Ocena aktywności dehydrogenazy mleczanowej komórek linii A549
Transkrypt
Ocena aktywności dehydrogenazy mleczanowej komórek linii A549
&ARM0RZEGL.AUK /CENAAKTYWNOuCIDEHYDROGENAZYMLECZANOWEJ KOMÌREKLINII!PODWPYWEMODDZIAYWANIAHOLOKSANU IWOLNOZMIENNEGOPOLAELEKTROMAGNETYCZNEGOpINVITRO !SSESSMENTOFACTIVITYOFLACTASEDEHYDROGENASEINCELLCULTURE EFFECTEDBY!OFHOLOXANANDLOWFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELD pINVITROSTUDY 2ENATA0OLANIAK2AFA*AKUB"UDAK)GA+WIECIEÊ%WA"IRKNER :AKAD"IOCHEMII/GÌLNEJ+ATEDRY"IOCHEMIIW:ABRZUgLSKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH +ATEDRAI:AKAD&IZJOLOGIIW:ABRZUgLSKIEGO5NIWERSYTET-EDYCZNEGOW+ATOWICACH Streszczenie Abstract Choroby nowotworowe są obecnie jednym z najistotniejszych problemów współczesnej medycyny. Preparatem stosowanym w chorobach nowotworowych jest holoksan, lek cytostatyczny, należący do związków alkilujących, o mechanizmie działania podobnym do cyklofosfamidu. Celem przeprowadzonego eksperymentu była ocena oddziaływania holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego na aktywność LDH [EC 1.1.1.27] w medium hodowlanym gruczolakoraka płuc linii A549 in vitro w różnych dawkach i określonym przedziale czasowym. LDH jest enzymem katalizującym ostatni etap glikolizy oraz traktowany jest jako marker przeżywalności komórek nowotworowych. Hodowlę prowadzono na linii gruczolakoraka płuc A549, w warunkach standartowych. Komórki potraktowano dwoma stężeniami holoksanu: 10 μg/ml medium i 40 μg/ml medium oraz poddano oddziaływaniu pola elektromagnetycznego. Grupę kontrolną stanowiły kolonie komórek nowotworowych nie zawierające w medium hodowlanym cytostatyku. Medium zbierano po 24 godzinach eksperymentu i oznaczano aktywności dehydrogenazy mleczanowej w grupie kontrolnej oraz grupach badanych. Na podstawie wyników uzyskanych w przeprowadzonych badaniach można stwierdzić że holoksan w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym oraz wolnozmienne pole elektromagnetyczne wpływa na zaburzenia procesów metabolicznych komórek gruczolakoraka płuc linii A549 hodowanych in vitro. Investigations were carried out on the effect of different holoxane concentrations and influence of extremely low frequency electromagnetic field on the lactase dehydrogenase, LDH, activity of aquamous cell carcinoma line A549 in vitro at different time intervals. The observation of experimental and control colonies of human line A549 was performed during 24 hours. The strongest inhibitory effect of holoxane on the activity of dehydrogenase lactase of cell carcinoma colonies was obtained for the drug concentration of 40 μg/ml after 24 hours. Our results strongly suggest that ELF-MF treatment on A549 carcinoma cell line statistically significantly changes culture medium enzymes activities in determined conditions. The alterations in investigated enzymes activities are also present in cytostatic (holoxan) pretreated cells. In conclusion, there is an influence of extremely low frequency electromagnetic field on biochemical transmutations in A549 murine squamous carcinoma cell line colonies dependent on time of exposure and dose of electromagnetic field and time of exposure to holoxan. Słowa kluczowe: gruczolakorak płuc, hodowla komórkowa, dehydrogenaza mleczanowa, pole elektromagnetyczne Key words: squamous cell carcinoma, cell culture, LDH, electromagnetic field COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. Wstęp Choroby nowotworowe są obecnie jednym z najistotniejszych problemów współczesnej medycyny. Preparatem często stosowanym w chorobach nowotworowych jest holoksan, lek cytostatyczny, należący do grupy związków alkilujących. Proces alkilacji polega na zastąpieniu atomu wodoru grupą alkilową, np. metylową