Ocena aktywności dehydrogenazy mleczanowej komórek linii A549

Transkrypt

Ocena aktywności dehydrogenazy mleczanowej komórek linii A549
&ARM0RZEGL.AUK †
/CENAAKTYWNOuCIDEHYDROGENAZYMLECZANOWEJ
KOMÌREKLINII!PODWPŒYWEMODDZIAŒYWANIAHOLOKSANU
IWOLNOZMIENNEGOPOLAELEKTROMAGNETYCZNEGOpINVITRO
!SSESSMENTOFACTIVITYOFLACTASEDEHYDROGENASEINCELLCULTURE
EFFECTEDBY!OFHOLOXANANDLOW†FREQUENCYELECTROMAGNETICFIELD
pINVITROSTUDY
2ENATA0OLANIAK2AFAŒ*AKUB"UŒDAK)GA+WIECIEÊ%WA"IRKNER
:AKŒAD"IOCHEMII/GÌLNEJ+ATEDRY"IOCHEMIIW:ABRZUgL’SKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH
+ATEDRAI:AKŒAD&IZJOLOGIIW:ABRZUgL’SKIEGO5NIWERSYTET-EDYCZNEGOW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Choroby nowotworowe są obecnie jednym z najistotniejszych problemów współczesnej medycyny. Preparatem
stosowanym w chorobach nowotworowych jest holoksan,
lek cytostatyczny, należący do związków alkilujących,
o mechanizmie działania podobnym do cyklofosfamidu. Celem przeprowadzonego eksperymentu była ocena
oddziaływania holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego na aktywność LDH [EC 1.1.1.27]
w medium hodowlanym gruczolakoraka płuc linii A549
in vitro w różnych dawkach i określonym przedziale czasowym. LDH jest enzymem katalizującym ostatni etap
glikolizy oraz traktowany jest jako marker przeżywalności
komórek nowotworowych. Hodowlę prowadzono na linii
gruczolakoraka płuc A549, w warunkach standartowych.
Komórki potraktowano dwoma stężeniami holoksanu: 10
μg/ml medium i 40 μg/ml medium oraz poddano oddziaływaniu pola elektromagnetycznego. Grupę kontrolną stanowiły kolonie komórek nowotworowych nie zawierające
w medium hodowlanym cytostatyku. Medium zbierano
po 24 godzinach eksperymentu i oznaczano aktywności
dehydrogenazy mleczanowej w grupie kontrolnej oraz
grupach badanych.
Na podstawie wyników uzyskanych w przeprowadzonych
badaniach można stwierdzić że holoksan w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym oraz wolnozmienne
pole elektromagnetyczne wpływa na zaburzenia procesów
metabolicznych komórek gruczolakoraka płuc linii A549
hodowanych in vitro.
Investigations were carried out on the effect of different
holoxane concentrations and influence of extremely low
frequency electromagnetic field on the lactase dehydrogenase, LDH, activity of aquamous cell carcinoma line
A549 in vitro at different time intervals.
The observation of experimental and control colonies of
human line A549 was performed during 24 hours.
The strongest inhibitory effect of holoxane on the activity
of dehydrogenase lactase of cell carcinoma colonies was
obtained for the drug concentration of 40 μg/ml after 24
hours.
Our results strongly suggest that ELF-MF treatment on
A549 carcinoma cell line statistically significantly changes culture medium enzymes activities in determined conditions. The alterations in investigated enzymes activities
are also present in cytostatic (holoxan) pretreated cells. In
conclusion, there is an influence of extremely low frequency electromagnetic field on biochemical transmutations in
A549 murine squamous carcinoma cell line colonies dependent on time of exposure and dose of electromagnetic
field and time of exposure to holoxan.
Słowa kluczowe: gruczolakorak płuc, hodowla komórkowa, dehydrogenaza mleczanowa, pole elektromagnetyczne
Key words: squamous cell carcinoma, cell culture, LDH,
electromagnetic field
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Wstęp
Choroby nowotworowe są obecnie jednym z najistotniejszych problemów współczesnej medycyny. Preparatem często stosowanym w chorobach nowotworowych jest
holoksan, lek cytostatyczny, należący do grupy związków
alkilujących. Proces alkilacji polega na zastąpieniu atomu
wodoru grupą alkilową, np. metylową lub etylową. Jego
mechanizm działania jest podobny do cyklofosfamidu
i podobnie jak trofosfamid jest jego pochodną. Działanie
holoksanu jest niezależne od fazy cyklu komórkowego,
powodując powstawanie wiązań mostkowych pomiędzy
dwiema nićmi DNA [1]. Jak wszystkie cytostatyki alkilujące, hamuje wzrost komórek, ich podział, czynności i aktywność mitotyczną. W działaniu leczniczym i toksycznym,
wykazuje zdolność do zaburzeń mitozy i podziału komórek
szybko rosnących. Słabiej działa mielotoksycznie a silniej
neurotoksycznie od cyklofosfamidu [2]. Metabolizowany
jest w wątrobie do 4-hydroksyifosfamidu, który rozkłada się
do akroleiny i ifosfamidu musztard, jako formy aktywnej.
