu. Natomiast wśród produktów pirolizy
i termochemolizy Tyr-melaniny nie wykryto indolu i jego
pochodnych. Poza tym tylko w wyniku termochemolizy sepiomelaniny otrzymano produkty pochodzenia lipidowego,
tj.: estry metylowe kwasów tłuszczowych. Przedstawione
zestawienie relacji ilościowych między grupami głównych
produktów pirolizy i termochemolizy prowadzonej w obecności TMAH badanych melanin dowodzi o znacznym zróżnicowaniu ich profili pirolitycznych.
Różnice pomiędzy syntetyczną Tyr-melaniną a naturalną sepiomelaniną zaobserwowano również podczas analizy
obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopii sił atomowych
(AFM).
Obrazy AFM „Deflection” i „Height 2D” dostępnego
handlowo wzorca syntetycznej eumelaniny uzyskane przez
skanowanie powierzchni o wielkości 3 μm x 3 μm ujawniają
granulkowatą strukturę tego biopolimeru. Obrazy pokazują
tryl (15,71 min) oraz 3,4-pirydynodikarbonyloimid (24,03
min). Zaobserwowano także nieznaczny udział produktu
o czasie retencji 17,35 min, którego nie udało się zidentyfikować.
Znacznie bogatszy profil pirolityczny (ryc. 1B) charakteryzuje Tyr-melaninę poddaną termochemolizie w obecności
TMAH. Analizując pirogramy (ryc. 1A-B) można zauważyć, że do wspólnych produktów pirolizy i termochemolizy
Tyr-melaniny należą: kwas octowy, benzen, pirydyna, pirol,
fenol i benzonitryl. Zaobserwowano, że podczas termochemolizy Tyr-melaniny zwiększa się udział metylowych pochodnych pirolu: 1-metylopirol (9,30 min), 2-metylopirol
(12,02 min) oraz pirydyny: 4-metylopirydyna (12,90
min). Dodatkowo stwierdzono obecność 1-metylo-2,5pirolidynodionu (17,75 min), estru metylowego kwasu pirydynokarboksylowego (18,32 min) oraz estru
dimetylowego kwasu pirydynokarboksylowego
(25,22 min), których nie wykryto podczas pirolizy tej melaniny. W pirogramie Tyr-melaniny
poddanej termochemolizie pojawiło się więcej
produktów niezidentyfikowanych (11,13; 16,55;
30,02 min), pochodzących prawdopodobnie
z termicznej degradacji TMAH.
Na ryc. 2A przedstawiono chromatogram
produktów termicznej degradacji naturalnego
wzorca eumelaniny-sepiomelaniny. W obrazie
chromatograficznym sepiomelaniny wśród produktów pirolizy dominują związki o czasach
retencji 9.40 i 9,71 min, zidentyfikowane jako
pirydyna oraz pirol. Dodatkowo pod względem
ilościowym wyróżniają się: toluen (10,10 min),
3 (2)-metylopirole (12,05 min, 12,31 min), fenol
(15,37 min) oraz indol (21,56 min). W mniejszych ilościach wykryto: kwas octowy (5,19 Ryc. 3. Analiza porównawcza produktów pirolizy i termochemolizy Tyrmin), benzen (7,06 min), styren (13,49 min), melaniny i sepiomelaniny (nz - związki niezidentyfikowane).
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
nia powierzchni o wymiarze
1 μm x 1 μm pozwoliło na
uzyskanie większego powiększenia badanego polimeru.
Obrazy AFM „Deflection”
i „Height 2D”(ryc. 5A i 5B)
ujawniają małe zróżnicowanie morfologiczne melaniny.
Poszczególne granulki mimo
różnych rozmiarów posiadają
Ryc. 4. Granulkowata nanostruktura melaniny syntetycznej otrzymanej z tyrozyny. Obrazy podobny kształt i wszystkie są
uzyskane za pomoca AFM: A - obraz „Deflection”, B – obraz „Height 2D”, C – obraz „He- jednostronnie zwężone. Scharakteryzowane obrazy „D2”
ight 3D”. Obszar skanowanej powierzchni próbki (3 μm x 3 μm).
(ryc. 4A, 4B, 5A i 5B) w pełni
korespondują z trójwymiarowymi obrazami (ryc. 4C i 5C).
