pobierz

Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 4, str. 425–435
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
ANNA CIEPŁUCHA, KRZYSZTOF JAMROZIAK, TADEUSZ ROBAK
Perspektywy zastosowania mikroRNA w leczeniu nowotworów
Perspective on the role of microRNA in the therapy of cancer
Z Kliniki Hematologii Uniwersytet Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak
STRESZCZENIE
Odkrycie mikroRNA i jego funkcji biologicznych jest waŜnym krokiem na drodze do poznania
molekularnych aspektów fizjologii oraz patogenezy chorób człowieka. MikroRNA są klasą krótkich, jednoniciowych cząsteczek niekodującego RNA, zaangaŜowanych w regulację podstawowych procesów biologicznych, w tym proliferacji, róŜnicowania i apoptozy komórek, w mechanizmie obniŜania ekspresji genów na etapie translacji. Prowadzone w ostatnich latach badania
dostarczyły wielu przykładów związku zaburzeń ekspresji mikroRNA z występowaniem róŜnych
chorób, stając się podstawą do poszukiwania nowych strategii terapeutycznych. Głównym celem
obecnej pracy jest charakterystyka wstępnych wyników badań dotyczących moŜliwości zastosowania mikroRNA w leczeniu chorób nowotworowych.
SŁOWA KLUCZOWE: mikrona – Onkomiry – Antagomiry – Choroby nowotworowe
SUMMARY
Discovery of microRNA and its biological functions is a significant step towards the understanding of molecular bases of human physiology and pathology. MicroRNAs constitute a class of
short, non-coding RNA molecules involved in the regulation of a number of important biological
processes including cell proliferation, differentiation and apoptosis by down-regulation of gene
expression during translation phase. Recent research supports a role of microRNAs in the pathogenesis of various diseases that gives theoretical base for development of novel therapeutical
strategies. The aim of this paper is to review current results of studies addressing the use of
microRNAs as drugs or drug targets in human malignancies.
KEY WORDS: microRNA – Oncomirs – Antagomirs – Cancer
WSTĘP
Rozwój nowoczesnych metod leczenia przeciwnowotworowego jest moŜliwy dzięki
postępowi w badaniach molekularnych uwarunkowań onkogenezy. Dotychczas, skłonność do nowotworzenia była tłumaczona zaburzeniami trzech grup genów, czyli onkogenów, genów supresorowych oraz genów mutatorowych, spośród których wszystkie są
genami kodującymi białka. W ostatnich latach dokonuje się przełom w dziedzinie genetyki polegający na coraz lepszym rozumieniu biologicznej roli niekodującego RNA,
426 A. CIEPŁUCHA i wsp.
a szczególnie na odkryciu mikroRNA. MikroRNA są klasą krótkich, 20–22 nukleotydowych, jednoniciowych, niekodujących cząsteczek RNA, których rolą jest obniŜanie ekspresji genów na etapie translacji informacji genetycznej (1). Na podstawie
dotychczasowych badań, szacuje się, iŜ u człowieka występuje około 1000 genów
mikroRNA, które regulują około 30% wszystkich genów kodujących białka (2). Większość genów mikroRNA (70%) jest zlokalizowana w intronach i/lub w egzonach innych genów, natomiast 30% między genami kodującymi białka oraz niekodującym
RNA (3). Z uwagi na fizjologiczną funkcję związaną z regulacją procesów proliferacji,
róŜnicowania i apoptozy komórek, zaburzenia ekspresji lub struktury genów mikroRNA mogą odgrywać istotną rolę w etiopatogenezie nowotworów.
Biogeneza i mechanizm regulacji ekspresji przez mikroRNA
Proces biogenezy mikroRNA jest złoŜony. Wykazano, iŜ orientacja genów mikroRNA warunkuje określony profil ekspresji tych genów. Pierwsza grupa genów
zlokalizowana w intronach i/lub egzonach zorientowana w kierunku 5’→3’ ulega
transkrypcji zaleŜnie od ekspresji genu, którego jest częścią. Druga grupa genów mikroRNA zlokalizowanych między genami kodującymi białka lub niekodujący RNA
jest transkrybowana jako niezaleŜna jednostka transkrypcyjna (4). Ponadto grupa genów mikroRNA pochodząca z intronów i/lub egzonów moŜe być transkrybowana
w antysensownej orientacji. Za transkrypcję genów mikroRNA odpowiedzialne są
polimeraza: RNA II lub III, w tym polimeraza RNA II odgrywa główną rolę. W wyniku ich działania powstają pierwotne prekursory (pri-mikroRNA) zawierające około 70
nukleotydów, które tworzą fragmenty o strukturze nieregularnej spinki (ang. hairpin).
