pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 2, str. 239–249
PRACA ORYGINALNA – Original Article
HALINA ANTOSZ1 JOANNA SAJEWICZ1, BARBARA MARZEC-KOTARSKA1, JANUSZ KOCKI1,
ANNA DMOSZYŃSKA2, JACEK BASZAK3, MAŁGORZATA JARGIEŁŁO-BASZAK3
Ekspresja TLR2 w limfocytach białaczki limfocytowej przewlekłej
B komórkowej
TLR2 expression in chronic lymphocytic leukemia B cells
1
Samodzielna Pracownia Genetyki Klinicznej UM w Lublinie
Kierownik: Dr hab. n. med. Janusz Kocki, prof. UM w Lublinie
2
Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji szpiku UM w Lublinie
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Anna Dmoszyńska
3
Katedra i Klinika Kardiologii UM w Lublinie
Kierownik: Prof. dr hab. Andrzej Wysokiński
STRESZCZENIE
Sygnalizacja za pośrednictwem TLR receptorów odgrywa waŜną rolę w biologii limfocytów B, indukuje dojrzewanie, proliferację i produkcję przeciwciał po rozpoznaniu patogenu, jest wymagana jako trzeci sygnał (po BCR i pomocniczych limfocytach T) do aktywacji i dalszego dojrzewania ludzkich naiwnych limfocytów B. Celem pracy było
zbadanie, czy białaczkowe i prawidłowe limfocyty B róŜnią się ekspresją powierzchniowego TLR2 i czy pod wpływem ligandów, zmienia się poziom ekspresji jego genu. Badania przeprowadzano na poziomie mRNA, metodą RTPCR w czasie rzeczywistym, w limfocytach B-PBL CD19+/CD5+ i czystych, izolowanych, prawidłowych subpopulacjach B (CD19+) i T (CD5+), przed i po indukcji SAC (Staphyloccocus aureus szczep Cowan I) i LPS (Escherichia
coli).
Porównanie ekspresji TLR2 w prawidłowych limfocytach B CD19+ i białaczkowych limfocytach B CD19+/CD5+
wykazało blisko 2,5-krotnie niŜszą ekspresję mRNA genu TLR2 w komórkach białaczkowych oraz 2,65 razy wyŜszą
ekspresję TLR2 w prawidłowych limfocytach T, w porównaniu z ekspresją w prawidłowych limfocytach B. Analiza
efektywności indukcji poprzez SAC i LPS była porównywalna i nie ujawniła znaczących róŜnic we wzroście aktywności genu TLR2. W przypadku stymulacji LPS-em limfocytów B prawidłowych stwierdzono 1,65-krotny wzrost
ekspresji TLR2, natomiast w białaczkowych 1,54. Stymulacja SAC wykazała podobną skuteczność. Limfocyty B
prawidłowe odpowiedziały wzrostem ekspresji na poziomie 1,43, natomiast białaczkowe 1,39. Porównawcza analiza
ekspresji mRNA TLR2 w prawidłowych limfocytach T wykazała niemalŜe identyczne wzrosty tj. 1,325 i 1,345 po
indukcji odpowiednio LPS i SAC.
SŁOWA KLUCZOWE: B-PBL, TLR2
SUMMARY
TLR mediated signaling plays essential role in biology of B lymphocytes. It is involved in maturation, proliferation
and antibody production after pathogen recognition. It is considered as the third signal (after BCR and T helper lymphocytes) required for activation and subsequent maturation of human naive B lymphocyte. The aim of our study was
to elucidate the differences in surface TLR2 expression between normal and B-CLL B lymphocytes, before and after
ligand recognition. TLR2 expression was assessed on mRNA level (by means of Real-Time PCR method) in
CD19+/CD5+ B-CLL lymphocytes and isolated subpopulation of normal B (CD19+) and T (CD5+) lymphocytes, before and after SAC (Staphyloccocus aureus Cowan I) and LPS (Escherichia coli) induction.
