pobierz

Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 4, str. 887–898
PRACA ORYGINALNA – Original Article
ANITA ZABOROWSKA1, BARBARA CEBULA-OBRZUT2, IDA FRANIAKPIETRYGA1,3, JERZY Z. BŁOŃSKI1, PIOTR SMOLEWSKI2, TADEUSZ ROBAK1,
ANNA KORYCKA-WOŁOWIEC1
Wpływ bendamustyny zastosowanej pojedynczo lub w skojarzeniu z analogami nukleozydów purynowych na przeŜywalność oraz apoptozę komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w hodowli in vitro
The influence of bendamustine used either alone or in combination
with purine nucleoside analogues on the viability and apoptosis of
chronic lymphocytic leukemia cells in culture in vitro
1
Z Kliniki Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. Tadeusz Robak
2
Z Zakładu Hematologii Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. Piotr Smolewski
3
Z Zakładu Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. Marek Mirowski
STRESZCZENIE
Bendamustyna (BENDA) jest lekiem cytotoksycznym łączącym cechy leku alkilującego i antymetabolitu i wykazującym skuteczność terapeutyczną w nieziarniczych chłoniakach złośliwych,
w tym takŜe w przewlekłej białaczce limfocytowe (PBL). W mechanizmie jej działania istotną
rolę odgrywa zarówno indukcja apoptozy, jak równieŜ katastrofa mitotyczna prowadząca do
śmierci komórki na drodze martwicy. Celem naszych badań była ocena wpływu BENDA zastosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu z analogami nukleozydów purynowych (ANP: 2-CdA i
FA) na apoptozę i przeŜywalność komórek PBL w hodowli in vitro oraz ocena typu interakcji
zachodzących pomiędzy badanymi lekami. Wykazaliśmy, Ŝe BENDA zastosowana pojedynczo
w stęŜeniu 20 i 40 µg/ml najsilniej indukuje apoptozę komórek PBL. Ponadto, łączne zastosowanie BENDA z ANP znamiennie silniej hamuje przeŜycie komórek niŜ leki zastosowane pojedynczo. Synergistyczny/ addycyjny efekt działania BENDA zastosowanej łącznie z ANP sugeruje
celowość podjęcia dalszych badań nad jej skojarzeniem z innymi lekami cytotoksycznymi,
zwłaszcza z przeciwciałami monoklonalnymi.
SŁOWA KLUCZOWE: Bendamustyna – 2-chlorodeoksyadenozyna – Fludarabina – Przewlekła
białaczka limfocytowa – Apoptoza – Interakcje
SUMMARY
Bendamustine (BENDA) is a cytotoxic drug combining alkylating and antimetabolite properties
and showing therapeutical activity in non-Hodgkin’s lymphomas including chronic lymphocytic
leukemia (CLL). In the mechanism of its action the important role is played either by apoptosis
or mitotic catastrophe which leads to necrotic cell death. The aim of our studies was to evaluate
888 A. ZABOROWSKA i wsp.
the influence of BENDA used alone or in combination with purine nucleoside anlogues (PNA: 2CdA and FA) on apoptosis and viability of CLL cells in culture in vitro as well as the estimation
the type of interaction between the studied drugs. We have demonstrated that BENDA at the
concentrations of 20 and 40 µg/ml induces apoptosis of CLL cells in the higher degree. Additionally, BENDA used jointly with PNA more strongly inhibited the viability of cells then the
drugs used alone. Synergistic/additive effect of BENDA used together with PNA suggests that
the further studies concerning the combined treatment of BENDA with other cytotoxic drugs especially with monoclonal antibodies are worth.
KEY WORDS: Bendamustine – 2-chlorodeoxyadenosine – Fludarabine – Chronic lymphocytic
leukemia – Apoptosis – Interactions
WSTĘP
Od dawna prowadzone są intensywne badania mające na celu poszukiwanie nowych leków skutecznych w leczeniu chorób nowotworowych układu krwiotwórczego.
Przez wiele lat leczenie przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL) opierało się na stosowaniu leków alkilujących takich jak iperyt azotowy, cyklofosfamid czy chlorambucyl (Chl) [1, 2]. W latach 80. ubiegłego wieku zsyntetyzowano pierwsze związki naleŜące do grupy tzw. analogów nukleozydów purynowych (ANP). Dwa z nich: kladrybina (2-chlorodeoksyadenozyna; 2-CdA) oraz fludarabina (FA) są rutynowo stosowane
w terapii PBL, białaczki włochatokomórkowej oraz nieziarniczych chłoniaków zlośliwych (ChNZ) [3, 4]. Leki te zastosowane in vitro zarówno pojedynczo, jak i w skojarzeniu z innymi lekami przeciwbiałaczkowymi są równieŜ od wielu lat badane w Klinice Hematologii w Łodzi pod kątem ich wpływu na ukierunkowane komórki prekursorowe układu granulocytaro-makrofagowego, jak równieŜ na limfocyty B uzyskane
od chorych na PBL [5, 6].
