pobierz

Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 1, str. 81–87
PRACA ORYGINALNA – Original Article
JADWIGA FABIJAŃSKA-MITEK1, ANNA WALASZCZYK2, ELśBIETA SOBCZAK2,
BARBARA PIĄTOSA3
Reakcje przeciwciał anty-HLA z krwinkami czerwonymi
Anti-HLA antibody reactions with red blood cells
1
Zakład Biofizyki, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego
Dział Immunologii, Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa
3
Pracownia Zgodności Tkankowej, Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa
2
STRESZCZENIE
ZałoŜenia: W surowicach niektórych wielokrotnych biorców krwi oraz kobiet, które były w ciąŜy
wykrywa się przeciwciała anty-HLA w teście limfocytotoksycznym (LCT). Antygeny HLA
znajdują się na leukocytach i innych komórkach jądrzastych. Na dojrzałych erytrocytach nie występują, ale ich pozostałości, oznaczane jako antygeny Bg, mogą być obecne. Celem pracy była
ocena aktywności przeciwciał anty-HLA w kolumnowych, Ŝelowych testach wykonywanych
przed przetaczaniem krwinek czerwonych. Materiał i metody: Surowice 114 chorych (23 płci
męskiej i 91 Ŝeńskiej; 14 dzieci od 2 do 17 lat oraz 100 dorosłych) z dodatnim LCT zbadano pośrednim testem antyglobulinowym (PTA). UŜyto 21 zestawów krwinek wzorcowych do wykrywania i identyfikacji przeciwciał. KaŜda surowica była badana z co najmniej 7 zestawami. Wyniki: U 14 chorych (12,3%) zidentyfikowano swoiste przeciwciała do krwinek czerwonych. U 30
(26,3%) stwierdzono wyłącznie nieswoiste reakcje. Zazwyczaj zachodziły one z tymi samymi
krwinkami wzorcowymi i często były to krwinki Bg(a+). Reakcje z krwinkami gotowymi do
uŜycia były częściej ujemne niŜ reakcje z krwinkami, których zawiesiny sporządzano w laboratorium. Wnioski: Surowice dające dodatnie wyniki w LCT i PTA powinny być badane z kilkoma
zestawami wzorcowych krwinek czerwonych, w tym z zawiesinami gotowymi do uŜycia dla
techniki kolumnowej. Postępowanie takie moŜe być pomocne w róŜnicowaniu nieswoistych reakcji przeciwciał od reakcji ze swoistymi antygenami krwinek czerwonych, które są odpowiedzialne za hemolityczne odczyny poprzetoczeniowe.
SŁOWA KLUCZOWE: Przeciwciała anty-HLA – Antygeny Bg – Nieswoiste reakcje z krwinkami
czerwonymi – Pośredni test antyglobulinowy – Technika kolumnowa – Test limfocytotoksyczny
SUMMARY
Background: In sera from some multi-transfused patients and women who have been pregnant,
we can detect anti-HLA antibodies by lymphocytotoxicity test (LCT). Human leukocyte antigens
(HLA) are present on leukocytes and other nuclear cells. They are absent on mature erythrocytes
however, their remnants sometimes are present as so-called Bg antigens. The aim of this study
was to evaluate reactivity of anti-HLA antibodies with RBCs in the pretransfusion column gel
tests. Sera from 114 LCT positive patients (23 males, 91 females; 14 children: 2–17 years old
and 100 adults) were tested by the column gel indirect antiglobulin test (IAT). Materials and
methods: twenty one red blood cell panels were used for antibody detection and identification.
82
J. FABIJAŃSKA-MITEK i wsp.
Each serum was tested usually with 7 RBC panels. Results: In 14 of the patients (12.3%) we
identified specific RBC alloantibodies. In 30 (26.3%) only non-specific reactions were noted,
usually with the same RBCs, which were often Bg(a+). Reactions with ready-to-use RBC panels
were more often negative than reactions with RBC suspensions prepared in the laboratory. Conclusions: LCT and IAT positive sera should be investigated with several different RBC panels,
especially with ready-to-use suspensions for the appropriate column technique. It can be helpful
to distinguish non-specific reactions and specific RBC antigen-antibody reactions potentially responsible for haemolytic post-transfusion reactions.