Jego metabolity są wydalane z moczem, głównie w postaci czynnej. Okres półtrwania tego preparatu wynosi około
7 godzin [1]. Stosowany jest w leczeniu paliatywnym różnych nowotworów. Podczas leczenia mogą jednak wystąpić
między innymi zaburzenia ze strony układu pokarmowego,
czynności krwiotwórczej, supresja szpiku oraz upośledzenie
pęcherza moczowego i wątroby, a także wykazuje niepożądane działanie kardio- i pneumotoksyczne. Stosowany równocześnie z napromienianiem nasila reakcję popromienną.
Prowadzenie hodowli komórkowych in vitro jest obecnie
bardzo rozpowszechnionym modelem badawczym [3, 4].
Hodowle są prowadzone na różnych liniach komórkowych:
hepatocytach, limfocytach, itp. [5-8]. Nowatorskim przedsięwzięciem naukowym opracowanym w Instytucie Badań
nad Promieniotwórczością w Monachium [9] i zmodyfikowanym w Zakładzie Biochemii Ogólnej w Zabrzu SUM jest
prowadzenie in vitro hodowli raka płaskonabłonkowego
AT478 w postaci megakolonii. Istnieją doniesienia naukowe
dotyczące zmian chorobowych związanych z występowaniem raków płaskonabłonkowych [10]. Istotny wydaje się
być wpływ leków, w tym leków o działaniu cytostatycznym,
na wzrost i przemiany metaboliczne badanych linii komórkowych in vitro, w tym właśnie holoksanu. Nie znaleziono
jednak w przeglądanym piśmiennictwie danych dotyczących
wpływu holoksanu lub innych preparatów cytostatycznych
na hodowle megakolonii raka płaskonabłonkowego A549
in vitro.
Celem przeprowadzonych badań była ocena wpływu
holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego
na aktywność dehydrogenazy mleczanowej, enzymu katalizującego ostatni etap glikolizy, w medium hodowlanym
gruczolakoraka płuc linii A549 in vitro w różnych dawkach
i określonym przedziale czasowym.
Materiał i metody
Hodowlę komórkową prowadzono na linii gruczolakoraka płuc A549. Jako podłoża hodowlanego użyto Dulbeco’s z L-glutaminą wzbogaconego płodową surowicą wołową. Hodowlę prowadzono w standartowych warunkach
temperatury i atmosfery wzbogaconej w dwutlenek węgla.
Do hodowli użyto butelek hodowlanych firmy Sarstedt [1].
Kolonie traktowano dwoma stężeniami holoksanu w ilości:
10 μg/ml i 40 μg/ml podłoża. Hodowlę kolonii prowadzono
wg standartowej procedury:
1. butelkę zawierającą odpowiednią ilość komórek
trypsynizowano mieszaniną trypsyny i EDTA przez
kilka minut;
2. następnie usuwano mieszaninę trypsynizującą i przepłukiwano komórki medium hodowlanym;
3. po przepłukaniu, mechanicznie uwalniano komórki
do medium wzbogaconego płodową surowicą wołową (FSC) o określonym stężeniu;
4. w butelkach hodowlanych w zaznaczonych miejscach nakrapiano zawiesinę komórek i inkubowano
w określonych parametrach eksperymentu [5].
Kolonie podzielono na 5 grup badanych:
1. B1 – komórki 30 min poddano ekspozycji na działanie pola/ 24 godz.;
2. B2 – komórki podawano działaniu 10 μg/ml medium
holoksanu/24 godz.;
3. B3 – komórki podawano działaniu 40 μg/ml medium holoksanu/24 godz.;
4. B4 – komórki podawano 30 min ekspozycji na pole
elektromagnetyczne i działaniu 10 μg/ml medium
holoksanu;
5. B5 – komórki podawano 30 min ekspozycji na pole
elektromagnetyczne i działaniu 40 μg/ml medium
holoksanu.