Obecnie coraz więcej uwagi poświęca się bendamustynie (BENDA) – lekowi
zsyntetyzowanemu w latach 60. ubiegłego wieku w ówczesnej Niemieckiej Republice
Demokratycznej i przez wiele lat niedocenianemu [7, 8]. Cytotoksyczną aktywność
BENDA zawdzięcza unikalnej strukturze chemicznej, łączącej cechy leku alkilującego
i antymetabolitu. W budowie chemicznej leku wyróŜnia się bowiem alkaliczną grupę
bis(2-chloroetylo)aminową, pierścień benzoimidazolowy oraz łańcuch kwasu masłowego [9–11].
Współczesne badania in vitro, badania przedkliniczne i kliniczne dotyczące mechanizmu działania, farmakokinetyki, profilu bezpieczeństwa oraz wskazań do klinicznego zastosowania wskazują, Ŝe BENDA wykazuje skuteczność terapeutyczną w chorobach limfoproliferacyjnych, a takŜe w pierwotnych i nawrotowych guzach litych
[12–15]. W roku 2008 lek został zaakceptowany przez Food and Drug Administration
(FDA) do pierwszej linii leczenia chorych na PBL oraz chorych na indolentne ChNZ,
oporne na wcześniejsze leczenie schematem zawierającym rituksymab (RIT) [12].
BENDA nie wykazuje oporności krzyŜowej z innymi lekami cytotoksycznymi i moŜe
być stosowana u chorych na indolentne ChNZ, u których wystąpiła oporność na standardowe leczenie preparatami alkilującymi, takimi jak cyklofosfamid, doksorubicyna,
czy etopozyd [16]. Ponadto wykazano, Ŝe ze względu na unikalny mechanizm działa-
Wpływ bendamustyny
889
nia lek zachowuje aktywność terapeutyczną u chorych na PBL, u których wykryto
delecję chromosomu 17p i/lub inaktywację genu p53 [17].
Dotychczas opublikowane badania kliniczne wskazują, iŜ większą skuteczność
BENDA zwiększa się po jej zastosowaniu w połączeniu z innymi cytostatykami.
Szczególnie podkreśla się skuteczność skojarzonego stosowania BENDA z RIT lub
RIT i mitoksantronem (MIT) [18, 19]. Ponadto, w badaniach przeprowadzonych in
vitro wykazano synergizm działania BENDA z FA lub gemcytabiną [13, 17]. Nie
opublikowano jednak dotąd badań dotyczących interakcji BENDA z innymi ANP,
w szczególności z 2-CdA.
Celem naszych badań była ocena wpływu BENDA zastosowanej pojedynczo oraz
w skojarzeniu z 2-CdA lub FA na apoptozę oraz przeŜywalność limfocytów białaczkowych uzyskiwanych od chorych na PBL w hodowli in vitro. Dokonaliśmy równieŜ
oceny typu interakcji zachodzących pomiędzy badanymi lekami.
MATERIAŁY I METODY
Charakterystyka chorych
Materiał do badań stanowiła krew obwodowa uzyskana od 30 uprzednio nie leczonych chorych na PBL (16 K i 14 M ), w wieku 53–85 lat (średnia 66,2; mediana 63,5),
będących pod opieką Poradni Hematologicznej i Kliniki Hematologii UM w Łodzi
w roku 2008. Badanie uzyskało akceptację Komisji Bioetycznej przy UM w Łodzi,
a wszyscy chorzy wyrazili zgodę na udział w badaniu.
Badane leki
BENDA została udostępniona do badań przez firmę Mundipharma (GmbH, Niemcy) w postaci krystalicznego proszku. Po rozpuszczeniu w medium hodowlanym
RPMI-1640 lek był przechowywany w temperaturze –20°C w stęŜeniu 400 µg/ml
(1mM). Do badań oceniających cytotoksyczność oraz wpływ BENDA na apoptozę
komórek PBL stosowano następujące stęŜenia leku: 1, 2, 5, 10, 20, 40i 80 µg/ml. Do
oceny skojarzonego działania leku z ANP wybrano stęŜenia BENDA: 20 i 40 µg/ml. W
wyborze stęŜeń wykorzystano wyniki wcześniejszych badań [13].
Kladrybina (2-CdA Biodrybina; Bioton, Polska) oraz (Fludara; Bayer, Niemcy) są
lekami dostępnymi komercyjnie. Kladrybina jest dostępna w fiolkach zawierających
1 mg/ml 2-CdA, natomiast Fludara w fiolkach zawierających 50 mg monofosforanu
fludarabiny (FAMP), co odpowiada 39,05 mg aktywnej fludarabiny (FA). 2-CdA stosowano w stęŜeniach: 25, 50 i 100 nM, natomiast FA w stęŜeniach 0,8, 1,6 i 3,2 µM.
W celu oceny skojarzonego działania leków, 2-CdA stosowano w stęŜeniach 25 i 50
nM, natomiast FA w stęŜeniach 0,8 i 1,6 µM. StęŜenia ANP wybrano na podstawie
wcześniejszych badań własnych [6].