Dojrzewanie pri-mikroRNA zachodzi w dwóch etapach, katalizowanych przez rybonukleazy Drosha i Dicer, naleŜących do RNaz typu III (5). Etap przycinania primikroRNA do pre-mikroRNA odbywa się w jądrze komórkowym i przeprowadzany
jest przez kompleks Mikroprocesora. W jego skład wchodzi rybonukleaza Drosha oraz
białko wiąŜące podwójną nić RNA, DGCR8 (double stranded RNA binding protein)
(6). Pre-mikroRNA jest następnie transportowany do cytoplazmy, w której zachodzi
kolejny etap biogenezy. Za transport przez pory jądra komórkowego odpowiedzialne
jest białko eksportyna-5, które wiąŜe pre-mikroRNA współdziałając z białkiem Ran
zaleŜnym od GTP. W cytoplazmatycznym etapie biogenezy mikroRNA, bierze udział
endonukleaza Dicer. W wyniku jej działania powstaje dupleks mikroRNA składający
się z 20–22 nukleotydów z dwunukleotydowym 3’ końcem (7)
Następnie jedna z nici RNA dupleksu ulega inkorporacji do kompleksu rybonukloproteinowego o nazwie miRISC (RNA induced silencing complex), stanowiący mechanizm regulacji ekspresji genów. W zaleŜności od stopnia komplementarności mikroRNA do miejsca jego wiązania w mRNA oraz rodzaju białka Argonaute wchodzącego w skład kompleksu, moŜe on doprowadzić do nukleolitycznego przecięcia określonego mRNA lub represji jego translacji, w obu sytuacjach powodując obniŜenie
ekspresji docelowego genu (8). Miejsca wiązania mikroRNA występują głównie w regionach 3’UTR, a takŜe w 5’UTR i/lub w regionach kodujących w mRNA (5).
Perspektywy zastosowania mikroRNA
427
Fizjologiczne funkcje mikroRNA
MikroRNA bierze udział w regulacji wielu istotnych procesów biologicznych.
Wyniki licznych badań wskazują, iŜ róŜne cząsteczki mikroRNA odgrywają rolę w
kontroli proliferacji komórki, róŜnicowania, apoptozy, w metabolizmie tłuszczów,
sekrecji insuliny oraz procesach hematopoezy. Najlepiej poznanym przykładem czynności mikroRNA jest mikroRNA lin-4, który ulega ekspresji w pierwszym stadium
larwalnym L1 nicienia Caenorhabditis elegans (9). Cząsteczka ta odpowiedzialna jest
za inhibicję ekspresji genów lin-14 oraz lin-28, regulatorów wczesnych stadiów rozwojowych. Mutacja lin-4 powoduje powtórzenie podziałów charakterystycznych dla
pierwszego stadium larwalnego zamiast róŜnicowania komórek. Przykłady cząsteczek
mikroRNA i ich związek z regulacją wybranych procesów biologicznych zostały
przedstawiony w tabeli 1.
Tabela 1. Udział mikroRNA w określonych procesach fizjologicznych
Table 1. The role of microRNA in various physiological processes
mikroRNA
mikroRNA-1
Funkcja
Gen stanowiący cel
działania mikroRNA
HAND2
Cytowanie
RóŜnicowanie i proliferacja kardiomocy(10)
Tów i komórek mięśni szkieletowych
mikroRNA-15a
Regulacja apoptozy
BCL-2
(11)
mikroRNA-27
Regulacja metabolizmu ksenobiotyków
CYP1B1
(12)
mikroRNA-132
Regulacja morfogenezy układu nerwoP250GAP
(13)
wego
mikroRNA-130a
Regulacja megakariopcytopoezy
MAFB
(14)
mikroRNA-221
Regulacja erytropoezy
c-KIT
(15)
mikroRNA-375
Regulacja sekrecji insuliny
MTPN
(16)
mikroRNA-143
RóŜnicowanie adypocytów
ERK5
(17)
HAND2 – hand transcription factor; BCL2 – B-cell lymphoma 2, CYP1B1, cytochrome P450 1B1, MAFB
– v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue B, c-KIT – stem cell factor receptor,
MTPN – myotrophin, ERK5 – extracellular signal regulated kinase 5
Rola mikroRNA w etipatogenezie nowotworów hematologicznych
Ze względu na udział mikroRNA w regulacji podstawowych procesów proliferacji,
róŜnicowania i apoptozy komórek organizmu zaburzenia aktywności określonych cząsteczek mikroRNA mogą mieć istotne znaczenie w procesie inicjacji i progresji chorób
nowotworowych. Zwiększone ryzyko nowotworzenia moŜe być wynikiem zarówno
uaktywnienia genów onkogennych, jak i „wyciszania” genów supresorowych, w zaleŜności od celów regulacji określonych mikroRNA. MikroRNA, których geny ulegają
delecji lub wyciszaniu mogą powodować efekt onkogenny, jeśli obiektem ich regulacji
są protoonkogeny. Z drugiej strony, do nowotworzenia moŜe równieŜ prowadzić amplifikacja lub wzrost ekspresji genu mikroRNA regulującego ekspresję genu supresorowego (18). MikroRNA, które funkcjonują jako onkogeny lub geny supresorowe zostały nazwane onkomirami (19).