lub etylową. Jego mechanizm działania jest podobny do cyklofosfamidu i podobnie jak trofosfamid jest jego pochodną. Działanie holoksanu jest niezależne od fazy cyklu komórkowego, powodując powstawanie wiązań mostkowych pomiędzy dwiema nićmi DNA [1]. Jak wszystkie cytostatyki alkilujące, hamuje wzrost komórek, ich podział, czynności i aktywność mitotyczną. W działaniu leczniczym i toksycznym, wykazuje zdolność do zaburzeń mitozy i podziału komórek szybko rosnących. Słabiej działa mielotoksycznie a silniej neurotoksycznie od cyklofosfamidu [2]. Metabolizowany jest w wątrobie do 4-hydroksyifosfamidu, który rozkłada się do akroleiny i ifosfamidu musztard, jako formy aktywnej. Jego metabolity są wydalane z moczem, głównie w postaci czynnej. Okres półtrwania tego preparatu wynosi około 7 godzin [1]. Stosowany jest w leczeniu paliatywnym różnych nowotworów. Podczas leczenia mogą jednak wystąpić między innymi zaburzenia ze strony układu pokarmowego, czynności krwiotwórczej, supresja szpiku oraz upośledzenie pęcherza moczowego i wątroby, a także wykazuje niepożądane działanie kardio- i pneumotoksyczne. Stosowany równocześnie z napromienianiem nasila reakcję popromienną. Prowadzenie hodowli komórkowych in vitro jest obecnie bardzo rozpowszechnionym modelem badawczym [3, 4]. Hodowle są prowadzone na różnych liniach komórkowych: hepatocytach, limfocytach, itp. [5-8]. Nowatorskim przedsięwzięciem naukowym opracowanym w Instytucie Badań nad Promieniotwórczością w Monachium [9] i zmodyfikowanym w Zakładzie Biochemii Ogólnej w Zabrzu SUM jest prowadzenie in vitro hodowli raka płaskonabłonkowego AT478 w postaci megakolonii. Istnieją doniesienia naukowe dotyczące zmian chorobowych związanych z występowaniem raków płaskonabłonkowych [10]. Istotny wydaje się być wpływ leków, w tym leków o działaniu cytostatycznym, na wzrost i przemiany metaboliczne badanych linii komórkowych in vitro, w tym właśnie holoksanu. Nie znaleziono jednak w przeglądanym piśmiennictwie danych dotyczących wpływu holoksanu lub innych preparatów cytostatycznych na hodowle megakolonii raka płaskonabłonkowego A549 in vitro. Celem przeprowadzonych badań była ocena wpływu holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego na aktywność dehydrogenazy mleczanowej, enzymu katalizującego ostatni etap glikolizy, w medium hodowlanym gruczolakoraka płuc linii A549 in vitro w różnych dawkach i określonym przedziale czasowym. Materiał i metody Hodowlę komórkową prowadzono na linii gruczolakoraka płuc A549. Jako podłoża hodowlanego użyto Dulbeco’s z L-glutaminą wzbogaconego płodową surowicą wołową. Hodowlę prowadzono w standartowych warunkach temperatury i atmosfery wzbogaconej w dwutlenek węgla. Do hodowli użyto butelek hodowlanych firmy Sarstedt [1]. Kolonie traktowano dwoma stężeniami holoksanu w ilości: 10 μg/ml i 40 μg/ml podłoża. Hodowlę kolonii prowadzono wg standartowej procedury: 1. butelkę zawierającą odpowiednią ilość komórek trypsynizowano mieszaniną trypsyny i EDTA przez kilka minut; 2. następnie usuwano mieszaninę trypsynizującą i przepłukiwano komórki medium hodowlanym; 3. po przepłukaniu, mechanicznie uwalniano komórki do medium wzbogaconego płodową surowicą wołową (FSC) o określonym stężeniu; 4. w butelkach hodowlanych w zaznaczonych miejscach nakrapiano zawiesinę komórek i inkubowano w określonych parametrach eksperymentu [5]. Kolonie podzielono na 5 grup badanych: 1. B1 – komórki 30 min poddano ekspozycji na działanie pola/ 24 godz.; 2. B2 – komórki podawano działaniu 10 μg/ml medium holoksanu/24 godz.; 3. B3 – komórki podawano działaniu 40 μg/ml medium holoksanu/24 godz.; 4. B4 – komórki podawano 30 min ekspozycji na pole elektromagnetyczne i działaniu 10 μg/ml medium holoksanu; 5. B5 – komórki