890 A. ZABOROWSKA i wsp.
Izolacja i hodowla komórek jednojądrowych in vitro
Komórki jednojądrowe (Mononuclear cells; MNCs) izolowano z heparynizowanej
krwi obwodowej poprzez jej nawarstwienie na Histopaque 1077 (Sigma, St Louis,
USA) i wirowanie w gradiencie gęstości przez 20 min., z przyspieszeniem 200 g.
Uzyskany na granicy faz pierścień MNCs izolowano i płukano dwukrotnie w płynie
Hanksa.
Następnie uzyskane MNCs zawieszano w podłoŜu hodowlanym RPMI-1640 w stęŜeniu 1×106 komórek/ml, dodawano 20% inaktywowanej płodowej surowicy cielęcej,
antybiotyki (streptomycyna, gentamycyna, Sigma, ST. Louise, USA) oraz badane leki.
Hodowle inkubowano przez 24 lub 48 godzin w cieplarce biologicznej z dopływem 5%
CO2, w temperaturze 37°C, w warunkach 98% wilgotności. Hodowle wykonywane bez
dodania leków stanowiły kontrolę.
W pierwszym etapie badań leki dodawano do hodowli pojedynczo, w stęŜeniach
przedstawionych powyŜej, natomiast w drugim etapie stosowano następujące kombinacje ich stęŜeń:
20 µg/ml BENDA + 25 nM 2-CdA
20 µg/ml BENDA + 0,8 µM FA
40 µg/ml BENDA + 50 nM 2-CdA
40 µg/ml BENDA + 1,6 µM FA.
Ocena apoptozy i cytotoksyczności
Przed rozpoczęciem hodowli oraz po 24 i 48 godzinach inkubacji obliczano całkowitą liczbę komórek w hodowli. Po zakończeniu inkubacji, MNCs płukano dwukrotnie
w schłodzonym, zbuforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej (PBS), a
następnie komórki zawieszano w buforze wiąŜącym zawierającym 5 µl FITC sprzęŜonym z anneksyną-V (AnnV) oraz 10 µg/ml jodku propydyny (JP). Następnie próbki
inkubowano przez 15 min., w ciemności, w temp. pokojowej i niezwłocznie oceniano
fluorescencję przy uŜyciu cytometru przepływowego (Facs Calibur, Becton Dickinson)
przy długości fali FL1 490" ± 20 nm i dla FL3 530" ± 20 nm [20, 21].
W celu obliczenia indeksu apoptotycznego (apoptotic index; AI) oceniano komórki
wybarwiające się anneksyną V (AnnV+/JP– oraz AnnV+/JP+). Skompensowany indeks apoptotyczny (compensating apoptotic index; CAI) obliczano jako róŜnicę pomiędzy apoptozą indukowana lekami, a apoptozą spontaniczną, obserwowaną w hodowlach kontrolnych. Cytotoksyczność leków oceniano badając Ŝywotność komórek
za pomocą barwienia JP.
Analiza statystyczna i ocena interakcji
Analizę statystyczną wykonano przy uŜyciu programu STATISTICA v 5.0, USA.
RóŜnice statystyczne istotne pomiędzy wynikami uzyskanymi w hodowlach, do któ-
Wpływ bendamustyny
891
rych dodano leki oraz w hodowlach kontrolnych oceniano stosując test par Wilcoxona
i przyjmując za statystycznie istotne p < 0,05.
IC50 definiowano jako stęŜenie powodujące cytotoksyczność 50% komórek.
CI (combination index, index interakcji), pozwalający na określenie typu interakcji
obliczano wg poniŜszego wzoru:
[A]
[B]
A, B – IC50 leków zastosowanych w skojarzeniu;
---- + ----[Ai]
[Bi]
Ai , Bi – IC50 leków zastosowanych pojedynczo
CI < 0,8 definiowano jako synergizm, CI w zakresie 0,8–1,2 definiowano jako addycję, natomiast CI > 1,2 definiowano jako subaddycję (antagonizm) [22].
WYNIKI
Odsetek komórek ulegających apoptozie indukowanej BENDA zastosowaną we
wszystkich stęŜeniach powyŜej 1 ug/ml, zarówno po 48, jak i po 24 godz., był znamiennie wyŜszy, niŜ komórek ulegających apoptozie spontanicznej (p<0.01) (Tabela
1). Analizę cytometryczną komórek PBL ulegających apoptozie przedstawiono na Ryc.
1. NajwyŜszą wartość skompensowanego indeksu apoptotycznego (CAI) uzyskano po
48 godz. inkubacji MNCs z BENDA zastosowaną w stęŜeniach 20 lub 40 µg/ml. Dla
powyŜszych stęŜeń CAI wynosił odpowiednio 10,2% i 10,9% (Tabela 1).