428 A. CIEPŁUCHA i wsp.
Pierwsze doniesienie sugerujące związek mikroRNA z nowotworami dotyczyło
przewlekłej białaczki limfatycznej (PBL). Stwierdzono, Ŝe wspólne miejsce występujących w około 70% przypadków PBL delecji fragmentu 13q14 obejmuje loci genów
mikroRNA-15a oraz mikroRNA-16-1 (20). Następnie udowodniono korelację między
obniŜoną ekspresją genów mikroRNA-15a oraz mikroRNA-16-1, a podwyŜszoną ekspresją genu bcl-2, typową dla PBL (21). W patogenezie PBL odgrywa równieŜ prawdopodobnie rolę niska ekspresja mikroRNA-29 oraz mikroRNA-181, które zawierają
homologiczne sekwencje do 3’UTR mRNA dla onkogenu TCLI. Wykazano, iŜ białko
TCLI jest aktywatorem szlaku kinezy 3-fosfatydyloinozytolu, która powoduje aktywacje kinazy białkowej B określanej akronimem Akt. Kinaza Akt jest odpowiedzialna za
regulację czasu przeŜycia oraz procesu proliferacji komórek, w tym limfocytów B oraz
limfocytów T (22). Ponadto kompleks Akt-TCLI wpływa na większą aktywność kinazy Akt, co sugeruje, Ŝe TCLI jest kooaktywatorem kinazy Akt (23). Po aktywacji kinaza Akt dokonuje fosforylacji czynników zaangaŜowanych w procesy odpowiedzialne
za przetrwanie komórki lub jej śmierć. Przykładem moŜe być czynnik proapoptyczny
Bad (24) lub CREB (cAMP-response element binding protein) (25). W większości
przypadków fosforylacja przeprowadzana przez kinazę Akt zwiększa czas przeŜycia
komórki. Wykazano, Ŝe nadekspresja onkogenu TCLI jest skorelowana nie tylko z
agresywną postacią PBL, ale równieŜ z występowaniem delecji 11q (49). NaleŜy jednak zaznaczyć, Ŝe pomimo istotnej odwrotnej korelacji między ekspresją mikroRNA29 i mikroRNA-181 a aktywnością TCLI istnieją przypadki PBL, które charakteryzują
się niską ekspresją cząsteczek mikroRNA-29, mikroRNA-181 oraz TCLI, które sugerują, iŜ obniŜona ekspresja TCLI moŜe być równieŜ spowodowana innymi mechanizmami.
Chłoniak Burkitta, chłoniak Hodgina oraz rozlane chłoniaki z duŜych limfocytów
B są kolejnymi nowotworami, u których udowodniono związek ich występowania z
zmienionym profilem ekspresji mikroRNA. W wyŜej wymienionych chłoniakach
stwierdzono wzrost ekspresji mikroRNA-155 (26, 27, 28). Właściwości onkogenenne
mikroRNA-155 zostały potwierdzone w transgenicznym modelu mysim, w którym
wywołanie nadekspresji mikroRNA-155 powodowało niekontrolowaną proliferację
limfocytów B (29). UwaŜa się, iŜ aktywność onkogenna mikroRNA-155 związana jest
z wpływem regulacyjnym na gen kodujący białko BIC, którego ekspresja jest wysoka
w tych chłoniakach, a niska w prawidłowych limfocytach. Przypuszczenia te są poparte istnieniem konserwatywnych sekwencji w budowie genów dla mikroRNA-155 oraz
BIC (30). Jednak podstawy molekularne zaleŜności między mikroRNA-155, a białkiem BIC są nieznane.
Innym przykładem wskazującym na znaczenie mikroRNA w etiopatogenezie nowotworów jest zlokalizowany na chromosomie 13q31 policistron mikroRNA-17-92
zawierający geny dla siedmiu mikroRNA: mikroRNA-17-5p, mikroRNA-17-3p, mikroRNA-18, mikroRNA-19a, mikroRNA-20, mikroRNA-19b, mikroRNA-92-1. Amplifikacja tego regionu została potwierdzona w rozlanym chłoniaku z duŜych limfocytów B, chłoniaku grudkowym, chłoniaku z komórek płaszcza oraz w pierwotnym chłoniaku skóry B-komórkowym (31). Onkogenną rolę policistronu mikroRNA-17-92 po-
Perspektywy zastosowania mikroRNA
429
twierdzono w doświadczeniu, w którym z komórek macierzystych wywodzących się
z płodu myszy transfekowanych wektorem zawierającym klaster mikroRNA-19b rozwinął się chłoniak B-komórkowy (32). PodwyŜszona ekspresja zespołu genów mikroRNA-17-92 indukowana jest przez nadekspresję czynnika transkrypcyjnego Myc
(33). Cząsteczka Myc powoduje równieŜ wzrost ekspresji czynnika transkrypcyjnego
E2F1 odpowiedzialnego za regulację przejścia fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego
(34). W modelu chłoniaka u myszy wykazano, iŜ podwyŜszona ekspresja policystronu
mikroRNA-17-92 indukowana przez nadekspresję c-myc powoduje wzrost częstości
podziałów mitotycznych i inhibicję apoptozy. Efekt ten wymaga kooperatywnego działania składowych policistronu mikroRNA-17-92 (35). Równie waŜny jest fakt, iŜ dwie
składowe policystronu: mikroRNA-17-5 i mikroRNA-20a w obecności cząsteczki Myc
obniŜają ekspresję czynnika transkrypcyjnego E2F1, tym samym umoŜliwiając precyzyjną regulację proliferacji komórek (69).
