test płytkowy do oznaczania bakterii heterotroficznych

test płytkowy do oznaczania bakterii heterotroficznych

ANALIZA WODY PITNEJ
TEST PŁYTKOWY DO
OZNACZANIA BAKTERII
HETEROTROFICZNYCH (HPC)
Dan Kroll
Czym są heterotrofy?
Heterotrofy to organizmy, w tym większość mikroorganizmów, takich jak drożdże, pleśnie i bakterie,
które wykorzystują węgiel organiczny jako jedyne źródło węgla i energii. Różnią się one od organizmów autotroficznych, takich jak np. glony, które potrafią wykorzystywać dla swoich potrzeb węgiel
nieorganiczny i światło słoneczne. Do heterotrofów należy zdecydowana większość znanych bakterii
tlenowych i beztlenowych. Wiele organizmów heterotroficznych wykorzystuje związki węgla, takie
jak cukry, alkohole czy kwasy organiczne, jako źródło pożywienia. Istnieją jednak wyspecjalizowane
organizmy, które potrafią rozkładać celulozę, ligninę, chitynę, keratynę, złożone węglowodory, fenole
i inne substancje. Organizmy heterotroficzne występują powszechnie w glebie, wodzie, pożywieniu
i podłożu zbiorników wodnych.
Dlaczego warto wykonywać oznaczenia heterotrofów?
Mikroorganizmy rozwijają się w wodzie i w postaci biofilmu na elementach powierzchni, które mają z nią kontakt. Rozwój
tych organizmów po procesie uzdatniania wody jest nazywany wtórnym. Występowanie wtórnego rozwoju charakteryzuje
się zwiększonymi wartościami uzyskiwanymi w testach HPC przeprowadzanych na próbkach wody. Zwiększone wartości
HPC są powszechne w odcinkach sieci wodociągowej, w których znajduje się stojąca woda, w domowych instalacjach
wodno-kanalizacyjnych, wodzie butelkowanej, jak i w urządzeniach podłączonych do instalacji wodnej, takich jak zmiękczacze, filtry węglowe czy automaty z napojami.
Testy HPC są od dawna stosowane do kontrolowania jakości dostarczanej wody. Początkowo testy te wykorzystywano
przy sprawdzaniu skuteczności procesów uzdatniania wody, w szczególności filtracji piaskowej, i były one wskaźnikiem
bezpieczeństwa wody. Po tym, jak zwiększyła się dostępność technik monitorowania z wykorzystaniem bardziej szczegółowych wskaźników, takich jak bakterie E. coli i bakterie z grupy coli, popularność testów HPC zmalała. Jednak testy HPC
w dalszym ciągu są wymieniane w licznych rozporządzeniach i zaleceniach, a także są wartościowym narzędziem kontroli
procesów.
ANALIZA WODY PITNEJ
Oznaczenia HPC są wykorzystywane do:
• wykazywania skuteczności procesów uzdatniania wody jako pośredniego wskaźnika usuwania patogenów;
• sprawdzania obecności i liczby organizmów wykazujących rozwój wtórny, które niekoniecznie muszą mieć
znaczenie sanitarne;
• sprawdzania możliwości występowania zakłóceń w oznaczeniach opartych na fermentacji laktozowej bakterii
z grupy coli;
• ochrony zdrowia publicznego i zapobiegania zachorowaniom w ramach planów zapewnienia bezpieczeństwa wody;
• oceny zdolności łańcucha dostaw wody do dostarczania wody o określonej jakości;
• monitorowania pewnych etapów łańcucha dostaw, które są szczególnie ważne do zapewnienia bezpieczeństwa
wody pitnej;
• zapewniania skuteczności czyszczenia i konserwacji instalacji wodno-kanalizacyjnych w lokalach, w tym zbiorników
magazynujących, wystarczającej do zmniejszenia ryzyka dla zdrowia publicznego;
• dokonywania pomiarów skuteczności procesów filtracji i dezynfekcji;
• sprawdzania warunków panujących w systemach dystrybucji, wzrosty wyników HPC często wynikają z zastoju, utraty
stale obecnych środków dezynfekcyjnych, wysokich poziomów przyswajalnego węgla organicznego, podwyższonych
temperatur wody i dostępności składników odżywczych;
• monitorowania systemów chloraminowanych oraz systemów zawierających amoniak w wodzie źródłowej jako
prawdopodobny wskaźnik początku nitryfikacji;
• użytku w roli wskaźników pogorszenia smaku i zapachu oraz innych parametrów organoleptycznych.
Test płytkowy na oznaczanie heterotrofów (HPC):
Z definicji przedstawionej na początku wynika, że heterotrofy są szeroko definiowaną i zróżnicowaną grupą organizmów,
które do rozwoju potrzebują węgla organicznego. W ciągu ostatnich lat wprowadzono różne proste testy hodowlane,
mające na celu pozyskiwanie dużej grupy mikroorganizmów wodnych. Takie testy są określane mianem „testów płytkowych na oznaczanie heterotrofów” lub „testów HPC”.