Grupę kontrolną (K) stanowiły kolonie, hodowane
w medium z surowicą bez dodatku holoksanu i nie narażone na działanie pola elektromagnetycznego. W badaniach
zastosowano pole elektromagnetyczne o maksymalnej wartości MRS wynoszącej 0,14 mT (o częstotliwości od 3 Hz
do 3 kHz), wytwarzane przez urządzenie MRS 2000 firmy
MediConsult [6].
Po 24 godzinach od podania preparatu zbierano medium
i oznaczano aktywność dehydrogenazy mleczanowej, LDH,
metodą kinetyczną. Aktywność enzymu określano w próbach
badanych w stosunku do próby kontrolnej (nie zawierającej
w medium holoksanu) w IU/ml medium hodowlanego.
Wyniki
Wyniki badań zmian aktywności LDH w testowanych
komórkach pod wpływem holoksanu i pola elektromagnetycznego zamieszczono w Tab. I i na Ryc. 1.
Pod wpływem oddziaływania holoksanu w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym oraz pola elektromagnetycznego stwierdzono istotny statystycznie spadek
aktywności LDH w grupach eksponowanych na sam cytostatyk, w porównaniu do grupy poddanej działaniu pola
elektromagnetycznego i kontroli. Przy czym zaobserwowano, że pod wpływem pola aktywność LDH wzrosła, nie
tylko w porównaniu do grup eksponowanych na cytostatyk (B2 i B3), ale także w stosunku do kontroli. Natomiast
w grupie badanej poddanej działaniu większej dawki cytostatyku (B3) aktywność LDH spadła w porównaniu do wszyst-
&ARM0RZEGL.AUK
Tab. 1. Porównanie aktywności LDH w grupach badanych vs. kontroli testem t-Studenta (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001)
K
średnia
101,67
±SD
±12,98
B1
111,35
*
B2
61,32
**
B3
37,47
**
B4
62,55
**
±6,28
±4,85
±2,88
±1,81
140
Aktywność LDH [IU/ml]
120
K
B1
100
K
B1
80
B2
B2
B4
B3
60
B4
40
B3
B5
B5
20
0
grupy badawcze
Ryc. 1. Aktywność LDH w grupach badanych i grupie kontrolnej.
kich pozostałych grup badanych i grupy kontrolnej (Ryc.1,
Tab. I).
Porównano aktywności LDH w grupach badanych poddanych oddziaływaniu holoksanu i pola elektromagnetycznego (grupy B4 i B5) w stosunku do grupy badanej eksponowanej tylko na działanie pola elektromagnetycznego
oraz grupy kontrolnej. Także tutaj stwierdzono znamienny
wzrost aktywności LDH w grupie narażonej na działanie
pola elektromagnetycznego w stosunku do grupy kontrolnej
i pozostałych grup badanych (Tab. I).
W grupie badanej B5 (komórki poddane oddziaływaniu większej dawki cytostatyku i pola magnetycznego)
nastąpił spadek aktywności dehydrogenazy mleczanowej
w stosunku do kontroli i pozostałych grup badanych.
Porównując aktywności LDH w grupach badanych poddanych oddziaływaniu holoksanu w zastosowanych dawkach (grupy badane B2 i B3) i grupach poddanych ekspozycji na cytostatyk i pole magnetyczne (B4 i B5), stwierdzono
spadek aktywności enzymu w grupach badanych z zastosowaną większa dawką holoksanu (40 μg/ml medium holoksanu). Zarówno w grupie eksponowanej na sam cytostatyk,
jaki w grupie badanej cytostatyku i pola magnetycznego
(Ryc.1, Tab. I).
Dyskusja
Proces glikolizy, proces przemian węglowodanów, stanowi podstawę metabolizmu komórki nowotworowej. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) jest enzymem katalizującym ostatni etap glikolizy, czyli jej aktywność wskazuje na
zaawansowanie uszkodzenia komórki nowotworowej. LDH
jest wskaźnikiem przeżywalności komórek nowotworowych, chorób kardiologicznych i chorób wątroby [6].
W piśmiennictwie znaleziono prace dotyczące aktywności całkowitego LDH w nowotworach badanych in vivo [11].