Profil ekspresji mikroRNA w guzach litych
Przykładem funkcjonowania cząsteczek mikroRNA jako supresorów nowotworzenia jest rodzina mikroRNA let-7. U człowieka celem ich regulacji są mRNA dla białek
Ras, które biorą udział w przekazywaniu sygnałów komórkowych. W 3’UTR mRNA
trzech ludzkich onkogenów Ras (K-Ras, H-Ras oraz N-Ras) występują sekwencje
komplementarne do mikroRNA let-7. Wykazano, iŜ obniŜona ekspresja let-7 ma związek z występowaniem raka płuc (36). Udowodniono równieŜ, Ŝe wzrost ekspresji mikroRNA-372 oraz mikroRNA-373 odgrywa rolę w patogenezie raka jądra (37). Ponadto, opisano współistnienie zwiększonej ekspresji mikroRNA-21 z rozwojem raka piersi
(38), glejaka wielopostaciowego (39) oraz raka trzustki (40). Przykłady zmienionego
profilu ekspresji mikroRNA w innych nowotworach litych zostały przedstawione w tabeli 2.
Tabela 2. Zmiany profilu ekspresji mikroRNA w niektórych chorobach nowotworowych
Table 2. Altered microRNAs expression profil in selected solid tumours
Rodzaj nowotworu
Rak jelita grubego
Rak brodawkowy tarczycy
Rak wątrobowokomórkowy
MikroRNA
mikroRNA-143
mikroRNA-145
mikroRNA-221
mikroRNA-222
mikroRNA-146
mikroRNA-181
Zmiana ekspresji
↓
↓
↑
↑
↑
↑
Cytowanie
(41)
mikroRNA-18
mikroRNA-224
mikroRNA-199a
mikroRNA-195
mikroRNA-199a
mikroRNA-200a
mikroRNA-125a
↑
↑
↓
↓
↓
↓
↓
(43)
(42)
430 A. CIEPŁUCHA i wsp.
Rak prostaty
Neuroblastoma
mikroRNA-128a
mikroRNA-195
mikroRNA-203
let-7d
mikroRNA-34a
mikroRNA-184
↓
↑
↑
↑
↓
↓
(44)
(45)
MoŜliwości terapeutyczne związane z mikroRNA
Postęp wiedzy na temat udziału mikroRNA w procesach chorobowych jest punktem wyjścia badań nad strategiami terapeutycznego wykorzystania mikroRNA, zarówno jako leków, jak i celów dla terapii. ChociaŜ większość badań jest obecnie w początkowej fazie, niektóre wstępne wyniki wydają się bardzo obiecujące. Głównym załoŜeniem zastosowania mikroRNA w leczeniu jest uzyskanie wpływu na kontrolę ekspresji
białek. Istnieje wiele doniesień wskazujących na moŜliwość pośredniej modyfikacji
ekspresji białek zaangaŜowanych w patogenezę róŜnych chorób, w tym nowotworów
za pomocą mikroRNA. Wykazano na przykład, Ŝe wprowadzenie do mikroRNA-125b
mutacji typu knockdown powoduje ograniczenie proliferacji linii komórkowych raka
prostaty PC-3 oraz komórek raka szyjki macicy HeLa (46).
Jedną z potencjalnych strategii terapeutycznego wykorzystania mikroRNA jest
synteza sztucznych (ang. artificial) mikroRNA komplementarnych do mRNA określonego genu. W tym układzie zadaniem syntetycznego mikroRNA byłoby wyciszenie
ekspresji genu istotnego dla rozwoju lub progresji określonej choroby. Istnieją dość
liczne doniesienia sugerujące potencjalną skuteczność takiej strategii. Wykazano, iŜ
transfekcja plazmidu pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-based zawierającego sztucznie
zaprojektowany pre-mikroRNA przeciwko receptorowi chemokinowemu CXCR4 do
hodowli komórek raka piersi MDA-MB-231 powoduje obniŜenie ekspresji CXCR4 o
blisko 100% oraz w efekcie, zahamowanie migracji komórek nowotworowych. Potwierdzeniem powyŜszych obserwacji są wyniki badań in vivo przeprowadzonych na
modelu mysim. U zwierząt, którym podano komórki nowotworowe linii raka piersi
MDA-MB-231 transfekowane mikroRNA-CXCR4 obserwowano mniejszą liczbę przerzutów w płucach w porównaniu z myszami, którym podano komórki MDA-MB-231
transfekowane plazmidem kontrolnym. Autorzy wykazali takŜe, iŜ wyciszenie ekspresji CXCR4 przez syntetyczny mikroRNA-CXCR4 powoduje zablokowanie fosforylacji
enzymu Akt a tym samym ma wpływ na inwazyjność i zdolność do przerzutowania
komórek nowotworowych raka piersi (47).