Nie istnieje jednak uniwersalny test umożliwiający wykonywanie oznaczeń HPC. Ze względu na dużą różnorodność
dostępnych testów i występujących organizmów należy wybrać metodę odpowiednią dla miejsca, w którym zostaną
pobrane próbki, a następnie zwrócić szczególną uwagę na tendencje, a nie na samą liczność ich występowania. Niektóre
metody mogą okazać się lepsze niż inne dla danej próbki (tzn. mogą pozwalać na pozyskanie większej liczby organizmów).
Nie oznacza to jednak, że niektóre metody są prawidłowe, a inne nie, gdyż każda z metod jest wybiórcza dla innej
subpopulacji, która może występować w danej próbce lub nie. Oznaczenia heterotrofów metodą płytkową są najlepszym
przykładem parametrów określanych przez daną metodę.
Mimo że testy HPC są w pewnym stopniu ustandaryzowane, np. poprzez wykorzystanie agaru odżywczego lub agaru R2A,
stosowane metody obejmują warunki testowe określone przez użytkowników i prowadzą do uzyskania szerokiego spektrum wyników jakościowych i ilościowych. Przy wykorzystaniu nowszych metod (Reasoner i Geldreich 1985, znana także
jako R2A) można znacząco zwiększyć odsetek bakterii, które można wyhodować z próbek wody pitnej w porównaniu ze
starszymi metodami, takimi jak użycie agaru odżywczego. Wykorzystanie podłoża o niskiej wartości odżywczej (np. R2A),
lepiej dopasowanego do potrzeb mikroorganizmów występujących w wodzie pitnej w porównaniu z klasycznym agarem
odżywczym, pozwala na zwiększenie odsetka mikroorganizmów wodnych, które można oznaczać metodą hodowlaną.
Wadą tej metody jest długi okres hodowli (5–7 dni w temp. 28°C).
Nie istnieje jedna kombinacja odżywczych czynników wzrostu, temperatury, światła i czasu, która wspomagałaby wzrost
wszystkich gatunków i szczepów bakterii występujących w danej próbce wody. Doprowadziło to do powstania licznych,
różniących się od siebie metod oznaczeń, z których każda obejmuje inne podłoża hodowlane, czasy inkubacji czy temperatury. Typowe temperatury inkubacji obejmują zakres od 20°C do 40°C, inkubacja trwa od kilku godzin do siedmiu dni lub
nawet kilku tygodni, a podłoża są bogate w składniki odżywcze (np. agar odżywczy) lub ubogie (np. R2A). Metody hodowli
są również zróżnicowane i obejmują techniki posiewu powierzchniowego i wgłębnego oraz filtrację membranową.
Test HCP nie określa organizmów, które zostały wykryte. W rzeczywistości tylko niewielki odsetek aktywnych metabolicznie mikroorganizmów obecnych w próbce wody może rozwinąć się i zostać wykryty w dowolnym zestawie warunków;
wyhodowana populacja będzie różniła się znacząco w zależności od wybranej metody. Uważa się, że około 0,01 % mikroorganizmów wodnych należy do grupy bakterii heterotroficznych, które można hodować, a około 1 % żywych bakterii nie
nadaje się do hodowli. Współzależności w wynikach dla różnych próbek uzyskanych tą samą metodą oraz w wynikach dla
2
ANALIZA WODY PITNEJ
tej samej próbki uzyskanych różnymi metodami lub nawet tą samą metodą z niewielkimi modyfikacjami mogą być trudne
do wykazania, gdyż poszczególne badania mogą dawać bardzo różne wyniki. Same organizmy wyhodowane podczas
testów HCP mogą różnić się w zależności od miejsca, pory roku, a nawet między kolejnymi próbkami pobranymi z tego
samego miejsca. Mikroorganizmy pozyskane podczas testów HCP zazwyczaj obejmują te, które należą do naturalnej
(zwykle bezpiecznej) mikroflory wody: w niektórych przypadkach mogą one również pochodzić ze źródeł zanieczyszczenia
i/lub patogenów.
Całkowita liczba
heterotrofów
Agar
odżywczy
Testy Peel Plate
Agar R2A
Różne metody wykrywają różne subpopulacje z całkowitej populacji heterotrofów.
Wnioski
Źródło: Heterotrophic Plate Counts and Drinking-water Safety. The Significance of HPCs for Water Quality and Human Health. Redakcja:
J. Bartam, J. Cotruvo, M. Exner, C Fricker i A. Glasmacher. Opublikowano w imieniu Światowej Organizacji Zdrowia przez IWA Publishing,
Alliance House, 12 Caxton Street, London SW1H 0QS, Wielka Brytania. 2003
DOC042.60.20226.Mar16
Oznaczenia heterotrofów metodą płytkową (HPC) są użytecznym narzędziem do oceny próbek wody pitnej. Prawidłowe
zastosowanie monitoringu HPC pozwala na określenie skuteczności procesów uzdatniania wody, sprawdzenie jakości
bieżącego łańcucha dostaw i wskazanie potencjalnych wad w systemie. Podwyższona liczba bakterii heterotroficznych
może wskazywać na nieprawidłowe funkcjonowanie procesu lub nawet zagrożenie dla zdrowia publicznego. Wybór
i zastosowanie odpowiedniego testu HCP może pozwolić na właściwe określenie stanu wody pitnej w całym systemie
produkcji i dystrybucji.