Zastosowanie BENDA w stęŜeniu 5 µg/ml lub wyŜszym powodowało ponadto
znamienne zmniejszenie przeŜycia komórek PBL, w porównaniu z hodowlami kontrolnymi (p<0.01) (Tabela 2). Cytotoksyczny wpływ zarówno BENDA, jak i ANP zastosowanych pojedynczo na komórki PBL był znamiennie większy, niŜ obserwowany
w hodowlach kontrolnych (p<0.001) (Tabela 3).
BENDA w stęŜeniu 40 µg/ml, zastosowana łącznie z 2-CdA w stęŜeniu 50 nM lub
z FA w stęŜeniu 1,6 µM, silniej hamowała przeŜycie komórek, niŜ badane leki zastosowane pojedynczo (p<0.02) (Tabela 4). IC50 dla BENDA zastosowanej pojedynczo
wynosiło 72,4 µg/ml, natomiast dla 2-Cda i FA wynosiło odpowiednio 70,9 nM i 1,3
µM. (Tabela 3). W przypadku leków zastosowanych w skojarzeniu wartość IC50 wynosiła 23,4 µg/ml i 29,3 nM odpowiednio dla BENDA i 2-CdA, natomiast dla BENDA i
FA odpowiednio 23,8µg/ml i 0,95 µM (Tabela 4). BENDA w skojarzeniu z 2-CdA
wykazywała działanie synergistycznie (CI=0,73), natomiast z FA działała addycyjne
(CI=1,06) (Tabela 4).
Kontrola
24h
48h
1
2
25
26
13,5 18,9
12,5 13,2
1,7– 0,7–
53,4 50,7
10,2 16,3
BENDA
1 µg/ml
24h
48h
3
4
13
16
14,7 18,1
15,7 14,4
3,9– 4,1–
65,4 63,5
10,8 14,6
0,6
0
BENDA
2 µg/ml
24h
48h
5
6
17
16
15,1
22,9
13,9
17,2
3,3–
3,2–
59,6
72,5
10,6
20,5
0,4% 4,2%
BENDA
5 µg/ml
24h
48h
7
8
17
15
17,4
27,6
17,2
18,6
5,1–
3,9–
72,2
65,7
10,8
20,2
0,6% 3,9%
BENDA
10 µg/ml
24h
48h
9
10
17
16
16,5
28,9
15,9
21,2
3,8–
2,3–
66,4
77,2
11,5
23,6
1,3% 7,3%
BENDA
20 µg/ml
24h
48h
11
12
16
16
18,1
27,7
17,4
17,2
4,1–
2,4–
66,6
60,7
13,4
26,5
3,2% 10,2%
BENDA
40 µg/ml
24h
48h
13
14
16
16
21,9
30,5
18,5
19,1
4,9–
2,6–
73,7
66,3
16,7
27,2
6,5% 10,9%
P
Analiza
statystyczna
Tabela 2. Wpływ bendamustyny (BENDA) na przeŜywalność komórek PBL w hodowli in vitro
Table 2. The influence of bendamustine (BENDA) on the viability of CLL cells in culture in vitro
BENDA
BENDA
BENDA
BENDA
BENDA
BENDA
BENDA
Analiza
Kontrola
1 µg/ml
2 µg/ml
5 µg/ml
10 µg/ml
20 µg/ml
40 µg/ml
80 µg/ml statystyczna
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
48h
P
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
22
54
10
11
11
12
11
10
11
11
13
18
15
34
20
2v8=0,01;
n
2v10=0,004;
16,2
32,4
17,4
32,3
21,7
36,4
24,1
36,1
22,4
37,4
17,4
38,0
19,8
42,9
50,4
X
2v12=-,004;
7,4
13,9
9,1
16,4
15,2
19,9
18,4
18,4
17,2
18,8
3,6
11,7
7,6
15,6
16,1
SD
2v14=0,0001;
6,0– 11,5– 8,5– 18,1– 9,3– 17,4– 10,1– 20,2– 10,6– 21– 13,2– 17,5– 10,3– 15,6–
21,9–
Zakres
2v15=0,0009;
34,9
64,8
36,7
63,5
59,6
72,5
72,2
68
66,4
76,9
19,8
54,6
31,5
71,2
77,4
2v16=0,0006
31,9
14,9
25,4
16,7
24,6
18,5
27,3
16,3
28,9
19,1
37,2
19,3
44,9
51,2
Mediana 15,3
+
+
N – liczba próbek; × – średni odsetek komórek JP ; SD – odchylenie standardowe; mediana- mediana komórek JP ; IC50 – stęŜenie, które powoduje toksyczność
50% komórek; 2-CdA – 2-chlorodeokyadenozyna (kladrybina); BENDA – bendamustyna, P – analiza statystyczna
Lek
n
X
SD
Zakres
1v5=0,003;
1v7=0,001;
1v9=0,001;
1v11=0,003;
1v13=0,0006;
2v6=0,01
Mediana
2v8=0,003;
CAI (%)
2v10=0,002;
2v12=0,001,
2v14=0,006
n – liczba próbek, X – średni procent komórek ulegających apoptozie (Ann-V+ ), SD – odchylenie standardowe, CAI – skompensowany indeks apoptotyczny,