KEY WORDS: Anti-HLA antibodies – Bg antigen – Non-specific reactions with red blood cells –
Indirect antiglobulin test – Column technique – Lymphocytotoxicity test
WPROWADZENIE
Antygeny HLA (Human Leucocyte Antigen), czyli swoiste antygeny leukocytów
i innych komórek jądrzastych, są obecne na erytroblastach i retykulocytach. Większość
z nich zanika na dojrzałych krwinkach czerwonych, ale niektóre pozostają jako antygeny nazywane Bg (Bennett – Goodspeed): Bga, Bgb, Bgc, odpowiadające HLA: B7,
B17, A28/A2 [1, 5, 6]. Ekspresję Bg na krwince czerwonej ocenia się na 40–550
miejsc antygenowych, podczas gdy na limfocytach B jest 260000 miejsc antygenowych HLA, a na limfocytach T 100000 [8]. Podczas próby zgodności serologicznej,
poprzedzającej dobór koncentratów krwinek czerwonych (KKCz) do transfuzji, przeciwciała anty-HLA w surowicy biorcy mogą reagować z krwinkami czerwonymi. Zazwyczaj przeciwciała te, w stosunku do erytrocytów, są traktowane jako nieistotne
klinicznie, jednak dodatnie wyniki w pośrednim teście antyglobulinowym (PTA)
i problemy z ich interpretacją komplikują i przedłuŜają dobór KKCz do transfuzji,
zwłaszcza gdy technikę probówkową zastępuje się techniką kolumnową. Jedną z zalet
komercyjnych testów kolumnowych jest ich duŜa czułość, dzięki której zwiększa się
moŜliwość wykrycia przeciwciał potencjalnie odpowiedzialnych za hemolityczną reakcję potransfuzyjną. Z drugiej strony, w testach tych częściej moŜna wykryć reakcje
nieswoiste i uzyskać wyniki fałszywie dodatnie, wśród których wymieniano reakcje
przeciwciał anty-HLA z krwinkami czerwonymi [7]. Celem obecnych badań była ocena częstości występowania dodatnich reakcji przeciwciał anty-HLA z krwinkami
czerwonymi w testach kolumnowych oraz znalezienie sposobu postępowania, który
ułatwi róŜnicowanie tych przeciwciał od przeciwciał skierowanych do swoistych antygenów krwinek czerwonych.
MATERIAŁ I METODY
Zbadano 139 kolejnych, nie selekcjonowanych surowic od 114 chorych z dodatnim
wynikiem testu limfocytotoksycznego (LCT): 100 dorosłych pacjentów (18–84 lat)
i 14 dzieci (2–17 lat), u których wykryto przeciwciała anty-HLA w następujących sytuacjach klinicznych: 74 – analiza niehemolitycznych odczynów poprzetoczeniowych,
12 – dobór koncentratów krwinek płytkowych (KKP) do transfuzji, 6 – ocena nieswoistych reakcji serologicznych przed przetoczeniem KKCz, 22 – badania związane
z transplantacją nerki. Surowice przechowywano w stanie zamroŜenia. Po rozmroŜeniu
Reakcje przeciwciał anty-HLA z krwinkami czerwonymi
83
podzielono je na mniejsze porcje, aby uniknąć błędów wynikających z zamraŜania i
rozmraŜania. Próbki surowic badano jednocześnie z kilkoma dostępnymi zestawami
krwinek czerwonych. Badano teŜ poszczególne surowice z tymi samymi krwinkami
czerwonymi na początku i na końcu terminu waŜności.