Dehydrogenazę mleczanową oznaczano w czerniaku [20],
gdzie obok białka S100, któro jest jednym z istotniejszych
B5
37,20
**
±4,08
markerów tego nowotworu [14], LDH należało do standardowych wskaźników [8]. Podobnie, w pracy dotyczącej
autotransplantacji komórek krwiotwórczych w chłoniaku
Hodgkina [12]. Na podstawie uzyskanych wyników badań,
stosując kombinację chemioterapii i chemioradioterapii
w chłoniaku Hodgkina uzyskano wyleczenie chorych w 80%.
Liczba chorych opornych na chemioterapię lub z nawrotem
choroby po pierwotnie pozytywnej reakcji na zastosowane
leczenie wynosiła jedynie 20% [13-17]. W pracy tej, autorzy
traktują aktywność LDH, jako jeden z głównych czynników
prognostycznych. Aktywność LDH traktowano jako ważny parametr w ocenie przydatności naczynio-ośrodkowego
czynnika wzrostu (VEGF) w diagnostyce płynu opłucnowego. W wyniku badań stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy VEGF a LDH w płynie opłucnowym. [13, 14].
Do nowotworów w przebiegu których, istotne znaczenie
ma aktywność LDH należy drobnokomórkowy rak płuca
[15]. Schorzenie to jest jednym z najbardziej złośliwych nowotworów, szybko uodparniający się na stosowane leczenie.
LDH jest ogromnie ważnym czynnikiem prognostycznym
w leczeniu tego nowotworu, natomiast podzielone są opinie autorów mówiące o wykorzystaniu oznaczenia aktywności LDH jako czynnika predykcyjnego w stosunku do
zastosowanego leczenia [18, 19]. Badania wykazały istotny
statystycznie związek pomiędzy aktywnością LDH a odpowiedzią na pierwotne leczenie chemiczne. Autorzy sugerują
związek pomiędzy aktywnością badanego enzymu a długością przeżyć pacjentów chorych na drobnokomórkowego
raka płuca [4].
W badaniach przedstawionych w niniejszej pracy oceniano aktywność całkowitej dehydrogenazy mleczanowej
pod wpływem oddziaływania holoksanu i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego w mediach komórkowych
gruczolakoraka płuc linii A549. Stwierdzono, że cytostatyk
w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym powoduje spadek aktywności badanego enzymu, przy czym dawka
40 μg/ ml medium hodowlanego wywołuje znamiennie statystycznie większy spadek aktywności LDH, aniżeli dawka 10 μg/ml medium. Natomiast pole elektromagnetyczne
o zastosowanym natężeniu wpływa na wzrost aktywności
LDH. Przy czym zaobserwowano, że w grupach badanych
poddanych oddziaływaniu pola elektromagnetycznego i cytostatyku w zastosowanych dawkach również dochodzi do
spadku aktywności LDH.
Podobne wyniki uzyskano w pracy dotyczącej wpływu
cisplatyny i wolnozmiennego pola elektromagnetycznego
na aktywność enzymów przemian biochemicznych komórek
linii AT478, w tym LDH [5, 6]. Zaobserwowany efekt wywołany działaniem pola na komórki linii AT478 sugerował
hamujący wpływ pola elektromagnetycznego. Jednak dla
komórek linii A549, w zastosowanym natężeniu i przedziale czasowym nie miał istotnego znaczenia metabolicznego.
Należy przypuszczać, że spadek aktywności LDH w komór-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
kach linii A549, traktowanych polem elektromagnetycznym
i holoksanem był związany z działaniem cytostatyku.
Badania laboratoryjne dotyczące szczególnie wskaźników przeżywalności komórek nowotworowych (LDH jest
enzymem należącym do tej grupy parametrów biochemicznych) są istotnym źródłem informacji o zaawansowaniu
i możliwości nawrotów choroby [20]. Jednak dopiero badania prowadzone na hodowlach komórkowych in vitro umożliwiły dokładniejsze przeanalizowanie wpływu czynników
fizykochemicznych na przemiany metaboliczne układów
biologicznych.
Wnioski
W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że holoksan w zastosowanych dawkach i przedziale czasowym
hamuje proces glikolizy komórki nowotworowej gruczolakoraka płuc linii A549 hodowanego in vitro. Natomiast
uzyskane wyniki sugerują, że zastosowane pole elektromagnetyczne nie wpływa w zasadniczy sposób na metabolizm
komórki nowotworowej linii A549, aczkolwiek istotne statystycznie aktywności LDH stwierdzone pod wpływem oddziaływania pola i cytostatyku świadczą o zaburzeniu przemian metabolicznych badanej linii.