P – analiza statystyczna
Lek
Tabela 1. Wpływ bendamustyny (BENDA) na apoptozę komórek PBL w hodowli in vitro
Table 1. The influence of bendamustine (BENDA) on the apoptosis of CLL cells in culture in vitro
2
n=18
38,0
11.7
17.5–54.6
1
n=52
32,4
13,8
11,5–64,8
X
SD
15,6–71.2
15,6
3
n=34
42.9
40 µg/ml
BENDA
21,9–77.4
16,1
4
n=20
50,4
80 µg/ml
14.5–72,5
19.6
5
n=22
40.3
25 nM
17.3–70,8
17,1
6
n=23
42,4
50 nM
2-CdA
21.9–76-8
16,7
7
n=16
57,7
100 nM
17.7–69,9
15.5
8
n=30
45.8
0.8 µM
18,7–75,7
18,2
9
n=26
49,5
1.6 µM
Fludarabina
21.3–80.2
18.4
10
n=21
53,2
3.2µ
µM
Analiza
statystyczna
P<0.001
11
1v3; 1v4;
1v5; 1v6;
1v7; 1v9;
1v10
Kontrola
BENDA
BENDA
BENDA
Analiza
statystyczna
40 µg/ml
20 µg/ml
40 µg/ml
P<0,001
+ 2-CdA 50 nM
+ FA 0,8µ
µM
+ FA 1,6 µM
1
3
4
5
6
n=52
n=12
n=10
n=12
32,4
61,3
50,5
62,7
X
1v3 = 0,02
13,8
13,8
12,6
13,4
SD
1v5 = 0,02
11,5–64,8
38,9–89,9
38,1–66,3
47,2–87,3
zakres
31,9
59.6
47,6
60,4
Median
IC50 dla leków zastosowa23,4 µg/ml
BENDA
23,8 µg/ml
nych pojedynczo
–––––
29,3 nM
FA
0,95 µM
CI
–––––
0,73
1.06
Typ interakcji
–––––
Synergizm
Addycja
N – liczba próbek; × – średni odsetek komórek JP+; SD – odchylenie standardowe; mediana – mediana komórek JP+; IC50 – stęŜenie, które powoduje toksyczność
50% komórek; CI indeks kombinacji; 2-CdA – 2-chlorodeokyadenozyna (kladrybina); BENDA – bendamustyna
Lek
BENDA
20 µg/ml
+ 2-CdA 25 nM
2
n=12
45,9
9,2
31,5–72,8
48,0
BENDA
2-CdA
Tabela 4. Cytotoksyczny wpływ bendamustyny zastosowanej w skojarzeniu z analogami nukleozydów purynowych na komórki przewlekłej
białaczki limfocytowej w hodowli in vitro, po 48 godzinach inkubacji
Table 4. The cytotoxic effect of bendamustine (BENDA) used in combination with purine nucleoside analogues on CLL cells in culture in vitro,
after 48 hours incubation
31,9
37,2
44,9
51,2
39,9
40,7
62,9
44.6
53,1
59,7
Mediana
IC50
70.9nM
µg/ml
1.3µ
µM
72.4µ
N – liczba próbek; × – średni odsetek komórek JP+; SD – odchylenie standardowe; mediana- mediana komórek JP+; IC50 – stęŜenie, które powoduje toksyczność
50% komórek; 2-CdA – 2-chlorodeokyadenozyna (kladrybina); BENDA – bendamustyna
Zakres
20 µg/ml
Kontrola
Lek
Tabela 3. Cytotoksyczny wpływ bendamustyny (BENDA) i analogów nukleozydów purynowych (2-CdA, FA) zastosowanych pojedynczo na
komórki przewlekłej białaczki limfocytowej w hodowli in vitro, po 48 godzinach inkubacji
Table 3. The cytotoxic effect of bendamustine (BENDA) or purine nucleoside analogues (20CdA, FA) used alone on the CLL cells in culture in
vitro after 48 hours incubation
894 A. ZABOROWSKA i wsp.
Ryc. 1. Analiza cytometryczna komórek PBL ulegajacych apoptozie
Fig. 1. The cytometric analysis of apoptotic CLL cells
DYSKUSJA
W ostatnim czasie, w badaniach nad optymalizacją leczenia PBL zwrócono uwagę
na BENDA. Jest to lek o unikalnej strukturze chemicznej i złoŜonym mechanizmie
działania, polegającym z jednej strony na aktywacji apoptozy w następstwie uruchomienia szlaku odpowiedzi na stres wywołany uszkodzeniem DNA, z drugiej natomiast
związanym ze zniesieniem mitotycznych punktów kontrolnych i w wyniku katastrofy
mitotycznej prowadzącym do martwicy (nekrozy) [11].