Trójwymiarowe obrazy badanej melaniny ukazują ponadto
różnice wielkości pomiędzy
granulkami. W szczególności zjawisko to jest widoczne
w przypadku obserwacji
prowadzonych przy obrazie
o mniejszym powiększeniu
Ryc. 5. Granulki melaniny syntetycznej otrzymanej tyrozyny. Obrazy uzyskane za pomocą (ryc. 4C) uzyskanym przez
powierzchni
AFM: A – obraz „Deflection”, B – obraz „Height 2D”, C – obraz „Height 3D”. Obszar skanowanie
o
wielkości
(3
μm
x 3 μm). Na
skanowanej powierzchni próbki (1 μm x 1 μm).
szczególną uwagę zasługuje
fakt, że większość granulek
jest podobnej wysokości, tylko pojedyncze grudki są większe od pozostałych. Uzyskany
stożkowaty kształt na obrazach
„Height 3D” (ryc. 4C i 5C) dla
poszczególnych granulek jest
wynikiem skanowania powierzchni polimeru.
Zaobserwowano
istotne
różnice
w
obrazie
AFM
Ryc. 6. Obrazy uzyskane za pomocą AFM melaniny otrzymanej z Sepia officinalis:
A – obraz „Deflection”, B – obraz „Height 2D”, C – obraz „Height 3D”. Obszar skanowa- melaniny naturalnej uzyskanej z Sepia officinalis
nej powierzchni próbki (3 μm x 3 μm).
(ryc. 6 i 7) w porównaniu
z obrazami uzyskanymi dla
melaniny syntetycznej (ryc.
4 i 5). Struktura melaniny
uzyskanej z Sepia officinalis ujawnia dwie różne formy morfologiczne. Pierwszą
stanowi bryła nieforemna.
Jest to pojedynczy element
o wyraźnym zarysie i stosunkowo gładkiej powierzchni
(ryc. 6A-B). Jest on wyraźRyc. 7. Filamenty melaniny otrzymanej z Sepia officinalis. Obrazy uzyskane za pomocą
nie wyodrębniony z badanej
AFM: A – obraz „Deflection”, B – obraz „Height 2D”, C – obraz „Height 3D”. Obszar
powierzchni (6C). Skanoskanowanej powierzchni próbki (1 μm x 1 μm).
wanie obszaru o wielkości
1.0 μm x 1.0 μm pozwoliło
granulki różnej wielkości, pojedyncze, dobrze wyodrębnio- na obserwację bardziej złożonej nanostruktury. Obserwune. Natomiast nie obserwowano agregacji granulek w bar- je się podłużne dobrze wyodrębnione filamenty tworzące
dziej złożone elementy (ryc. 4A i 4B). Wykonanie skanowa- bardziej złożone elementy. Uzyskane obrazy „Deflecton”
&ARM0RZEGL.AUK
i „Height 2D” (ryc. 7A i 7B) ukazują wyraźne trzy filamety o porównywalnej długości, ułożone równolegle
do siebie i powiązane ze sobą. Trójwymiarowa struktura
przedstawiona na obrazie „Height D3” (ryc. 7C) przedstawia trzy filamenty położone w dwóch płaszczyznach.
Są one wyraźnie wyodrębnione z powierzchni. Dwa
większe filamenty położone są bezpośrednio na badanej
powierzchni. Na największym filamencie położony jest
trzeci najmniejszy wykazujący kontury odrębności.
Dyskusja
Do niedawna wnioskowanie o strukturze melanin opierało się głównie o metody chemicznej degradacji [21]. Niestety metody te mają kilka ograniczeń, takich jak: słaba powtarzalność, niedostateczna wydajność produktów degradacji oraz możliwość powstawania artefaktów podczas reakcji
degradacyjnych [22].