Test limfocytotoksyczny (LCT)
W teście limfocytotoksycznym wykrywa się przeciwciała anty-HLA zaleŜne od
dopełniacza, który po wystąpieniu reakcji antygen-przeciwciało uszkadza błonę komórkową limfocytów i powoduje ich obumieranie. Dodany barwnik eozyna wnika do
wnętrza komórek, które powiększają się i nie odbijają światła – reakcja dodatnia. śywe
komórki nie wchłaniają barwnika, są małe i odbijają światło – reakcja ujemna. Badanie
przeprowadzano zgodnie ze standardową procedurą, na płytkach Terasaki, na które
przenoszono składniki reakcji mikrostrzykawką Hamiltona. Badanie wykonywano w
stosunku do limfocytów 10 lub 30 dawców zaleŜnie od ośrodka i celu badania. Wyniki
odczytywano w mikroskopie odwróconym kontrastowo-fazowym i za dodatnie przyjmowano te, w których >20% komórek było martwych.
Pośredni test antyglobulinowy (PTA)
Test przeprowadzano na kartach LISSCoombs (DiaMed, Szwajcaria), zawierających po 6 mikroprobówek z Ŝelem i z surowicą wieloswoistą: anty-IgG + anty-C3.
Kolejno odmierzano po 50µl 0,8% zawiesiny wzorcowych krwinek czerwonych do
wykrywania lub do identyfikacji przeciwciał i przenoszono je do poszczególnych mikroprobówek. Do kaŜdej mikroprobówki dodawano po 0,25µl surowicy badanej. Karty inkubowano przez 15 minut w 37oC, aby zaszła reakcja antygen-przeciwciało. Następnie wirowano je przez 10 minut i oceniano wyniki: dodatnie, gdy zaglutynowane
krwinki czerwone znajdowały się na powierzchni Ŝelu (4+) lub zostały w nim zatrzymane między powierzchnią a dnem (od 3+ do 1+) oraz ujemne, gdy wszystkie krwinki
czerwone znajdowały się na dnie mikroprobówki.
Krwinki wzorcowe
Stosowano gotowe do uŜycia zawiesiny krwinek wzorcowych do wykrywania
przeciwciał: 6 zestawów po 3 rodzaje krwinek czerwonych oraz do identyfikacji 3
zestawy po 11 rodzajów krwinek czerwonych (DiaMed, Szwajcaria). UŜyto teŜ wzorcowe krwinki czerwone, których zawiesiny sporządzano, aby odpowiadały wymogom
testu kolumnowego: 4 zestawy po 3 rodzaje krwinek do wykrywania przeciwciał –
Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (RCKiK) Warszawa, 6 zestawów po 6 rodzajów krwinek do wykrywania i identyfikacji przeciwciał – RCKiK Katowice oraz 2 zestawy po 16 rodzajów krwinek do identyfikacji przeciwciał – Immucor
Gamma, USA. Krwinki te przemywano 0,9% zbuforowanym roztworem NaCl oraz
roztworem NaCl o niskiej sile jonowej (LISS, RCKiK Katowice) i sporządzano z nich
84
J. FABIJAŃSKA-MITEK i wsp.
0,8% zawiesiny równolegle w roztworze LISS – odczynnik 1 (RCKiK Katowice) oraz
LISS – odczynnik 2 (DiaMed, Szwajcaria). Łącznie uŜyto 21 zestawów krwinek wzorcowych, a poszczególne surowice zbadano z co najmniej 7 zestawami.
WYNIKI
Wśród 114 chorych z dodatnim LCT było 23 męŜczyzn i 91 kobiet. Wśród dorosłych chorych 68 miało > 50 lat, a 32 osoby < 50 lat. U 14 chorych (12,3%) zidentyfikowano swoiste alloprzeciwciała do antygenów krwinek czerwonych, o pojedynczej
swoistości: 2 x anty-D, 2 x anty-K, anty-E, anty-CW, anty-M, anty-S, anty-Leb oraz
wieloswoiste: anty-D+C, anty-K+C, anty-c+E, anty-C+CW, anty-D+E+K. U 30 chorych (26,3%) wykryto wyłącznie reakcje nieswoiste z róŜnymi zestawami krwinek
czerwonych. Surowice 70 chorych (61,4%) nie reagowały z Ŝadnym z uŜytych do ich
badania zestawów wzorcowych (Ryc. 1).