Opublikowane wyniki badań I i II fazy z zastosowaniem BENDA tak w monoterapii, jak i w skojarzeniu z mitoksantronem oraz rituksymabem, wykazały jego względnie dobrą tolerancję oraz wysoką skuteczność zarówno w leczeniu I linii, jak i w przypadkach opornych i nawrotowych [15,23–25]. Bardzo interesująca z punktu widzenia
klinicznego jest obserwacja, iŜ aktywność BENDA w warunkach in vitro nie zaleŜy od
stanu zmutowania genu p53 [17]. Unikalność mechanizmu działania BENDA w stosunku do innych leków stosowanych w PBL nasuwa pytanie o moŜliwości kojarzenia
jej nie tylko z lekami alkilującymi i przeciwciałami monoklonalnymi, ale takŜe z ANP.
Wpływ bendamustyny
895
Nieliczne opublikowane wyniki badań in vitro wykazały synergizm pomiędzy BENDA
i FA, natomiast interakcje pomiędzy omawianym lekiem, a 2-CdA nie były jak dotychczas przedmiotem doniesień [13, 17].
Dlatego teŜ celem przedstawionych wyŜej badań była ocena wpływu BENDA stosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu z FA i 2-CdA na Ŝywotność i apoptozę limfocytów PBL w krótkoterminowej (24 i 48 godzin) hodowli in vitro. Odsetek komórek
ulegających apoptozie oceniano uwidoczniając zjawisko eksternalizacji fosfatydyloseryny za pomocą anneksyny V, natomiast komórki obumarłe wykrywano poprzez inkorporację jodku propidyny. Zgodnie z oczekiwaniami, odsetek komórek zarówno
ulegających apoptozie, jak i martwiczych był wyŜszy w hodowlach zawierających
BENDA w stosunku do hodowli kontrolnych, tzn. bez obecności jakiegokolwiek leku
cytostatycznego. Ponadto efekt ten wykazywał zaleŜność od zastosowanego stęŜenia
leku. Zastosowana przez nas metoda badawcza nie pozwala ustalić, w jakim stopniu
zachodząca pod wpływem BENDA śmierć komórek była końcowym etapem zaleŜnej
od leku apoptozy, a w jakim katastrofy mitotycznej. Warto jednak zwrócić uwagę na
wyraźniejszy przyrost odsetka komórek martwiczych w stosunku do apoptotycznych
w miarę zwiększania stęŜenia leku w hodowli. Jest to zgodne z wiedzą na temat dualistycznego (proapoptotycznego i pronekrotycznego) mechanizmu działania BENDA
i mogłoby sugerować, Ŝe eskalacja stęŜeń wzmacnia przede wszystkim jego indukujący wpływ na katastrofę mitotyczną.
W badaniach naszych IC50 dla BENDA zastosowanej samodzielnie wynosiło średnio 72,4 µg/ml (188 µM), podczas gdy w badaniach Roue i wsp. [17] podobny efekt
uzyskano przy wartości poniŜej 100 µM. Badając interakcje BENDA z analogami puryn nie wykazaliśmy opisywanego przez innych autorów jej synergizmu z FA [13, 17].
Obliczony CI pozwala bowiem jedynie na stwierdzenie interakcji o charakterze addycji. Porównując tę obserwację z doniesieniem Roué i wsp. [17] naleŜy jednak zwrócić
uwagę, Ŝe autorzy ci prowadzili badania nad komórkami uprzednio zamroŜonymi
w środowisku DMSO. Być moŜe więc, taki sposób przechowywania limfocytów PBL,
a przede wszystkim ich zamraŜanie i rozmraŜanie, stworzyły warunki do łatwiejszej
indukcji apoptozy przez badane leki, niŜ to miało miejsce w limfocytach opracowywanych ex vivo w naszych doświadczeniach. Za taką moŜliwością mogłoby przemawiać
takŜe fakt, Ŝe porównywalny stopień utraty Ŝywotności komórek został przez cytowanych autorów osiągnięty za pomocą niŜszych stęŜeń BENDA (2–100 µM), niŜ zastosowane w naszych doświadczeniach, (1–80 µg/ml, co odpowiada 2,6–208 µM).
NaleŜy takŜe zauwaŜyć, Ŝe określając typ interakcji pomiędzy BENDA i FA Roué
i wsp. [17] oparli się na definicji zaproponowanej przez Chow i wsp. [26], w której za
działanie synergistyczne przyjmuje się CI<1. Zastosowana przez nas definicja Kristensen i wsp. [22] jest bardziej rygorystyczna i synergizmem określa CI<0,8. Przyjmując
załoŜenia Chow i wsp., uzyskany przez nas wynik dla interakcji BENDA z FA znajduje się na granicy addycji i synergizmu (CI=1,06).