The assessment of TLR2 expression in CD19 normal B lymphocytes and CD19/CD5 B-CLL lymphocytes showed
nearly 2,5 fold decrease and 2,65 fold increase of TLR2 mRNA level respectively in B-CLL cells and normal T lymphocytes comparing to normal B lymphocytes. The efficacy of SAC and LPS mediated induction of TLR2 was comparable and did not reveal significant differences in the increase of gene activity. We noticed respectively 1,65 and
1,54 fold increase in TLR2 expression in normal B lymphocytes and B-CLL cells after LPS stimulation. The effectiveness of SAC stimulation was at the same level either in B normal lymphocytes and B-CLL cells (respectively 1,43
240
H. ANTOSZ i wsp.
and 1,39 fold increase). TLR2 mRNA expression in normal T lymphocytes after LPS and SAC induction increased
similarly (respectively 1,325 and 1,345 fold).
KEY WORDS: B-CLL, TLR2
WSTĘP
Przewlekła białaczka limfocytowa B komórkowa (B-PBL) jest jednym z częściej występujących
nowotworów hematologicznych. Dotyczy najczęściej ludzi po 50 roku Ŝycia i charakteryzuje się niezwykle róŜnorodnym przebiegiem klinicznym. B-PBL obecnie postrzegana jest jako choroba akumulacyjna wywodząca się ze stymulowanych, antygenowo dojrzałych limfocytów B, które nie są eliminowane przez apoptozę, lecz uzupełniane przez proliferację komórek prekursorowych. Przypuszcza się, Ŝe
proliferacja miałaby być indukowana przez sygnały przeŜycia docierające ze środowiska zewnętrznego
i przekazywane za pośrednictwem róŜnych receptorów (np. receptora komórki B, receptory chemokinowe i cytokinowe) i ich ligandów [1]. Antygeny indukujące nie są znane, ale nie wyklucza się, Ŝe klonalną ekspansję mogą prowokować latentne wirusy, bakterie, pewne antygeny środowiskowe lub autoantygeny [2–5].
W defensywie przeciwko patogenom istotną rolę pełni sygnalizacja za pośrednictwem receptorów
Toll-podobnych (TLR). Ekspresję tych receptorów wykazują komórki systemu wrodzonej, nieswoistej
odporności. Rozpoznają one wzorce molekularne charakterystyczne dla określonego rodzaju patogenu
(PAMP – Pahtogen-Associated Molecular Patterns) i następnie inicjują aktywację odporności swoistej
poprzez limfocyty B i T [6–7].
Sygnalizacja za pośrednictwem TLR odgrywa waŜną rolę w biologii limfocytów B, indukuje dojrzewanie, proliferację i produkcję przeciwciał po rozpoznaniu patogenu [8]. Reprecht CR i Lanzavecchia A [9] wykazali, Ŝe stymulacja za pośrednictwem TLR jest wymagana jako trzeci sygnał (po BCR
i pomocniczych limfocytach T), do aktywacji ludzkich naiwnych limfocytów B. Komórki naiwne wykazują niski poziom ekspresji TLR, ale ich ekspresja jest indukowana poprzez receptor B-komórkowy,
stąd w limfocytach B pamięci poziom ekspresji kilku receptorów TLR jest stale wysoki.
Obecnie znanych jest 10 ludzkich TLR [10]. Występują głównie w obrębie błony komórkowej
(TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10) oraz w błonie pęcherzyków cytoplazmatycznych (TLR3,
TLR7, TLR8, TLR9) [11]. Sygnalizacja poprzez TLR jest inicjowana przez domeny Toll/IL-1 (TIR),
które mogą oddziaływać z cytoplazmatycznymi białkami adaptorowymi MyD88, TIRAP/MAL i TRIF.
Sygnalizacyjna droga aktywacji za pośrednictwem TIR skutkuje albo aktywacją czynnika transkrypcyjnego NFκB i w konsekwencji produkcją cytokin prozapalnych, chemokin, cząsteczek defensywnych
i białek inaktywujących mikroby lub aktywacją białkowych kinaz, aktywowanych miogenem tj. p38
i JNK [12–13].
W większości ligandy PAMP receptorów Toll-podobnych zostały zidentyfikowane. Dla receptora
TLR2 ligandami są m.in. bakteryjne lipoproteidy (pochodzące z Treponema, Mycoplasma, Borella),
peptydoglikan, lipoarabinomannam (Mycobacterium), kwas lipotejchojowy (bakterie Gram-dodatnie),
poryny (Neisseria sp.). Heterodimer utworzony z TLR2 i TLR6 rozpoznaje lipopeptydy mykoplazm
(zawierające dwie reszty kwasów tłuszczowych) i składniki ściany komórkowej grzybów – zymosan.