W innym badaniu przeprowadzono podobne doświadczenia na linii komórkowej raka Ŝołądka SGC7901. Dowiedziono, iŜ na skutek transfekcji plazmidu zawierającego
sztucznie zsyntetyzowany mikroRNA przeciwko mRNA dla fosfatazy tyrozynowej
PRL-3, która odpowiada za przerzutowanie raka Ŝołądka do węzłów chłonnych, doszło
do zahamowania migracji i inwazyjności badanych komórek. Dane zostały potwierdzone
takŜe in vivo na modelu mysim (48). Sztuczny, syntetyczny mikroRNA został równieŜ
wykorzystany w badaniu nad związkiem receptora chemokinowego CC1 a migracją i
zdolnością do dawania przerzutów przez raka wątrobowokomórkowego. Receptor CC1
Perspektywy zastosowania mikroRNA
431
ulega nadekspresji w raku wątrobowokomórkowym. Wykazano, iŜ transfekcja plazmidu
pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-based zawierającego mikroRNA komplementarny do
mRNA CC1, do hodowli linii raka wątrobowokomórkowego HCCLM3, doprowadziła
do obniŜenia eskpersji CC1, a tym samym do obniŜenia inwazyjności tych komórek oraz
spadku poziomu metaloproteinazy MMP-2 (49). Metaloproteinazy są klasą enzymów
proteolitycznych o aktywności endopeptydaz zaleŜnych od jonów Zn2+ i Ca2+ trawiących
składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, a ich podwyŜszony poziom u chorych jest na
ogół niekorzystnym czynnikiem prognostycznym.
Inną strategią terapeutyczną związaną z mikroRNA są próby stosowania tzw. antagomirów. Termin antagomir (inaczej oligonukleotyd anty-mikroRNA, AMO), oznacza
syntetyczny oligonukleotyd komplementarny do określonego mikroRNA. Idea leczenia
antagomirami polega na modyfikacji aktywności określonych białek, pośrednio, poprzez wyciszenie genów mikroRNA regulujących ich ekspresję. Spektakularnym przykładem skuteczności takiej terapii są badania in vivo nad wpływem antagomiru antymikroRNA-122 na poziom cholesterolu u myszy (50). W tym doświadczeniu spadek
poziomu mikroRNA-122 wystąpił trzy dni po iniekcji anty-mikroRNA-122. Obserwowano równieŜ obniŜenie ekspresji genów regulowanych przez mikroRNA-122, w tym
genów kodujących enzymy szlaku biosyntezy cholesterolu, oraz obniŜenia osoczowego
stęŜenia cholesterolu o 40%, które utrzymywało się przez dwa tygodnie od podania
leku. W doświadczeniu tym cząsteczka antagomiru została w odpowiedni sposób zmodyfikowana w celu uzyskania stabilności i oporności na działanie endonukleaz komórkowych. W pozycji 2’ rybozy kaŜdego nukleotydu nici antysensowej wprowadzono
grupę O-metylową. Terminalne nukleotydy na końcach obu nici ponadto zmodyfikowano wprowadzając wiązanie tiofosforanowe w miejce wiązania fosfodiestrowego.
W celu zapewnienia odpowiednich właściwości farmakokinetycznych obejmujących
zwiększenie powinowactwa do białek nośnikowych surowicy, wydłuŜenie okresu półtrwania oraz zwiększenie wychwytu przez hepatocyty, koniec 3’ anty-mikroRNA-122
został skoniugowany z cholesterolem. Antagomir był dobrze tolerowany przez organizm myszy. Nie odnotowano zamian w profilu enzymatycznym wątroby, który
świadczyłby o toksyczności antagomiru
Podobne wyniki odnotowano w odrębnym badaniu (51). Podawano myszom antymikroRNA-122 IV dwa razy na tydzień przez cztery tygodnie. Antagomir wysycony
był wiązaniami tiofoforanowymi na całej swej długości. Ponadto zawierał w pozycji
2’rybozy grupę O-metoksyetylową. Odnotowano takŜe wzrost oksydacji kwasów
tłuszczowych w wątrobie oraz spadek syntezy kwasów tłuszczowych na skutek spadku
ekspresji genów, których produkty biorą udział w metabolizmie tłuszczów. Korzystne
zmiany w profilu lipidowym po stosowaniu anty-mikroRNA-122 obserwowano równieŜ u myszy otyłych na skutek specjalnie wdroŜonej diety. Dokładny mechanizm
działania antagomiru nie jest poznany, jednak przypuszcza się, iŜ wpływa on na dojrzałą cząsteczkę mikroRNA, gdyŜ poziom pre-mikroRNA-122 był niezmieniony. Najbardziej prawdopodobnym miejscem wiązania badanej cząsteczki jest kompleks RISC.