Schwanen i wsp. [13] wykonywali hodowle komórek PBL w warunkach porównywalnych z naszymi i z zastosowaniem analogicznych stęŜeń badanych leków. Uzyskany przez nich odsetek komórek ulegających spontanicznej apoptozie po 24 godzi-
896 A. ZABOROWSKA i wsp.
nach inkubacji wynosił 5,6%, natomiast apoptozie indukowanej BENDA zastosowaną
w stęŜeniu 10 µg/ml po 48 godzinach hodowli wynosił 24,1%. W naszych badaniach
odsetek ten wynosił odpowiednio 10,2% i 23,6%. RóŜnice pomiędzy uzyskanymi
wynikami mogą być spowodowane faktem, iŜ do oceny apoptozy autorzy ci stosowali
7-amino-aktynomycynę D, pozwalająca wykryć jedynie komórki martwe, podczas gdy
stosowany przez nas test z uŜyciem anneksyny –V i jodku propidyny, uwzględnia
zarówno komórki apoptotyczne, jak i martwicze. MoŜe to wyjaśniać dlaczego obserwowana przez nas apoptoza spontaniczna jest wyŜsza, niŜ stwierdzona przez Schanena
i wsp. [13] przy porównywalnej apoptozie indukowanej lekiem.
Oryginalną poczynioną przez nas obserwacją był synergizm pomiędzy BENDA, a
2-CdA. PoniewaŜ obliczone przez nas IC50 dla BENDA zastosowanej w skojarzeniu z
2-CdA i FA było porównywalne i wynosiło odpowiednio 23,4 i 23,8 µg/ml (61 i 62
µM), więc róŜnica w obserwowanym typie interakcji moŜe wynikać z odrębności mechanizmów działania obu ANP. Trójfosforan 2-CdA (2-CdA-TP) ulega bowiem szybszej akumulacji w mitochondriach niŜ trójfosforan FA (FA-TP), gdyŜ w cząsteczce
2-CdA w pozycji 2 pierścienia adeninowego atom wodoru został podstawiony atomem
chloru, a to z kolei umoŜliwia bezpośrednie oddziaływanie 2-CdA na mitochondria
i być moŜe potęguje proapoptotyczne działanie BENDA. MoŜe to równieŜ wyjaśniać
dlaczego 2-CdA działa toksycznie na komórki PBL w stęŜeniu kilkunastokrotnie niŜszym niŜ FA [27]. Warto tu takŜe wspomnieć, Ŝe Robak i wsp. [28] opublikowali obserwacje, iŜ 2-CdA, podobnie jak BENDA, a w odróŜnieniu od FA, moŜe być skuteczna w przypadkach PBL z nieaktywnym genem p53.
Podsumowując, przedstawione przez nas wyniki badań nie tylko potwierdziły
wpływ BENDA na apoptozę i Ŝywotność limfocytów PBL w warunkach in vitro, ale
równieŜ wykazały synergizm tego leku z ANP, przede wszystkim z 2-CdA. Wskazuje
to na celowość dalszych badań nad charakterem i mechanizmem interakcji tych dwóch
leków w celu oceny moŜliwości ich skojarzonego zastosowania w tej chorobie, szczególnie w postaciach opornych na leki alkilujące i FA, jak równieŜ sugeruje celowość
podjęcia dalszych badań nad łącznym zastosowaniem BENDA z innymi lekami cytotoksycznymi.
Praca finansowana z grantu Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 501-11-574
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
Hallek M., Cheson B.D., Catovsky D. i wsp. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic
lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop of Chronic Lymphocytic Leukemia
updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 Guidelines. Blood 2008; 111: 54465456.
Robak T, Moissev S, Dmoszyńska A, et al. Rituximab, fludarabine and cyclophosphamide (R-FC)
prolongs progression free survival in relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL)
compared with FC alone: Final results from the international phase III REACH trial. Blood 2008;112:
Abstract 157420.
Wpływ bendamustyny
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
897
Keating MJ, O’Brien S, Lerner S i wsp.. Long-term follow-up of patients with chronic lymphocytic
leukemia (CLL) receiving fludarabine regimens as initial therapy. Blood, 1998, 92: 1165-1171
Robak T, Blonski JZ, Kasznicki M,. Cladribine with prednisone versus chlorambucil with prednisone
as first-line therapy in chronic lymphocytic leukemia: report of a prospective, randomized, multicenter trail. Blood 2000, 96: 2723-9
Korycka A, Robak T. The influence of imatinib mesylate (STI571) used alone or in combination with
purine analogues on the normal and chronic myelogenous leukemia progenitor cells in vitro. Leuk.
Lymph. 2003; 44: 1549-1555
Korycka A, Smolewski P, Robak T. The influence of farnesyl protein transferase inhibitor R115777
(Zarnestra) alone and in combination with purine nucleoside analogues on acute myeloid leukemia
progenitors in vitro. Eur J Haematol. 2004; 73: 418-426
OŜegowski W, Krebs D. IMET3393 (-[1methyl-5-bis-(β-chloroethyl)-aminobenz-imidazalyl-(2)]butyric acid hydrochloride, a new cytotoxic agent from among the series of benzimidazole mustard
compounds [in German]. Zbl. Pharm 1971; 110: 1013-1019.
Herold M, Keinert K, Anger G. i wsp. Risk-adapted combined radiotherapy and chemotherapy for
Hodgkin’s disease- results of a pilot study. Oncology 1992; 15: 502-505.
Knauf W. Bendamustine in the treatment of chronic lymphocytic leukemia . Export Rev Anticancer
Ther. 2009; 9: 165-174.