%
70
anty-HLA
alloprzeciwciała swoiste
brak przeciwciał
60
50
40
30
20
10
0
Ryc. 1. Reakcje z krwinkami czerwonymi surowic 114 chorych z dodatnim LCT
Fig. 1. Reactions of sera from 114 LCT positive patients with RBCs
Reakcje przeciwciał anty-HLA z krwinkami czerwonymi
85
Aktywność serologiczną 30 surowic, w których nie wykryto swoistych przeciwciał
do krwinek czerwonych przedstawia Tabela 1.
Tabela 1. Charakterystyczne cechy nieswoistych reakcji 30 surowic, dodatnich w LCT i w kolumnowym
PTA w stosunku do róŜnych zestawów krwinek czerwonych
Table 1. Characteristics of non-specific reactions of 30 sera with positive LCT and column IAT with
different RBC panels
Reakcje poszczególnych surowic badanych z co Zazwyczaj dodatnie z krwinkami w 2–4 zestawach
najmniej 7 zestawami wzorcowych krwinek
czerwonych
Wyniki PTA róŜnych surowic
Zazwyczaj dodatnie z tymi samymi krwinkami
czerwonymi
Reakcje z krwinkami czerwonymi Bg (a+)
Częste – 70% surowic
Reakcje w ostatnim dniu terminu waŜności
Słabsze, ale tylko w 1 przypadku ujemne
krwinek czerwonych w porównaniu z reakcjami
świeŜych krwinek
Reakcje z zawiesinami krwinek czerwonych
6 (20%) wyników słabo dodatnich z
sporządzonych w LISS – odczynnik 1 w stoodczynnikiem 1 vs ujemne z odczynnikiem 2
sunku do zawiesin tych samych krwinek w
LISS – odczynnik 2
DYSKUSJA
Dotychczas nie przeprowadzono badań oceniających jak często u chorych z przeciwciałami anty-HLA mogą wystąpić reakcje dodatnie w stosunku do krwinek czerwonych, jeŜeli stosuje się czułą technikę kolumnową. Obecne badania wykazały, Ŝe problem moŜe dotyczyć ponad 25% chorych z dodatnim wynikiem LCT i Ŝe są to zazwyczaj kobiety oraz wielokrotni biorcy krwi. Nieliczni autorzy obserwowali reakcje przeciwciał limfocytotoksycznych w rutynowych badaniach serologicznych, przeprowadzanych testami probówkowymi, ale wykrywali je podczas stosowania specjalnych
technik np.: PTA w środowisku albuminy lub PTA w kapilarach [1, 4]. Ivankovic i
współpracownicy wykazali, Ŝe wśród róŜnych reakcji nieswoistych w testach kolumnowych, ok. 50% powodują przeciwciała limfocytotoksyczne [7]. Odnotowali, Ŝe znacząco częściej występowały one u kobiet niŜ u męŜczyzn oraz po 60. roku Ŝycia niŜ
przed 30. rokiem. Te obserwacje pacjentów są zbieŜne z naszą oceną.
Wśród omawianych obecnie chorych, znacznie częściej niŜ zdarza się to wśród
wielokrotnych biorców krwi (12% vs 3%), wykryto swoiste, klinicznie istotne alloprzeciwciała odpornościowe, w tym przeciwciała wieloswoiste. Podobną predyspozycję do wytwarzania przeciwciał anty-HLA przez chorych z przeciwciałami przeciw
krwinkom czerwonym opisali Buentes i współpracownicy [3]. Obserwowano teŜ, Ŝe
osoby łatwo ulegające uodpornieniu antygenami HLA, wytwarzają je nawet wtedy,
gdy przetacza się KKCz lub KKP filtrowane, czyli w znacznym stopniu pozbawione
leukocytów i niezaleŜnie, czy procedurę przeprowadzi się po pobraniu krwi, czy przed
transfuzją [11].