podawano 30 min ekspozycji na pole elektromagnetyczne i działaniu 40 μg/ml medium holoksanu. Grupę kontrolną (K) stanowiły kolonie, hodowane w medium z surowicą bez dodatku holoksanu i nie narażone na działanie pola elektromagnetycznego. W badaniach zastosowano pole elektromagnetyczne o maksymalnej wartości MRS wynoszącej 0,14 mT (o częstotliwości od 3 Hz do 3 kHz), wytwarzane przez urządzenie MRS 2000 firmy MediConsult [6]. Po 24 godzinach od podania preparatu zbierano medium i oznaczano aktywność dehydrogenazy mleczanowej, LDH, metodą kinetyczną. Aktywność enzymu określano w próbach badanych w stosunku do próby kontrolnej (nie zawierającej w medium holoksanu) w IU/ml medium hodowlanego. Wyniki Wyniki badań zmian aktywności LDH w testowanych komórkach pod wpływem holoksanu i pola elektromagnetycznego zamieszczono w Tab. I i na Ryc. 1. Pod wpływem oddziaływania holoksanu w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym oraz pola elektromagnetycznego stwierdzono istotny statystycznie spadek aktywności LDH w grupach eksponowanych na sam cytostatyk, w porównaniu do grupy poddanej działaniu pola elektromagnetycznego i kontroli. Przy czym zaobserwowano, że pod wpływem pola aktywność LDH wzrosła, nie tylko w porównaniu do grup eksponowanych na cytostatyk (B2 i B3), ale także w stosunku do kontroli. Natomiast w grupie badanej poddanej działaniu większej dawki cytostatyku (B3) aktywność LDH spadła w porównaniu do wszyst- &ARM0RZEGL.AUK Tab. 1. Porównanie aktywności LDH w grupach badanych vs. kontroli testem t-Studenta (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001) K średnia 101,67 ±SD ±12,98 B1 111,35 * B2 61,32 ** B3 37,47 ** B4 62,55 ** ±6,28 ±4,85 ±2,88 ±1,81 140 Aktywność LDH [IU/ml] 120 K B1 100 K B1 80 B2 B2 B4 B3 60 B4 40 B3 B5 B5 20 0 grupy badawcze Ryc. 1. Aktywność LDH w grupach badanych i grupie kontrolnej. kich pozostałych grup badanych i grupy kontrolnej (Ryc.1, Tab. I). Porównano aktywności LDH w grupach badanych poddanych oddziaływaniu holoksanu i pola elektromagnetycznego (grupy B4 i B5) w stosunku do grupy badanej eksponowanej tylko na działanie pola elektromagnetycznego oraz grupy kontrolnej. Także tutaj stwierdzono znamienny wzrost aktywności LDH w grupie narażonej na działanie pola elektromagnetycznego w stosunku do grupy kontrolnej i pozostałych grup badanych (Tab. I). W grupie badanej B5 (komórki poddane oddziaływaniu większej dawki cytostatyku i pola magnetycznego) nastąpił spadek aktywności dehydrogenazy mleczanowej w stosunku do kontroli i pozostałych grup badanych. Porównując aktywności LDH w grupach badanych poddanych oddziaływaniu holoksanu w zastosowanych dawkach (grupy badane B2 i B3) i grupach poddanych ekspozycji na cytostatyk i pole magnetyczne (B4 i B5), stwierdzono spadek aktywności enzymu w grupach badanych z zastosowaną większa dawką holoksanu (40 μg/ml medium holoksanu). Zarówno w grupie eksponowanej na sam cytostatyk, jaki w grupie badanej cytostatyku i pola magnetycznego (Ryc.1, Tab. I). Dyskusja Proces glikolizy, proces przemian węglowodanów, stanowi podstawę metabolizmu komórki nowotworowej. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) jest enzymem katalizującym ostatni etap glikolizy, czyli jej aktywność wskazuje na zaawansowanie uszkodzenia komórki nowotworowej. LDH jest wskaźnikiem przeżywalności komórek nowotworowych, chorób kardiologicznych i chorób wątroby [6]. W piśmiennictwie znaleziono prace dotyczące aktywności całkowitego LDH w nowotworach badanych in vivo [11]. Dehydrogenazę mleczanową oznaczano w czerniaku [20], gdzie obok białka S100, któro jest jednym z istotniejszych B5 37,20 ** ±4,08 markerów tego nowotworu [14], LDH należało do standardowych wskaźników [8]. Podobnie, w pracy