Piśmiennictwo
1. Polaniak R i wsp. Wpływ holoksanu na wzrost hodowli megakolonii raka płaskonabłonkowego in vitro. Dign
Lab 2001; 37: 289-293.
2. Lind M. Growth factor of bone healing. Effects on osteoblats, osteomies, and implants fixation. Acta Ortop
Scand 1998; supl. 283: 2-37.
3. Kulpa J, Kołodziejski L, Wójcik E. CYFRA21-1, SCC-Ag,
CEA i NSE przed operacją radykalną z powodu płaskonabłonkowego raka płuca. Diagn Lab 1999; 35(4): 593-599.
4. Polaniak R i wsp. Assestment of some metabolic enzymes activity in AT478 cell culture – in vitro study, of
cisplatin and extremely low-frequency magnetic field.
Diagn Lab 2006; 42: 445-454.
5. Polaniak R i wsp. Effecct of holowane on the activity of
LDH of squamous cell carcinoma in vitro. Farm Przegl
Nauk 2006; 1(1): 35-39.
6. Beck E i wsp. Influence of electromagnetic field on murine aquamous cell in vitro.12th Nordic Baltic Conference on Biomedical Engineering and Medical Physics (ISBEMP), IFMBE Proceedings, 2002; vol. 2: 142-143.
7. Brochez L, Naeyaert J-M. Serological markers for melanoma.Br J Dermatol 2000; 143: 256-268.
8. Bonfrer JM, Korse CM. Monitoring malignant melanoma with the S-100B tumor marker. Recent Results Cancer Res 2001; 158: 149-157.
9. Tarnawski R, Kummermehr J, Trott KR. The radiosensitivity of recurrent clones of a irradiated murine squamous cell carcinoma in the in vitro megacolony system.
Radiotherapy and Oncology 1998; 46: 209-214. (2006)
10. Leporowska E i wsp. Application of biochemical tumor
markers in the diagnostics and monitoring of melanoma.
Wsp Onkol 2006; 10: 303-308.
11. Stella-Hołowiecka B i wsp. Wpływ wrażliwości na leczenie i resztkowej masy nowotworowej na wyniki autotransplantacji komórek krwiotwórczych w chłoniaku
Hodgkina – doświadczenie jednoośrodkowe u 173 pacjentów. Wsp Onkol 2006; 10: 303-308.
12. Longo DL i wsp. Conventional-dose salvage combination chemotherapy in patients relapsing with
Hodgkin’s disease after combination chemotherapy:
the low probability for cure. J Clin Oncol 1992; 10:
210-218.
13. Cheng D i wsp. Vascular endothelial growth factor
(VEGF) in pleural fluid. Chest 1999; 116: 760–765.
14. Jankowska R, Porębska I, Dyła T. Ocena stężenia naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) w
wysiękach opłucnowych pochodzenia nowotworowego
i gruźliczego – wyniki wstępne. Pneumonol Alergol Pol
2002; 70: 258–264.
15. Brużewicz Sz i wsp. Zmiany aktywności dehydrogenazy
mleczanowej w osoczu chorych na drobnokomórkowego raka płuc w trakcie leczenia chemicznego pierwszego
rzutu. Onkol Pol 2006; 9(1): 5-8.
16. de Gramot A i wsp. Powtórne zastosowanie oksaliplatyny jest związane z poprawą przeżycia w zaawansowanym raku okrężnicy i odbytnicy. J Clin Oncol 2007; 25:
3224–3229.
17. Chua YJ, Steer C, Yip D. Recent advances in management of small cell lung cancer. Cancer Treat Rev 2004;
30: 521-543.
18. Buccheri G, Ferrigno D. Prognostic factors of small cell
lung cancer. Hematol Oncol Clin North Am 2004; 18:
445-460.
19. Ando S i wsp. The prognostic value of both neuron-specyfic enolase (NSE) and Cyfra-21-1 in small cell lung
cancer. Anticancer Res 2004; 24: 1941-1946.
20. Lim SC i wsp. Comparison of Tc-99m sestamibi, serum neuron-specific enolase and lactase dehydrogenase as predictors of response to chemotherapy in small
cell lung cancer. Cancer Biother Radiopharm 2000; 15:
381-386.
data otrzymania pracy: 07.01.2010 r.
data akceptacji do druku: 22.02.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr Renata Polaniak
Zakład Biochemii Ogólnej SUM
ul. Jardana 19; Zabrze 41-808
tel.: + 48 32 272 23 18
e-mail: [email protected]

Podobne dokumenty