PoniewaŜ w obecnych badaniach prawidłowością były powtarzające się reakcje
wielu surowic z konkretnymi krwinkami czerwonymi w poszczególnych zestawach
86
J. FABIJAŃSKA-MITEK i wsp.
wzorcowych, to moŜna było załoŜyć, Ŝe dawcy tych krwinek czerwonych posiadali
większą od innych ekspresję antygenów Bg. Niektórzy autorzy wykrywali antygeny
Bga u 93% dawców, a Bgb u 80% dawców [4]. Inni stwierdzili obecność antygenów Bg
u ok. 50% ludzi [2, 8]. JeŜeli w prezentowanych badaniach uŜyto krwinki zidentyfikowane jako Bg(a+), to większość dodatnich reakcji dotyczyła tych krwinek, ale niektóre
surowice reagowały z krwinkami Bg(a+) w jednym zestawie i nie reagowały z Bg(a+)
w innym zestawie. Badania innych autorów wykazały, Ŝe przeciwciała limfocytotoksyczne rzadko mają pojedynczą swoistość np. anty-Bga, natomiast często są to antyBga+Bgb, anty-Bga+Bgc lub anty-Bga+Bgb+Bgc [6]. W prezentowanych badaniach wieloswoistość przeciwciał anty-Bg mogła być przyczyną róŜnego nasilenia reakcji
z krwinkami czerwonymi Bg(a+) pochodzącymi od róŜnych dawców.
Wiadomo, Ŝe antygeny Bg u poszczególnych osób mogą mieć w róŜnych okresach
Ŝycia róŜną ekspresję i Ŝe słabnie ona podczas starzenia się erytrocytów [1]. Poza jednym przypadkiem, nie obserwowano braku reakcji surowicy z krwinkami czerwonymi
pod koniec terminu ich waŜności, ale na ogół reakcje te były słabsze od reakcji
z krwinkami świeŜymi. Okres przydatności krwinek czerwonych do uŜycia wynosi od
4 do 6 tygodni i jest znacznie krótszy od Ŝycia krwinek czerwonych in vivo (ok. 17
tygodni), co moŜe tłumaczyć zachowanie ekspresji antygenów Bg podczas przechowywania.
Niektóre firmy przygotowujące krwinki czerwone do serologicznych badań diagnostycznych, aby uniknąć reakcji nieswoistych, dobierają dawców o niskiej ekspresji
antygenów Bg lub sporządzają specjalne roztwory do zawieszania krwinek czerwonych, ograniczające aktywność przeciwciał anty-HLA. Wiadomo, Ŝe obniŜone pH oraz
niska siła jonowa osłabiają ekspresję antygenów Bg, dlatego reakcje przeciwciał limfocytotoksycznych częściej występują w próbie krzyŜowej, gdy pracownik laboratorium sam sporządza zawiesinę krwinek czerwonych, niŜ w badaniu przeciwciał z gotowymi do uŜycia krwinkami czerwonymi, znajdującymi się cały czas w odpowiednim
roztworze [7, 10]. Podobnie, w obecnych badaniach częściej obserwowano reakcje
dodatnie, gdy wykonywano PTA z krwinkami czerwonymi przygotowanymi w pracowni, a nie z krwinkami wzorcowymi gotowymi do uŜycia.