TLR2 wspólnie z TLR1 wiąŜe lipopeptydy bakteryjne (zawierające trzy reszty kwasów tłuszczowych)
[14–15].
Biorąc pod uwagę fakt, Ŝe większość limfocytów B-PBL, charakteryzuje ten sam immunofenotyp
jak ich prawidłowe odpowiedniki, badanie ekspresji receptorów Toll-podobnych i funkcjonalne konsekwencje ich stymulacji, jest bardzo interesujące. Istnieją doniesienia, Ŝe stymulacja limfocytów B-PBL
poprzez TLR skutkuje kompleksowymi zmianami, waŜnymi dla biologii limfocytów B-PBL, tj. efektem przeciwnowotworowym jaki i efektem promującym rozwój tego nowotworu [16].
Ekspresja TLR2 w limfocytach B-PBL
241
Celem pracy było zbadanie czy białaczkowe i prawidłowe limfocyty B róŜnią się ekspresją powierzchniowego TLR2 i czy pod wpływem ligandów zmienia się poziom ekspresji jego genu. Badania przeprowadzano na poziomie mRNA TLR2, metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym, w limfocytach B-PBL CD19+/CD5+ i czystych, izolowanych, prawidłowych subpopulacjach B (CD19+) i T
(CD5+), przed i po indukcji SAC (Staphyloccocus aureus szczep Cowan I) i LPS (lipopolisacharyd
Escherichia coli).
MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiły limfocyty krwi obwodowej 20 chorych na przewlekłą białaczkę B limfocytową (B-PBL). Diagnozę przeprowadzono w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku
Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. W okresie poprzedzającym badanie Ŝaden z chorych nie był
leczony. Grupa badawcza obejmowała 8 kobiet i 12 męŜczyzn w wieku od 55–83 lat (mediana: 68).
Stopień zaawansowania choroby był róŜny u poszczególnych chorych i obejmował stadia 0,1,2,4
wg charakterystyki Rai’a [17]. Grupę kontrolną (15 osób) stanowili pacjenci Kliniki Kardiologii UM
w Lublinie, wiekowo odpowiedni, hospitalizowani z powodu nadciśnienia tętniczego.
Izolacja limfocytów krwi obwodowej
Krew pobierano na 3,8% cytrynian sodu a następnie izolowano limfocyty przez wirowanie w gradiencie gęstości limphoprepu, zmodyfikowaną metodą Böyum’a [18].
Manualna technika selekcji pozytywnej i ocena immunofenotypu limfocytów
Limfocyty grupy kontrolnej rozdzielano na subpopulacje CD19+ i CD5+ w separatorze magnetycznym (MiniMACS Separator, Miltenyi Biotec) w celu uzyskania subpopulacji o czystości około 95%.
Pomiaru liczby komórek, czystości preparatu oraz ekspresji powierzchniowego receptora TLR2, dokonywano przy pomocy cytometrii przepływowej (FACS Calibur, Becton Dickinson).
Izolacja RNA
Izolacji RNA dokonywano zmodyfikowaną metodą Chomczyńskiego [19].
Synteza cDNA
Syntezę cDNA przeprowadzano przy uŜyciu zestawu odczynników High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (AppliedBiosystems), zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta.
Badanie ekspresji genu TLR2 metodą PCR w czasie rzeczywistym
Uzyskane po odwrotnej transkrypcji próby cDNA amplifikowano w czasie rzeczywistym przy uŜyciu
techniki półilościowej analizy ekspresji w czasie rzeczywistym-Real Time PCR. Procedurę PCR wykonano
w aparacie 7300 Real-Time System firmy Applied Biosystems, z wykorzystaniem oprogramowania SDS.