Wykazano równieŜ, Ŝe anty-mikroRNA-122 oddziałuje na replikację wirusa HCV
wywołującego u człowieka wirusowe zapalenie wątroby typu C. Wyniki badań in vitro
432 A. CIEPŁUCHA i wsp.
na liniach komórkowych CNS3 i 9-13 wskazują na istotne obniŜenie replikacji RNA
HCV po podaniu anty-mikro-22. Antagomir ten odpowiedzialny był równieŜ za redukcję poziomu mRNA Bach1 oraz za wzrost poziomu mRNA HO-1 (52). Bach-1 jest
białkiem wiąŜącym hem i stanowi w postaci heterodimeru z białekim Nrf2 (NF-E2related factor 2) czynnik hamujący ekspresję genu HO-1 poprzez zdolność wiązania się
z 5’UTR tego genu (53). HO-1 jest oksygenazą hemową o właściwościach antyoksydacyjnych, antyproliferacyjnych, przeciwzapalnych i obniŜenie ekspresji tego enzymu
ma istotne znaczenie w patogenezie przewlekłego zapalenia wątroby wywołanego
przez HCV (54). PowyŜsze dane sugerują, Ŝe dalsze badania nad stosowaniem antagomirów mogą w przyszłości przyczynić się do poprawy wyników leczenia przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu C.
Ponadto, antysensowne oligonukleotydy anty-mikroRNA-21 powodowały inhibicję
ekspresji mikroRNA-21 cząsteczki o działaniu przeciwapoptotycznym, co powodowało aktywację kaspazy-3 i kasapazy-7 i nasilenie apoptozy w warunkach in vitro. PodwyŜszona ekspresja mikroRNA-21 jest obserwowana w przypadkach glejaka wielopostaciowego (55).
W badaniu poświęconym analizie ekspresji poliscistronu mikroRNA-17-92 w
przewlekłej białaczce szpikowej wykorzystano antagomiry anty-mikroRNA-17.5p oraz
anty-mikroRNA-20. Wykazano znaczący spadek ekspresji dwóch składowych policistronu-mikroRNA-17.5p oraz mikroRNA-20 w hodowli linii komórkowej przewlekłej
białaczki szpikowej K562. Dowiedziono takŜe, iŜ na skutek nadekspresji mikroRNA
policistronu w wyniku transfekcji komórek K562 wirusowym wektorem ekspresyjnym
doszło do wzrostu proliferacji komórek i wraŜliwości na imatinib (56).
Przeprowadzone badanie in vitro na komórach raka piersi linii MCF-7 z uŜyciem
antagomiru skierowanego przeciw mikroRNA-206, wykazało obniŜenie mRNA receptora estrogenowego alfa (Erα) (57). Nadekspresja receptora ERα koreluje z wysokim
ryzykiem wystąpienia raka piersi oraz raka endometrium i wystęuje w około 70%
przypadków raka piersi. Przedstawione zaleŜności mogą okazać się istotne w leczeniu
tych nowotworów.
Interesującym doświadczeniem było zastosowanie mikroRNA w celu obniŜenia
ekspresji genu, który w warunkach fizjologcznych nie podlega regulacji przez mikroRNA. Czynnik transkrypcyjny Gli-1 (Glioma assosiated antygen-1) jestem elementem szlaku przekazywania sygnału komórkowego istotnego w procesie organogenezy.
Amplifikacja genu Gli-1 została wykazana w komórkach nowotworowych i często
skorelowana jest z podwyŜszoną ekspresją protoonkogenu Her-2 (58). Her-2 koduje
glikoproteinę o masie 185 kDa naleŜący do rodziny receptorów czynników wzrostowych o aktywności kinazy tyrozynowej. Nadekspresja Her-2 oraz Gli-1 powoduje
zaburzenia regulacji cyklu komórkowego, a takŜe zwiększa właściwości inwazyjne i
zdolność do tworzenia przerzutów (59). Wykazano, Ŝe zastosowanie syntetycznego
mikroRNA komplementarnego do 3’UTR mRNA dla Gli-1 skutkowało obniŜeniem
poziomu czynnika Gli-1 w liniach komórkowych raka jajnika SK-OV-3 oraz raka
trzustki MiaPaCa-2.
Perspektywy zastosowania mikroRNA
433
Pomimo stosunkowo ograniczonej jeszcze wiedzy na temat roli mikroRNA w patogenezie chorób i początkowej fazie badań potencjalnych strategii terapeutycznych,
wiąŜe się z nimi duŜe nadzieje. Perspektywa zastosowania mikroRNA w leczeniu chorób nowotworowych wydaje się obiecująca, jednak oprócz selekcji potencjalnych celów leczenia wymaga rozwiązania wielu problemów technicznych, m.in. udoskonalenia metod transferu mikroRNA i anty-mikroRNA do organizmu, poprawy wydajności
wektorów ekspresyjnych, a takŜe określenia i ograniczenia efektów niepoŜądanych
związanych z tym rodzajem terapii.
PIŚMIENNICTWO
1. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell 2004; 116: 281-97.
2. Bentwich I, Avniel A, Karov Y, et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved
human microRNAs. Nat Genet 2005; 37: 766–70.