dotyczącej autotransplantacji komórek krwiotwórczych w chłoniaku Hodgkina [12]. Na podstawie uzyskanych wyników badań, stosując kombinację chemioterapii i chemioradioterapii w chłoniaku Hodgkina uzyskano wyleczenie chorych w 80%. Liczba chorych opornych na chemioterapię lub z nawrotem choroby po pierwotnie pozytywnej reakcji na zastosowane leczenie wynosiła jedynie 20% [13-17]. W pracy tej, autorzy traktują aktywność LDH, jako jeden z głównych czynników prognostycznych. Aktywność LDH traktowano jako ważny parametr w ocenie przydatności naczynio-ośrodkowego czynnika wzrostu (VEGF) w diagnostyce płynu opłucnowego. W wyniku badań stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy VEGF a LDH w płynie opłucnowym. [13, 14]. Do nowotworów w przebiegu których, istotne znaczenie ma aktywność LDH należy drobnokomórkowy rak płuca [15]. Schorzenie to jest jednym z najbardziej złośliwych nowotworów, szybko uodparniający się na stosowane leczenie. LDH jest ogromnie ważnym czynnikiem prognostycznym w leczeniu tego nowotworu, natomiast podzielone są opinie autorów mówiące o wykorzystaniu oznaczenia aktywności LDH jako czynnika predykcyjnego w stosunku do zastosowanego leczenia [18, 19]. Badania wykazały istotny statystycznie związek pomiędzy aktywnością LDH a odpowiedzią na pierwotne leczenie chemiczne. Autorzy sugerują związek pomiędzy aktywnością badanego enzymu a długością przeżyć pacjentów chorych na drobnokomórkowego raka płuca [4]. W badaniach przedstawionych w niniejszej pracy oceniano aktywność całkowitej dehydrogenazy mleczanowej pod wpływem oddziaływania holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego w mediach komórkowych gruczolakoraka płuc linii A549. Stwierdzono, że cytostatyk w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym powoduje spadek aktywności badanego enzymu, przy czym dawka 40 μg/ ml medium hodowlanego wywołuje znamiennie statystycznie większy spadek aktywności LDH, aniżeli dawka 10 μg/ml medium. Natomiast pole elektromagnetyczne o zastosowanym natężeniu wpływa na wzrost aktywności LDH. Przy czym zaobserwowano, że w grupach badanych poddanych oddziaływaniu pola elektromagnetycznego i cytostatyku w zastosowanych dawkach również dochodzi do spadku aktywności LDH. Podobne wyniki uzyskano w pracy dotyczącej wpływu cisplatyny i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego na aktywność enzymów przemian biochemicznych komórek linii AT478, w tym LDH [5, 6]. Zaobserwowany efekt wywołany działaniem pola na komórki linii AT478 sugerował hamujący wpływ pola elektromagnetycznego. Jednak dla komórek linii A549, w zastosowanym natężeniu i przedziale czasowym nie miał istotnego znaczenia metabolicznego. Należy przypuszczać, że spadek aktywności LDH w komór- COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. kach linii A549, traktowanych polem elektromagnetycznym i holoksanem był związany z działaniem cytostatyku. Badania laboratoryjne dotyczące szczególnie wskaźników przeżywalności komórek nowotworowych (LDH jest enzymem należącym do tej grupy parametrów biochemicznych) są istotnym źródłem informacji o zaawansowaniu i możliwości nawrotów choroby [20]. Jednak dopiero badania prowadzone na hodowlach komórkowych in vitro umożliwiły dokładniejsze przeanalizowanie wpływu czynników fizykochemicznych na przemiany metaboliczne układów biologicznych. Wnioski W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że holoksan w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym hamuje proces glikolizy komórki nowotworowej gruczolakoraka płuc linii A549 hodowanego in vitro. Natomiast uzyskane wyniki sugerują, że zastosowane pole elektromagnetyczne nie wpływa w zasadniczy sposób na metabolizm komórki nowotworowej linii A549, aczkolwiek istotne statystycznie aktywności LDH stwierdzone pod wpływem oddziaływania pola i cytostatyku świadczą o zaburzeniu przemian metabolicznych badanej linii. Piśmiennictwo 1. Polaniak R i wsp. Wpływ holoksanu na wzrost hodowli megakolonii raka płaskonabłonkowego in vitro. Dign Lab 2001; 37: 289-293. 