Mieszanina reakcyjna zawierała: 1,25 µl mieszaniny sondy i starterów specyficznych dla badanych
genów (Applied Biosystems), 12,5 µl buforu TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems),
10,25 µl H2O oraz 1 µl cDNA. Reakcję prowadzono na płytce optycznej w objętości 25 µl. Zastosowano
następujące zestawy sond typu TaqMan znakowanych FAM-NFQ i starterów dla genu TLR2 oraz GAPDH
jako genu referencyjnego (Applied Biosystems). Warunki reakcji: denaturacja wstępna 95°C 10 minut, 40
cykli: 95°C 15s, 60°C 60s. Ilość kopii cząsteczek badanych genów kwasu nukleinowego była monitorowa-
242
H. ANTOSZ i wsp.
na w kaŜdym cyklu reakcji amplifikacji. Ilość cykli reakcji PCR, po których poziom fluorescencji przekroczył zdefiniowany próg (tCT) była stosowana do obliczenia ilości badanych cząsteczek obecnych w mieszaninie na początku reakcji (analiza przy uŜyciu oprogramowania RQ Study – ang. Relative Quantification; AppliedBiosystems). Dla kaŜdej próby wartość CT dla genu referencyjnego GAPDH była uŜyta do normalizacji
ekspresji badanych genów. Poziomy ekspresji badanych genów (∆CT) wyznaczono według wzoru:
∆CT genu= CT genu- CT GAPDH.
Ekspresję względną (RQ) badanych genów oznaczono wg wzoru:
RQ= 2-(∆CT genu - ∆CT kalibratora) gdzie: ∆CT kalibratora = CT genu kalibratora - CT GAPDH kalibratora.
WYNIKI
Ocena immunofenotypu limfocytów badanych chorych
U 20 chorych z rozpoznaniem przewlekłej białaczki limfocytowej wykonano badanie immunofenotypowe antygenów powierzchni komórki, charakterystycznych dla limfocytów B-PBL, metodą cytometrii przepływowej. Odsetek komórek CD5+/CD19+ wynosił 80,67±12,04%. Subpopulację tę przyjęto
traktować jako białaczkową (Rycina 1).
R2
Ryc. 1. Immunofenotyp powierzchni limfocytów B-PBL
Fig. 1. Immunophenotype of B-CLL lymphocytes surface
Grupę porównawczą stanowiła czysta subpopulacja limfocytów B zdrowych dawców. Za kryterium
czystości przyjęto ekspresję antygenu CD19 na powierzchni limfocytów B. Kontrolę czystości przeprowadzono w cytometrze przepływowym. Odsetek subpopulacji B w kaŜdej z badanych, kontrolnych
prób przekraczał 94% (Rycina 2).
Ekspresja TLR2 w limfocytach B-PBL
243
Ryc. 2. Ocena czystości prawidłowej subpopulacji limfocytów B (CD19+)
Fig. 2. Purity evaluation of normal B lymphocytes subpopulation (CD19+)
A)
B)
Ryc. 3. Ekspresja TLR2 na powierzchni limfocytów B-PBL (A) i prawidłowych limfocytów B CD19+ (B)
Fig. 3. TLR2 expression on B-CLL cells (A) and normal B lymphocytes CD19+ (B)
TLR2
TLR2
10
5
4
8
3
6
2
4
1
2
0
0
-1
Średnia
Średnia±Odch.std
Średnia±1,96*Odch.std
-2
B-PBL
A)
Średnia
Średnia±Odch.std
Średnia±1,96*Odch.std
-2
B
B
T
B)
Ryc. 4. Ekspresja TLR2 w limfocytach B-PBL i prawidłowych limfocytach B (A), ekspresja TLR2 w prawidłowych limfocytach B i T (B)
Fig. 4. TLR2 expression in B-CLL and normal B lymphocytes (A), TLR2 expression in normal B and T lymphocytes (B)