3. Rodriguez A, Griffiths_Jones S, Ashurst JL, Bradley A. Identification of mammalian microRNA
hostgenes and transcription units. Genome Res 2004; 14:1902-1910
4. Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S, Kim VN MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellularlocalization. EMBO J .2002; 21: 4663-4670
5. Bartel DP MicroRNAs: genomics, biogenesis,mechanism, and function. Cell 2004, 23: 281-297
6. Han J, Lee Y, Yeom KH, Kim YK, Jin H TheDrosha-DGCR8 complex in primary microRNA
processing.Genes Dev .2004; 18: 3016-3027
7. Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J. The nuclearRNase III Drosha initiates microRNA processing.
Nature. 2003; 425: 415-419
8. Tang G. siRNA and miRNA: an insight into RISCs. Trends BiochemSci 2005; 30: 106-14.
9. Pasquelli AE and Ruvkun G. Control of developmental timing by microRNAsand their targets. Cell
Dev Biol. 2002; 18: 495-513.
10. Nakajima N, Takahashi T, Kitamura R, et al. MicroRNA-1facilitates skeletal myogenic differentiation withoutaffecting osteoblastic and adipogenic differentiation. Biochem Biophys Res Commun 2006;
350: 1006–12.
11. Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targetingBCL2.
Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: 13944–9.
12. Tsuchiya Y, Nakajima M, Takagi S, et al. MicroRNA regulates the expression of human cytochrome P450 1B1. Cancer Res 2006; 66: 9090–8.
13. Vo N, Klein ME, Varlamova O, et al. A cAMP-response element binding protein-induced microRNA regulates neuronal morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: 16426–31.
14. Garzon R, Pichiorri F, Palumbo T, et al. MicroRNA fingerprints during human megakaryocytopoiesis. Proc NatlAcad Sci USA 2006;103: 5078–83.
15. Felli N, Fontana L, Pelosi E, et al. MicroRNAs 221 and 222 inhibit normal erythropoiesis and
erythroleukemic cell growth via kit receptor down-modulation. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:
18081–6.
16. Poy MN, Eliasson L, Krutzfeldt J, et al. A pancreatic isletspecific microRNA regulates insulin secretion. Nature 2004; 226–30.
17. Esau C, Kang X, Peralta E, et al. MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation. J Biol Chem
2004; 279: 52361
18. Chen CZ. MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors. N Engel J Med 2005; 353: 1768-71.
19. Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs – microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer
2006; 6: 259–69.
434 A. CIEPŁUCHA i wsp.
20. Calin, G.A., Dumitru, C.D., Shimizu, M., Bichi, R., Zupo, S., Noch, E., Aldler, H., Rattan, S.,
Keating, M., Rai, K. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at
13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: 15524–15529.
21. Cimmino A, Calin GA, Fabbri M et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102: 13944-9.
22. Chan TO, Rittenhouse SE, Tsichlis PN. AKT/PKB and other D3 phosphoinositide-regulated
kinases: kinase activation by phosphoinositide-dependent phosphorylation. Annual Review of Biochemistry 1999; 68: 965–1014.
23. Laine J, Kunstle G, Obata Tet al. The protooncogene TCL1 is an Akt kinase coactivator. Molecular Cell 2000; 6: 395–407.
24. Mok CL, Gil-Gomez G, Williams O et al. Bad can act as a key regulator of T cell apoptosis and T
cell development. The Journal of Experimental Medicine 1999; 189: 575–586.
25. Du K & Montminy M. CREB is a regulatory target for the protein kinase Akt/PKB. The Journal
of Biological Chemistry 1998; 273: 32377–32379.
26. Eis PS, Tam W, Sun L, et al. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: 3627–32.
27. Kluiver J, Poppema S, de Jong D, et al. BIC and miR-155 are highly expressed in Hodgkin, primary mediastinal and diffuse large B cell lymphomas. J Pathol 2005;207: 243–9.
28. Metzler M, Wilda M, Busch K, et al. High expression of precursor microRNA-155/BIC RNA in
children with Burkitt lymphoma. Genes Chromosomes Cancer 2004; 39: 167–9.
29. Costinean S, Zanesi N, Pekarsky Y, et al. Pre-B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/highgrade lymphoma in E(mu)-miR155 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 7024–9.
30. Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, Meyer J, Lendeckel W, et al. Identification of tissuespecific microRNAs from mouse. Curr Biol 2002; 12: 735–739.
31. Ota A, Tagawa H, Karnan S, Tsuzuki S, Karpas A, Kira S, Yoshida Y, Seto M. Identification and
characterization of a novel gene, C13orf25, as a target for 13q31-q32 amplification in malignant lymphoma. Cancer Res 2004; 64: 3087-3095.
32. He L, Thomson JM, Hemann MT, et al. A mikroRNA polycistron as a potential human oncogene.
Nature 2005; 435: 828–833.
33. O’Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, Dang CV, Mendell JT. c-Myc-regulated microRNAs
modulate E2F1 expression. Nature 2005; 435: 839-843.
34. Trimarchi JM, Lees JA. Sibling rivalry in the E2F family. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3: 11-20.