2. Lind M. Growth factor of bone healing. Effects on osteoblats, osteomies, and implants fixation. Acta Ortop Scand 1998; supl. 283: 2-37. 3. Kulpa J, Kołodziejski L, Wójcik E. CYFRA21-1, SCC-Ag, CEA i NSE przed operacją radykalną z powodu płaskonabłonkowego raka płuca. Diagn Lab 1999; 35(4): 593-599. 4. Polaniak R i wsp. Assestment of some metabolic enzymes activity in AT478 cell culture – in vitro study, of cisplatin and extremely low-frequency magnetic field. Diagn Lab 2006; 42: 445-454. 5. Polaniak R i wsp. Effecct of holowane on the activity of LDH of squamous cell carcinoma in vitro. Farm Przegl Nauk 2006; 1(1): 35-39. 6. Beck E i wsp. Influence of electromagnetic field on murine aquamous cell in vitro.12th Nordic Baltic Conference on Biomedical Engineering and Medical Physics (ISBEMP), IFMBE Proceedings, 2002; vol. 2: 142-143. 7. Brochez L, Naeyaert J-M. Serological markers for melanoma.Br J Dermatol 2000; 143: 256-268. 8. Bonfrer JM, Korse CM. Monitoring malignant melanoma with the S-100B tumor marker. Recent Results Cancer Res 2001; 158: 149-157. 9. Tarnawski R, Kummermehr J, Trott KR. The radiosensitivity of recurrent clones of a irradiated murine squamous cell carcinoma in the in vitro megacolony system. Radiotherapy and Oncology 1998; 46: 209-214. (2006) 10. Leporowska E i wsp. Application of biochemical tumor markers in the diagnostics and monitoring of melanoma. Wsp Onkol 2006; 10: 303-308. 11. Stella-Hołowiecka B i wsp. Wpływ wrażliwości na leczenie i resztkowej masy nowotworowej na wyniki autotransplantacji komórek krwiotwórczych w chłoniaku Hodgkina – doświadczenie jednoośrodkowe u 173 pacjentów. Wsp Onkol 2006; 10: 303-308. 12. Longo DL i wsp. Conventional-dose salvage combination chemotherapy in patients relapsing with Hodgkin’s disease after combination chemotherapy: the low probability for cure. J Clin Oncol 1992; 10: 210-218. 13. Cheng D i wsp. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in pleural fluid. Chest 1999; 116: 760–765. 14. Jankowska R, Porębska I, Dyła T. Ocena stężenia naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) w wysiękach opłucnowych pochodzenia nowotworowego i gruźliczego – wyniki wstępne. Pneumonol Alergol Pol 2002; 70: 258–264. 15. Brużewicz Sz i wsp. Zmiany aktywności dehydrogenazy mleczanowej w osoczu chorych na drobnokomórkowego raka płuc w trakcie leczenia chemicznego pierwszego rzutu. Onkol Pol 2006; 9(1): 5-8. 16. de Gramot A i wsp. Powtórne zastosowanie oksaliplatyny jest związane z poprawą przeżycia w zaawansowanym raku okrężnicy i odbytnicy. J Clin Oncol 2007; 25: 3224–3229. 17. Chua YJ, Steer C, Yip D. Recent advances in management of small cell lung cancer. Cancer Treat Rev 2004; 30: 521-543. 18. Buccheri G, Ferrigno D. Prognostic factors of small cell lung cancer. Hematol Oncol Clin North Am 2004; 18: 445-460. 19. Ando S i wsp. The prognostic value of both neuron-specyfic enolase (NSE) and Cyfra-21-1 in small cell lung cancer. Anticancer Res 2004; 24: 1941-1946. 20. Lim SC i wsp. Comparison of Tc-99m sestamibi, serum neuron-specific enolase and lactase dehydrogenase as predictors of response to chemotherapy in small cell lung cancer. Cancer Biother Radiopharm 2000; 15: 381-386. data otrzymania pracy: 07.01.2010 r. data akceptacji do druku: 22.02.2010 r. Adres do korespondencji: dr Renata Polaniak Zakład Biochemii Ogólnej SUM ul. Jardana 19; Zabrze 41-808 tel.: + 48 32 272 23 18 e-mail: [email protected]