H. ANTOSZ i wsp.
244
Tabela 1. Porównanie ekspresji TLR2 w prawidłowych i białaczkowych limfocytach B
Table 1. Comparison of TLR2 expression in normal and B-CLL lymphocytes
TLR2
2,4848212 (p=0,025659)
B/B-PBL
2,6590096 (p=0,003351)
T/B
Porównanie ekspresji TLR2 w prawidłowych limfocytach B CD19+ i białaczkowych limfocytach
B CD19+/CD5+ wykazało blisko 2,5-krotnie niŜszą ekspresję mRNA genu TLR2 w komórkach białaczkowych oraz 2,65 razy wyŜszą ekspresję TLR2 w prawidłowych limfocytach T, w porównaniu
z ekspresją w prawidłowych limfocytach B (Rycina 4, Tabela 1). Analiza efektywności indukcji poprzez SAC i LPS była porównywalna i nie ujawniła znaczących róŜnic we wzroście aktywności genu
TLR2. W przypadku stymulacji LPS-em limfocytów B prawidłowych stwierdzono 1,65-krotny
wzrost ekspresji TLR2, natomiast w białaczkowych 1,54. Stymulacja SAC wykazała podobną skuteczność. Limfocyty B prawidłowe odpowiedziały wzrostem ekspresji na poziomie 1,43, natomiast
białaczkowe 1,39. Porównawcza analiza ekspresji mRNA TLR2 w prawidłowych limfocytach T wykazała niemalŜe identyczne wzrosty tj. 1,325 i 1,345 po indukcji odpowiednio LPS i SAC (Tabela 2,
Rycina 5–6).
Tabela 2. Porównanie ekspresji TLR2 w prawidłowych i białaczkowych limfocytach B po indukcji LPS i SAC
Table 2. Comparison of TLR2 expression in normal and B-CLL lymphocytes after LPS and SAC induction
TLR2
B-PBL
B
T
LPS
1,549958 (p=0,092803)
1,6101101
(p=0,164703)
1,3250967
(p=0,217874)
SAC
1,3934095
(p=0,382530)
1,4316396
(p=0,331758)
1,3456935
(p=0,141662)
Analiza porównawcza skuteczności indukcji LPS i SAC ekspresji TLR2 udowodniła, Ŝe jeśli chodzi
o ten parametr, limfocyty B-PBL wykazują równieŜ znaczną heterogenność. Limfocyty chorych nr 5, 8,
9 nie reagowały zwiększeniem ekspresji TLR2 po stymulacji LPS i SAC, podczas gdy u chorego nr 13
zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji TLR2 zarówno po stymulacji LPS i SAC, natomiast u chorego nr 11 znaczny wzrost jedynie po stymulacji LPS (Rycina 7).
Ekspresja TLR2 w limfocytach B-PBL
TLR2
245
TLR2
2,5
1,8
1,6
2,0
1,4
1,2
1,5
1,0
1,0
0,8
0,6
0,5
0,4
0,0
0,2
0,0
-0,5
Średnia
Średnia±Odch.std
Średnia±1,96*Odch.std
-1,0
B-PBL
-0,2
Średnia
Średnia±Odch.std
Średnia±1,96*Odch.std
-0,4
B-PBL LPS
B-PBL
A)
B-PBL SAC
B)
Ryc. 5. Wpływ indukcji LPS (A) i SAC (B) na ekspresję TLR2 w limfocytach B-PBL
Fig. 5. Influence of LPS (A) and SAC (B) induction on TLR2 expression in B-CLL lymphocytes
TLR2
TLR2
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
-1
-1
Średnia
Średnia±Odch.std
Średnia±1,96*Odch.std
-2
B
A)
B LPS
Średnia
Średnia±Odch.std
Średnia±1,96*Odch.std
-2
B
B SAC
B)
Ryc. 6. Wpływ indukcji LPS (A) i SAC (B) ekspresji TLR2 w prawidłowych limfocytach B