Metodą z powodzeniem wykorzystywaną do badania
struktury zarówno syntetycznych jak i naturalnych melanin jest piroliza połączona z chromatografią gazową
i spektrometrią mas (Py-GC/MS) [23, 24] oraz termochemoliza [25, 26]. Technika pirolizy polega na wykorzystaniu wysokiej temperatury z zakresu 500-800 °C w celu
termicznego rozkładu badanej próbki, a następnie rozdziale powstałych produktów za pomocą chromatografii
gazowej i ich identyfikacji na podstawie widm masowych
techniką spektrometrii mas. Produkty termicznej degradacji odzwierciedlają w dużym stopniu strukturę analizowanego biopolimeru, ponieważ jak wykazano, ryzyko pojawienia się artefaktów w trakcie pirolizy jest względnie
niskie [27]. Natomiast modyfikacją pirolizy jest technika
termochemolizy polegająca na dodaniu do badanej próby
odczynnika derywatyzującego, a następnie umieszczeniu
analizowanej próby w komorze pirolizera i analizie metodą
GC/MS. Z danych literaturowych wynika, że powszechnie
stosowanymi odczynnikami derywatyzującymi są: wodorotlenek tetrametyloamoniowy, wodorotlenek tetrabutyloamoniowy, wodorotlenek fenylotrimetyloamoniowy, wodorotlenek (m-trifluorometylofenylo)-trimetyloamoniowy
[27].
W niniejszej pracy badano strukturę syntetycznych oraz
naturalnych melanin metodą pirolizy i termochemolizy.
Analizie poddano wzorzec syntetycznej eumelaniny otrzymanej z tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru oraz wzorzec naturalnej melaniny z Sepia officinalis.
Doniesienia literaturowe wskazują, że sposób polimeryzacji, a tym samym ostateczna struktura melanin, zależy od
warunków syntezy [24, 28].
Badania techniką Py-GC/MS i Py-GC/MS w obecności
TMAH wykazały, że Tyr-melanina otrzymana w wyniku
utlenienia tyrozyny nadtlenkiem wodoru różni się strukturalnie od DOPA-melaniny otrzymanej w wyniku autooksydacyjnej polimeryzacji 3,4-dihydroksyfenyloalaniny [24].
W pirolizatach Tyr-melaniny dominującym produktem była
pirydyna i jej alkilowe pochodne. Fakt, że wśród produktów pirolizy i termochemolizy Tyr-melaniny stwierdzono
niższą sumaryczną zawartość piroli oraz że nie wykryto
indolu i jego pochodnych w porównaniu z DOPA-melaniną, może świadczyć o dużym udziale niezcyklizowanych
jednostek tyrozynowych w strukturze analizowanego polimeru.
Badania oparte na metodach chemicznej degradacji
wykazały, że melaniny naturalne są wysoce heterogennymi polimerami złożonymi z różnych jednostek monomerycznych, w tym głównie z jednostek DHI i DHICA
oraz z jednostek pirolowych [29]. Hydroliza zasadowa
poprzedzona utlenianiem sepiomelaniny nadtlenkiem
wodoru, pozwoliła na uzyskanie kwasów pirolowych:
głównie: kwasu pirolo-2,3,5-trikarboksylowego oraz
w mniejszych ilościach kwasu pirolo-2,3-dikarboksylowego i kwasu pirolo-2,3,4,5-tetrakarboksylowego [9,
30]. Sugeruje się jednak, że kwas pirolotetrakarboksylowy
jest sztucznie wytwarzany w środowisku zasadowym podczas chemicznej degradacji melaniny z Sepia officinalis.
Natomiast alkaliczne stapianie sepiomelaniny pozwoliło
na identyfikację wśród produktów degradacji DHI jak i
DHICA, jednak w niewielkich ilościach i dlatego próby wykorzystania tej reakcji do ilościowego oznaczenia
eumelanin w tkankach pigmentowanych zakończyły się
niepowodzeniem [21].
W prezentowanej pracy dokonano analizy sepiomelaniny techniką pirolizy i termochemolizy. Dominującym produktem termolizy tego wzorca eumelaninowego był pirol,
co jest zgodne z wynikami chemicznej analizy sepiomelaniny [9]. W melaninie tej wykazano obecność markerowych
produktów pochodzenia eumelaninowego (benzenu, pirolu,
pirydyny, fenolu, indolu i ich alkilowych pochodnych). Ponadto w profilu pirolitycznym melaniny z Sepia officinalis
poddanej termochemolizie, stwierdzono obecność estrów
metylowych kwasów tłuszczowych, które prawdopodobnie
pochodzą z degradacji lipidów. Liczne badania wskazują,
że melaniny pochodzenia naturalnego są silnie związane
z białkami i lipidami komórkowymi [23, 25]. Sugeruje to, iż
zastosowana procedura izolacji melaniny z Sepia officinalis
nie prowadzi do całkowitego oczyszczenia pigmentu z komponenty lipidowej.