Dyskusyjnym i niewyjaśnionym problemem pozostają nieliczne doniesienia o moŜliwych hemolitycznych reakcjach poprzetoczeniowych wywołanych przeciwciałami
anty-HLA [2, 10]. Przypadki te budzą wątpliwości, co do prawidłowej oceny. MoŜna
sądzić, Ŝe podczas analizy odczynu hemolitycznego nie wykryto swoistych przeciwciał
i przypisano objawy przeciwciałom anty-HLA [9]. MoŜna teŜ przypuszczać, Ŝe przeciwciała limfocytotoksyczne mogły wywołać hemolizę, gdy reagując z leukocytami,
pobudzały układ dopełniacza, którego składniki łatwo wiąŜą się z receptorami CR (coplement receptor) erytrocytów.
Podsumowując przeprowadzone badania moŜna stwierdzić, Ŝe zastosowanie
wszystkich firmowych odczynników dla danej techniki kolumnowej, ogranicza reakcje
przeciwciał limfocytotoksycznych z antygenami krwinek czerwonych, czasem pozwala
na zidentyfikowanie ich jako anty-Bga. MoŜliwość zbadania surowicy pacjenta z kilkoma zestawami krwinek czerwonych, pochodzącymi z róŜnych źródeł, wydaje się
Reakcje przeciwciał anty-HLA z krwinkami czerwonymi
87
najskuteczniejszym sposobem róŜnicowania przeciwciał anty-HLA od klinicznie istotnych alloprzeciwciał odpornościowych, reagujących ze swoistymi antygenami krwinek
czerwonych.
Praca została sfinansowana w ramach projektu badawczego CMKP nr 501-21-23-03/06
PIŚMIENNICTWO
1. Brecher ME. Ed. AABB Techical Manual 14th ed. Antibodies to low-incidence antigens. 2003; 338:
684.
2. Benson K, Agosti SJ, Latoni-Benedetti GE, Leparc GF. Acute and delayed hemolytic transfusion reactions secondary to HLA alloimmunization. Transfusion 2003; 753-757.
3. Buentes O, Shirey RS, Gooble-Lee M, Houp J, Zachary A, King KE, Ness PM. Prevalence of HLA
antibodies in transfused patients with and without red cell antibodies. Transfusion 2006; 46: 754-760.
4. Crawford MN, Schroeder ML. Bga and Bgb correlations with HLA antigens by capillary tube technique. Transfusion 1980; 20: 594-596.
5. Daniels G. Human blood groups. HLA (Human Leucocyte Associated) class I antigens on red cells.
Blackwell Science Ltd. 1995; 668-671.
6. Issitt PD, Anstee DJ. Applied blood group serology, 4th ed. Low incidence antigens and Bg. Montgomery Science Publications, Durham, North Carolina, USA, 1998; 834-838.
7. Ivancovic Z, Golubic B, Lucic M, Plencovic F, Bojanic I, Pool J. Positive antibody tests without detectable specific antibodies; part I: features; part II: causes and relationships. Vox Sang 2005; 89 (S1):
145-146.
8. Klein HG, Anstee DJ. Mollison’s Blood transfusion in clinical medicine, 11th ed. HLA antigens detectable on red cells. Blackwell Publishing Ltd. 2005; 237-238.
9. Nance ST. Do HLA antibodies cause hemolytic transfusion reactions or decreased RBC survival?
Transfusion 2003; 43: 687-690.
10. Takeuchi C, Ohto H, Miura S, Yasuda H, Ono S. Ogata T. Delayed and acute hemolytic transfusion
reactions resulting from red cell antibodies and red cell-reactive HLA antibodies. Transfusion 2005;
45: 1925–1929.
11. Van de Watering, Hermans Jo, Witviliet M, Versteegh M, Brand A. HLA an RBC immunization after
filtered and buffy coat-depleted blood transfusion in cardiac surgery: a randomized controlled trial.
Transfusion 2003; 43: 765–771.
Praca wpłynęła do Redakcji 8.04.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 24.09.2008 r.
Adres do korespondencji:
Jadwiga Fabijańska-Mitek
Zakład Biofizyki
Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego
ul. Marymoncka 99/103
01-813 Warszawa