Fig. 6. Influence of LPS (A) and SAC (B) induction on TLR2 expression in normal
B lymphocytes
H. ANTOSZ i wsp.
246
TLR2
TLR2
12
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
Średnia
Średnia±Odch.std
Średnia±1,96*Odch.std
-2
T
Średnia
Średnia±Odch.std
Średnia±1,96*Odch.std
-2
T LPS
T
A)
T SAC
B)
Ryc. 7. Wpływ indukcji LPS (A) i SAC (B) na ekspresję TLR2 w prawidłowych limfocytach T
Fig. 7. Influence of LPS (A) and SAC (B) induction on TLR2 expression in normal
T lymphocytes
3,5
TLR2
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1
2
3
4
5
B-PBL
6
7
8
B-PBL+LPS
9
10
11
12
13
14
B-PBL +SAC
Ryc. 8. Wpływ indukcji LPS i SAC na ekspresję TLR2 w grupie 14 chorych na B-PBL
Fig. 8. Influence of LPS (A) and SAC (B) induction on TLR2 expression in group of 14 B-CLL patients
DYSKUSJA
Klasyfikacja B-PBL, morfologia, jak równieŜ immunofenotyp jest juŜ w większym stopniu opisany
w tej chorobie. Są nowe sugestie, Ŝe stymulacja antygenowa razem z interakcją z dodatkowymi komórkami i cytokinami jest czynnikiem promocyjnym, który stymuluje proliferację komórek CLL pozwalając im unikać apoptozy. Efekt moŜe być róŜny w odrębnych podgrupach CLL i tym samym prowadzi
do róŜnic w przebiegu klinicznym wśród indywidualnych przypadków. Etiologia choroby jednak nadal
Ekspresja TLR2 w limfocytach B-PBL
247
pozostaje nieznana. W obrazie klinicznym B-PBL na plan pierwszy wysuwają się zaburzenia odporności, prowadzące często do cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych i wirusowych, które są przyczyną około 60%
zgonów.
Pod koniec lat dziewięćdziesiątych ubiegłego stulecia okazało się, Ŝe organizmy wirulentne mają
stałe i konserwatywne ewolucyjnie wzorce antygenowe, które są często wspólne dla róŜnych patogenów [20–21]. Organizmy eukariotyczne wykrywają te cząsteczki, dzięki wytworzonym receptorom
PRR (Pattern Recognition Receptors), wśród których duŜe znaczenie mają TLR. Receptory te umoŜliwiają rozpoznanie patogenu i są w stanie prowadzić do wzbudzenia odpowiedzi swoistej, indukując
jednocześnie zmiany w ekspresji cząsteczek ko-stymulujących tj. CD40, CD54, CD80, CD86 i MHC
kl. I i II, niezbędnych w efektywnej odpowiedzi immunologicznej [22–23].
Niestety dotychczas nie ma kompleksowych badań ekspresji i funkcji TLR2 w limfocytach B
w B-PBL. Nie wiadomo dokładnie, jaki efekt na biologię limfocytu B wywiera angaŜowanie TLR2.
Prowadzona przez nas analiza porównawcza pomiędzy prawidłowymi subpopulacjami limfocytów B
i T a komórkami B-PBL wykazała obniŜoną ekspresję genu TLR2 na poziomie mRNA w limfocytach
chorych na B-PBL. MoŜna zatem spekulować, Ŝe jedną z przyczyn niedoborów immunologicznych
w B-PBL moŜe być zbyt niska ekspresja tego receptora by efektywnie uaktywnić niezbędne czynniki
ko-stymulujące. Potwierdzeniem tej tezy byłyby doniesienia Chiron D. i wsp. [24], Ŝe w B-PBL ligandy TLR2 nie indukują zmian w ekspresji cząsteczek ko-stymulujących. Fakt ten musi pociągać za
sobą zaburzenia kooperacji limfocytów B i T, niezbędnej w odpowiedzi humoralnej.
Nasze badania wykazały, Ŝe ekspresja TLR2 w prawidłowych limfocytach T jest 2,6 razy wyŜsza
w porównaniu z limfocytami B prawidłowymi. Wprawdzie nie analizowaliśmy ekspresji TLR2 w poszczególnych subpopulacjach limfocytów T, to jednak wysoka totalna ekspresja dowodzi istotnego
znaczenia TLR2 w odpowiedzi immunologicznej.
Nie bez znaczenia jest więc fakt zaburzonego stosunku limfocytów B/T, odwrócenia proporcji
subpopulacji CD4+/CD8+ oraz zwiększonego odsetka komórek T regulatorowych (Treg) u chorych na
PBL-B.
Są doniesienia, Ŝe stymulacja receptorów TLR2 pod wpływem PAMP grzyba Candida albicans
wywołuje stan immunosupresji w wyniku nasilenia uwalniania IL-10 oraz zwiększenia przeŜywalności
komórek Treg(CD4+/CD25+) [25].
Inne badania wykazały, Ŝe patogeny wewnątrzkomórkowe i grzyby wykorzystują szlaki przekaźnictwa sygnału TLR2 w celu zahamowania odpowiedzi typu Th1 i przesunięcia równowagi w kierunku
odpowiedzi typu Th2, co potwierdza w/w rolę TLR2 w indukcji odpowiedzi typu humoralnego [26].