Cheson BD, Rummel MJ. Bendamustine: Rebirth of an Old Drug. J Clin Oncol. 2009; 27: No 9, str
1492-1501.
Leoni LM, Baliey B, Reifert J i wsp. Bendamustine (Treanda) displays a distinct pattern of cytotoxicity and unique mechanism features compared with other alkalating agent. Clin Cancer Res. 2008; 14:
309-317
Blumel S, Goodrich A, Martin Ch, Dang NH. Bendamustine: A novel cytotoxic agent for hematologic
malignancies. Clin J Oncol Nurs. 2008; 12: 799-806.
Schwanen C, Hecker T, Hubinger i wsp. In vitro evaluation of bendamustine induced apoptosis in Bchronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2002; 16: 2096-2105.
Bergmann MA, Goebeler ME, Herold M i wsp. Efficacy of bendamustine in patients with relapsed or
refractory chronic lymphocytic leukemia: Results of a phase I/II study of the German CLL Study
Group. Haematologica. 2005; 90: 1357-1364.
Knauf W. Bendamustibe in the treatment of chronic lymphocytic leukemia . Export Rev Anticancer
Ther. 2009; 9: 165-174.
Friedenberg JW, Cohen P, Chen L i wsp. Bendamustine in patients with rituximab-refractory and
alkylator refractory, indolent, and transformed non-Hodgkins lymphoma: Results of a phase II multicenter single-agent study. J Clin Oncol. 2008; 26: 204-210.
Roue G, Lopez-Guerra M, Milpied P i wsp. Bendamustine is effective in p53-deficient B-cell neoplasms and requires oxidative stress and caspase-independent signaling. Clin Cancer Res. 2008; 14:
6907-6915.
Rummel MJ, Al-Batran SE, Kim S.Z. i wsp. Bendamustine plus rituximab is effective and has a
favorable toxicity profile in the treatment of mantle cell and low-grade non-Hodgkin’s lymphoma. J
Clin Oncol. 2005; 23: 3383-3389.
Weide R, Hess G, Koppler H. i wsp. High anti-lymphoma activity of bendamustine/mitoxantrone/rituximab in rituximab pretreated relapsed or refractory indolent lymphomas and mantle –cell
lymphomas: A multicenter phase II study of the German Low Grade Lymphoma Study Group
(GLSG). Leuk. Lymph. 2007; 48: 1299-1306.
Darzynkiewicz Z, Bedner E, Smolewski P. In situ detection of DNA stand break in analysis of apoptosis by glow-and laser-scaning cytomery. Methods in Molecular Biology 2002; 203: 69-77.
Smolewski P, Szmigielska-Kapłon A, Cebula B. i wsp. Proapoptotic activity of alemtuzumab alone
and In combination with rituximab or purine nucleoside analogues in chronic lymphocyric leukemia.
Leuk Lymphoma 2005; 46: 87-100.
898 A. ZABOROWSKA i wsp.
22. Kristensen J, Nygren P, Lilienmark J i wsp. Interaction between cladribine (2-chlorodeoxyadenosine)
and standard antileukemic drugs in primary cultures of human tumor cells from patients with acute
myelocytic leukemia. Leukemia 1994; 8:1712-17.
23. Knauf WU, Lissitchkov T, Aldaoud A. i wsp. Bendamustine versus chlorambucil as first line treatment in B-cell chronic lymphocytic leukemia: An Update analysis from an International Phase III,
Blood 2008; 111: abstr. 2091.
24. Niederle N, Balleisen L, Heit W i wsp. Bendamustine vs fludarabine as second – line treatment for
patients with chronic lymphocytic leukemia – first interim results of a randomized study. Ann Oncol.
2008; suppl. 4, abstr. 379.
25. Weide R, Pandorf A, Heymanns J, Koppler H. Bendamustine/mitoxantrone/rituximab (BMR): a very
effective, well tolerated outpatients chemoimmunotherapy for relapsed and refractory CD20-positive
indolent malignancies. Final results of a pilot study. Leuk Lymphoma, 2004; 45: 2445-2449.
26. Chow TC Talalay p. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effect of
multiple drugs and enzyme inhibititors. Adv Enzyme Regul. 1984; 22: 27-55.
27. Genini D, Adachi S, Chao Q i wsp. Deoxyadenosine analogs induce programmed cell death in
chronic lymphocytic leukemia cells by damaging the DNA and by directly affecting the mitochondria.
Blood. 2000; 96: 3537-43.
28. Robak T, Błoński JZ, Wawrzyniak E, i wsp. Activity of cladribine combined with cyclophosphamide
in frontline therapy for chronic lymphocytic leukemia with 17p13.1/TP53 deletion: report from the
Polish Adult Leukemia Group. Cancer. 2009; 115: 94-100.
Praca wpłynęła do Redakcji 3.07.2009 r. i została zakwalifikowana do druku 2.09.2009 r.
Adres Autorów:
Klinika Hematologii UM w Łodzi
ul. Ciołkowskiego 2
93-510 Łódź