35. He L, Thomson JM, Hemann MT, et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene.
Nature 2005; 435: 828-833.
36. Johnson SM, Grosshans H, Shingara J et al. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell
2005; 120: 635-647.
37. Voorhoeve, P.M., le Sage, C., Schrier, M., Gillis, A.J.M., Stoop, H., Nagel, R., Liu, Y.-P., van
Duijse, J., Drost, J., Griekspoor, A., 2006. A genetic screen implicates miRNA-372 and miRNA-373 as
oncogenes in testicular germ cell tumors. Cell 2006; 124: 1169–1181.
38. Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast
cancer. Cancer Res 2005; 65: 7065–7070.
39. Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res 2005; 65: 6029–6033.
40. Roldo C, Missiaglia E, Hagan JP, et al. MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behavior. J Clin
Oncol 2006; 24: 4677–4684.
41. Michael, M.Z., O'Connor S.M, Pellekaan, NGV, Young, GP, James, R.J., Reduced accumulation
of specific microRNAs in colorectal neoplasia. Mol. Cancer Res. 2003; 1: 882–891.
42. He H.L, Jazdzewski K, LiW, Liyanarachchi S, Nagy R, Volinia S, Calin GA, Liu CG, Franssila
K, Suster S, Kloos RT, Croce CM, de la Chapelle A. The role of microRNA genes in papillary thyroid
carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005a; 102: 19075–19080.
Perspektywy zastosowania mikroRNA
435
43. Murakami Y, Yasuda T, Saigo K, Urashima T, Toyoda H, Okanoue T, Shimotohno, K.,. Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues.
Oncogene 2006; 25: 2537–2545
44. Volinia S, Calin GA, Liu CG, et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103: 2257–2261.
45. Chen Y, Stallings RL. Differential patterns of mikroRNA expression in neuroblastoma are correlated with prognosis, differentiation, and apoptosis. Cancer Res 2007; 67: 976–983.
46. Lee YS, Dutta A. MicroRNAs: small but potent oncogenes or tumor suppressors. Curr Opin Investig Drugs 2006; 7: 560-564.
47. Liang Z. et al: Blockade of invasion and metastasis of breast cancer cells via targeting CXCR4
with an artificial microRNA. / Biochemical and Biophysical Research Communications. 2007; 363: 542–
546.
48. Li Z., Zhan W., Wang Z. et al: Inhibition of PRL-3 gene expression in gastric cancer cell line
SGC7901 via microRNA suppressed reduces peritoneal metastasis Biochemical and Biophysical Research
Communications 2006; 348: 229–237.
49. Wu X., Fan J., Wang X., Zhou J. et al: Downregulation of CCR1 inhibits human hepatocellular
carcinoma cell invasion, Biochemical and Biophysical Research Communications 2007; 355: 866–871.
50. Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R, et al. Silencing of microRNAs in vivo with ‘antagomirs’. Nature 2005; 438: 685–689.
51. Esau C, Davis S, Murray SF, et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo
antisense targeting. Cell Metab 2006; 3: 87–98.
52. Shan Y., Zheng J. Reciprocal Effects of Micro-RNA-122 on Expression of Heme Oxygenase-1
and Hepatitis C Virus Genes in Human Hepatocytes Gastroenterology 2007; 133: 1166–1174.
53. Oyake T, Itoh K, Motohashi H, et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine
zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol
Cell Biol 1996; 16: 6083–6095.
54. Okuda M, Li K, Beard MR, et al. Mitochondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene expression are induced by hepatitis C virus core protein. Gastroenterology 2002; 122: 366–375.
55. Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res 2005; 65: 6029-6033.
56. Letizia Venturini,1 Karin Battmer,1 Mirco Castoldi: Expression of the miR-17-92 polycistron in
chronic myeloid leukemia (CML) CD34_ cells Blood. 2007; 109: 4399–4405
57. Adams BD, Furneaux H, White BA. The micro-ribonucleic acid (miRNA) miR-206 targets the
human estrogen receptor-alpha (ERalpha) and represses ERalpha messenger RNA and protein expression
in breast cancer cell lines. Mol Endocrinol. 2007; 21: 1132–1147.
58. Stepan V, Ramamoorthy S, Nitsche H, Zavros Y,Merchant JL, Todisco A. Regulation and function ofthe sonic hedgehog signal transduction pathway inisolated gastric parietal cells. J Biol Chem 2005;
280: 15700–15708.
59. M. Tan, J. Yao, D. Yu, Overexpression of the c-erbB-2 gene enhanced intrinsic metastasis potential in human breast cancer cells without increasing their transformation abilities, Cancer Res 1997; 57:
1199–1205.
Praca wpłynęła do Redakcji 12.10.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 14.12.2007 r.
Adres Autorów:
Kliniki Hematologii Uniwersytet Medycznego w Łodzi
ul. Ciołkowskiego 2, 93-510 Lodz, Poland
Tel. +(48)42 6895191 Fax +(48)42 6895192
e-mail: [email protected]
436 A. CIEPŁUCHA i wsp.