Obecnie coraz częściej do badania struktury makromolekuł (białek, peptydów, kwasów nukleinowych, polimerów
oraz biopolimerów) wykorzystuje się nowoczesną metodę
mikroskopii sił atomowych (AFM) umożliwiającą zarówno
analizę topografii powierzchni, jak i badanie właściwości
tych związków. Do zalet metody AFM należą: wysoka rozdzielczość obrazu badanego materiału, zdolność do generowania trójwymiarowego obrazu oraz minimalizacja pracoi czasochłonności przygotowania biomateriału do analizy.
Technika AFM umożliwia obrazowanie badanego materiału
zarówno w warunkach in situ jak i w środowisku wodnym
[31].
Clancy i Simon [32] metodą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wykazali, że dominującą strukturą sepiomelaniny są agregaty złożone z pojedynczych
cząstek o średnicy 100- 200 nm. Natomiast metoda AFM
uwidoczniła, że cząstki tworzące agregaty nie stanowią
podstawowej jednostki strukturalnej melaniny z Sepia
officinalis, ale są zbudowane z wielu mniejszych elementów [33]. Potwierdzają to również wyniki prezentowanej
pracy, w której podczas analizy nanostruktury naturalnej
sepiomealniny wykazano złożoność struktury analizowanego filamentu.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Nosfinger i wsp., [34] wykazali brak podobieństwa
strukturalnego pomiędzy eumelaniną z Sepia officinalis oraz
syntetyczną eumelaniną.
Wyniki niniejszej pracy również wskazują na różnice
strukturalne pomiędzy Tyr-melaniną a melaniną z Sepia
officinalis. Wydaje się, że te różnice mogą wynikać z odmiennego sposobu powstawania analizowanych polimerów.
Syntetyczną Tyr-melaninę otrzymano w wyniku chemicznego utleniania tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru,
a więc w warunkach, które mogą prowadzić do oksydacyjnej degradacji powstającego pigmentu. Natomiast melanogeneza zachodząca w woreczku atramentowym mątwy jest
złożonym procesem enzymatycznym, którego ostateczny
efekt zależy od różnych czynników zarówno zewnątrz- jak i
wewnątrzkomórkowych [35].
Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach (grant nr KNW-2-128/09).
Piśmiennictwo
1. Riley P. Melanogenesis and melanoma. Pigment Cell
Res 2003; 16: 548-552.
2. Liu Y, Simon JD. Metal–ion interactions and the structural organization of Sepia eumelanin. Pigment Cell Res
2005; 18: 42-48.
3. Tran L, Powell B, Meredith P. Chemical and structural disorder in eumelanins: a possible explanation for broadband absorbance. Biophys J 2006;
90: 743-752.
4. Cano M i wsp. Magnetic properties of synthetic eumelanin-preliminary results. Photochem Photobiol 2008; 84:
627-631.
5. Ito S, Wakamatsu K. Quantitative analysis of eumelanin and pheomelanin in humans, mice, and other animals: a comparative review. Pigment Cell Res 2003;
16: 523-531.
6. Bennett DC. Ultraviolet wave bands and melanoma initiation. Pigment Cell Res 2008; 21: 520-524.
7. Wakamatsu K i wsp. Characterization of melanin in
human iridal and choroidal melanocytes from eyes
with various colored irides. Pigment Cell Res 2008;
21: 97-105.
8. Ito S. A chemist’s view of melanogenesis. Pigment Cell
Res 2003; 16: 230-236.
9. Ward W i wsp. Quantification of naturally occurring
pyrrole acids in melanosomes. Photochem Photobiol
2008; 84: 700-705.
10. Bush WD i wsp. Neuromelanins isolated from different
regions of the human brain exhibit a common surface
photoionization threshold. Photochem Photobiol 2009;
85: 387-390.
11. Wilczek A, Kondoh H, Mishima Y. Composition of
mammalian eumelanins: analyses of DHICA-derived
units in pigments from hair and melanoma cells. Pigment Cell Res 1996; 9: 63-67.
12. Lamoreux L, Wakamatsu K, Ito S. Interaction of major
coat color gene functions in mice as studied by chemical
analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell
Res 2001; 14: 23-31.
