Immunohistologia – odczyny dla antygenów związanych z komórką
Transkrypt
Immunohistologia – odczyny dla antygenów związanych z komórką
MIKROBIOLOGIA Tabela 17–1. Wybrane techniki immunologiczne B Technika Cel Przykłady zastosowania klinicznego Podwójna immunodyfuzja wg Ouchterlony’ego Wykrywanie i porównywanie antygenów i przeciwciał Wykrywanie antygenów grzybów Immunofluorescencja Wykrywanie i lokalizacja antygenu Wykrywanie antygenów wirusowych w bioptatach (np. wirusów wścieklizny i opryszczki) Metoda immunoenzymatyczna EIA Podobnie jak immunofluorescencja Podobnie jak immunofluorescencja Cytometria przepływowa Analiza antygenów komórkowych w populacji Ocena zgodności tkankowej – immunofenotypowanie Odczyn immunoenzymatyczny ELISA Ocena ilościowa antygenów i przeciwciał Wykrywanie antygenów wirusowych (np. rotawirusy) i ocena poziomu przeciwciał (np. anty-HIV) Western-blot Wykrywanie przeciwciał swoistych dla różnych frakcji antygenu Potwierdzenie obecności przeciwciał w kierunku wirusa HIV Odczyn radioimmunologiczny RIA Podobnie jak ELISA Podobnie jak ELISA Odczyn wiązania dopełniacza Oznaczanie miana swoistych przeciwciał Oznaczanie przeciwciał przeciwko różnym antygenom bakterii i grzybów Odczyn zahamowania hemaglutynacji Oznaczanie poziomu przeciwciał antywirusowych i serotypów wirusów Serokonwersja – stwierdzenie świeżej infekcji wirusem grypy, identyfikacja wirusów grypy Aglutynacja lateksowa Identyfikacja i wykrywanie antygenów i przeciwciał Oznaczanie czynnika reumatoidalnego, antygenów grzybów, antygenów grupowych paciorkowców Metoda podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony’ego używana jest natomiast do wyznaczania pokrewieństwa różnych antygenów, co przedstawiono na ryc. 17-1. W technice tej przeciwciało i antygen są umieszczane w oddzielnych dołkach wyciętych w agarze i mogą wędrować w swoim kierunku, aby połączyć się w kompleks. Widoczna linia precypitacyjna pojawia się w miejscu, w którym stężenie antygenu i przeciwciała się równoważy. Dzięki wzorowi linii precypitacyjnych metoda może również być użyta do określenia, czy antygeny są identyczne, czy też mają wspólne tylko niektóre epitopy (są częściowo identyczne) lub są zupełnie różne. Technika ta jest używana do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom grzybów (np. gatunki Histoplasma, Blastomyces i Coccidioides). W innych metodach immunodyfuzyjnych, antygen może być rozdzielony w agarze z użyciem elektroforezy, a następnie reagować z przeciwciałem (immunoelektroforeza), może być wciśnięty w agar zawierający przeciwciała z użyciem elektroforezy (elektroforeza rakietowa), lub antygen i przeciwciało mogą być umieszczone w oddzielnych dołkach naprzeciwko siebie i poruszać się dzięki elektroforezie w przeciwnych kierunkach (immunoelektroforeza przeciwprądowa). Immunohistologia – odczyny dla antygenów związanych z komórką Antygeny na powierzchni komórki lub w komórce mogą być wykrywane za pomocą oznaczeń immunofluorescencyjnych i immunoenzymatycznych (EIA). W bezpośredniej immunofluorescencji cząsteczka fluorescencyjna jest kowalencyjnie połączona z przeciwciałem wykrywającym antygen (np. królicze przeciwciała antywirusowe wyznakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)). W immunofluorescencji pośredniej znakowane fluorescencyjnie jest drugie przeciwciało swoiste względem pierwszego (np. kozie przeciwciało antykrólicze wyznakowane izotiocyjanianem fluoresceiny). Jest ono używane w celu wykrycia pierwszorzędowego przeciwciała przeciwwirusowego i zlokalizowania antygenu (ryc. 17-2 i 17-3). W EIA enzym, taki jak peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna, jest przyłączony do przeciwciała. Wykrywanie antygenu polega na tym, że po połączeniu ze znakowanym enzymem przeciwciałem, dodany substrat przekształca się w barwny związek. Alternatywnie przeciwciało modyfikowane przez przyłączenie cząsteczki biotyny (witamina H) może być zlokalizowane przez bardzo swoiste wiązanie cząsteczek awidyny lub streptawidyny. Cząsteczka fluorescencyjna lub enzym dołączony do awidyny lub streptawidyny pozwala na detekcję. Metody te są użyteczne w analizie próbek z biopsji tkanek, komórek krwi i hodowli tkankowych. Cytometria przepływowa może być używana do analizy immunofluorescencji komórek w zawiesinie i jest szczególnie użyteczna w identyfikacji i liczeniu limfocytów (immunofenotypowanie). W cytometrze przepływowym laser używany jest do wzbudzenia fluorescencji przeciwciał przyłączonych do komórek i do wyznaczenia rozmiaru komórek na podstawie rozpraszania światła. Komórki przepływają przez laser z szybkością 5000 komórek na sekundę, a analiza jest przeprowadzana elektronicznie. Sorter komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) jest cytometrem przepływowym, który może również izolować swoiste subpopulacje komórek na podstawie ich rozmiarów i fluorescencji w celu tworzenia hodowli tkankowych. 166 165_172_R17_Mikrobiologia-med.indd 166 2011-09-22 17:41:24