13. Nighswander-Rempel S i wsp. Time-resolved and steadystate fluorescence spectroscopy of eumelanin and indolic
polymers. Photochem Photobiol 2007; 83: 1449-1454.
14. Ito S, Wakamatsu K, Ozeki H. Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of
melanogenesis. Pigment Cell Res 2000; 13: 103-109.
15. Ito S, Wakamatsu K. Chemistry of mixed melanogenesis-pivotal roles of dopaquinon. Photochem Photobiol
2008; 84: 582-592.
16. Liu Y i wsp. Ion-exchange and adsorption of Fe(III) by
Sepia melanin. Pigment Cell Res 2004; 17: 262–269.
17. Seagle B i wsp. Photoprotection of human retinal pigment epithelium cells against blue light-induced apoptosis by melanin free radicals from Sepia officinalis.
Proc Natl Acad Sci 2006; 103: 16644-16648.
18. Lawrie K, Meredith P, McGeary R. Synthesis and polymerization studies of organic-soluble eumelanins. Photochem Photobiol 2008; 84: 632-638.
19. Nighswander-Rempel S i wsp. Solvochromic effects
in model eumelanin compounds. Photochem Photobiol
2008; 84: 620-626.
20. Horcas I i wsp. WSXM: a software for scanning probe
microscopy and a tool for nanotechnology. Rev Sci Instrum 2007; 013705.
21. Wakamatsu K, Ito I. Advanced chemical methods in
melanin determination. Pigment Cell Res 2002; 15:
174-183.
22. Ito S. Advances in chemical analysis of melanins. W:
The pigmentary system: physiology and pathophysiology. Red. Nordlund JJ i wsp. Oxford University Press.
New York 1998, 439-450.
23. Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. Structural investigations of
neuromelanin by pyrolysis-gas chromatography/mass
spectrometry. J Neural Transm 2006; 113: 729-734.
24. Chodurek E i wsp. Różnicowanie profili pirolitycznych
DOPA-melanin metodą GC/MS. Ann Acad Med Siles
2007; 61: 106-112.
25. Chodurek E i wsp. Termochemolysis as the useful metod to assess the purity of melanin isolated from the human melanoma malignum. Acta Pol Pharm 2008; 65:
731-734.
26. Stepień K i wsp. Melanin from epidermal human melanocytes: study by pyrolytic GC/MS. J Am Soc Mass
Spectrom 2009; 20: 464-468.
27. Moldoveanu S. Pyrolysis GC/MS, present and future
(recent past and present needs). J Microcolumn Separ
2000; 13: 102-105.
28. Bertazzo A i wsp. Application of matrix-assisted laser
desorption/ionization mass spectrometry to the detection of melanins formed from Dopa and dopamine. J
Mass Spectrom 1999; 34: 922-929.
29. Prota G. Melanins and melanogenesis. Academic Press.
San Diego 1992.
30. Ito S, Fujita K. Microanalysis of eumelanin and pheomelanin in hair and melanomas by chemical degradation and liquid chromatography. Anal Biochem 1985;
144: 527-536.
31. Ikai A i wsp. The world of nanobiomechanics: Mechanical imaging and measurement by atomic force microscopy. Elsevier Science 2008; 48-87.
&ARM0RZEGL.AUK
32. Clancy C, Simon J. Ultrastructural organization of
eumelanin from Sepia officinalis measurmed by
atomic force microscopy. Biochemistry 2001; 40:
13353-13360.
33. Liu Y, Simon DJ. Isolation and biophysical studies of
natural eumelanins: applications of imaging technologies and ultrafast spectroscopy. Pigment Cell Res 2003;
16: 606-618.
34. Nofsinger J, Forest S, Eibest L, Gold K, Simon J. Probing the building blocks of eumelanins using scanning electron microscopy. Pigment Cell Res 2000;
13: 179-184.
35. Palumbo A. Melanogenesis in the Ink Gland of Sepia
officinalis. Pigment Cell Res 2003; 16: 517-522.
data otrzymania pracy: 24.05.2010 r.
data akceptacji do druku: 02.06.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr Ewa Chodurek
Katedra i Zakład Biofarmacji
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląski Uniwersytet Medyczny
41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1
e-mail: [email protected]