MoŜe dziwić zbliŜony wzrost ekspresji genu TLR2 po stymulacji SAC i LPS zarówno w limfocytach B białaczkowych jak i prawidłowych limfocytach B i T. LPS E.coli jest głównie ligandem TLR4,
w związku z tym moŜna by oczekiwać, Ŝe będzie miał mniejszy wpływ na ekspresję TLR2. Są jednak
doniesienia, Ŝe LPS wyizolowany z. Porphyromonas gingivalis działa niezaleŜnie od receptora TLR4
i stymuluje TLR2 prowadząc do odpowiedzi immunologicznej [27].
Podobny wzrost ekspresji TLR2 moŜna tłumaczyć porównywalną siłą stymulacyjną PAMP pochodzących ze Staphyloccocus aureus i Escherichia coli. PAMP róŜnych mikroorganizmów mogą, ale nie
muszą wykazywać odmienne właściwości stymulacji TLR. Inne bardziej prawdopodobne wyjaśnienie
sugeruje, Ŝe wpływ ligandów na ekspresję genów ich receptorów jest niewielki, a aktywacja dotyczy
genów molekuł ko-stymulacyjnych i sekrecji odpowiednich cytokin i chemokin. Bez odpowiedzi, jak
na razie pozostaje pytanie, dlaczego ekspresja genu TLR2 na poziomie mRNA jest blisko 2,5 razy niŜsza w limfocytach B-PBL.
ObniŜona ekspresja TLR2 w limfocytach białaczkowych moŜe tłumaczyć istnienie upośledzenia
nadzoru immunologicznego w B-PBL, skutkujące przeciwdziałaniem w usuwaniu pewnych antygenów,
co moŜe bezpośrednio nasilać stymulację i selekcję wybranych klonów komórkowych prowadząc do
transformacji nowotworowej.
248
H. ANTOSZ i wsp.
1. Praca była finansowana z grantu KBN nr NN 402440639
2. Praca powstała z wykorzystaniem sprzętu zakupionego w ramach Projektu: ,,WyposaŜenie
innowacyjnych laboratoriów prowadzących badania nad nowymi lekami stosowanymi w terapii chorób cywilizacyjnych i nowotworowych” w ramach Programu Operacyjnego Rozwój
Polski Wschodniej 2007–2013, Osi priorytetowej I Nowoczesna Gospodarka, Działania I.3
Wspieranie Innowacji.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M. Mechanisms of disease: Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2005; 352: 804815.
Broker BM, Klajman A, Youinou P i wsp. Chronic lymphocytic leukemic (CLL) cells secrete multispecific autoantibodies. J Autoimmun 1988; 1: 469-481.
Sthoeger ZM, Wakai M, Tse DB i wsp. Production of autoantibodies by CD5-expressing B lymphocytic leukemia. J Exp
Med 1989; 169: 255-268.
Borche L, Lim A, Binet JL, Dighiero G. Evidence that chronic lymphocytic leukemia B lymphocytes are frequently committed to production of natural autoantibodies. Blood 1990; 76: 562-569.
Schwartz RS, Stollar BD, Heavy-chain directed B-cell maturation: continuous clonal selection beginning at the pre-B cell
stage. Immunol Today 1994; 15: 27-32.
Akira S. Mammalian toll-like receptors. Curr. Opin. Immunol. 2003; 15: 5-11.
Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signaling. Nat Rev Immunol 2004; 4: 499-511.
Hayashi EA, Akira S, Nobrega A. Role of TLR in B cell development: signalling through TLR4 promotes B cell maturation and is inhibited by TLR2. J Immunol 2005; 174: 6639-6647.
Reprecht CR, Lanzavecchia A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B
cells. Eur J Immunol 2006; 36: 810-816.
Beutler B, Hebe K, Du X, Ulevitch RJ. How we detect microbes and respond to them: Toll-like receptors and their transducers. J Leukoc Biol 2003; 74: 479-485.
Nishiya T, DeFranco AL. Ligand regulated chimeric receptor approach reveals distinctive subcellular localization and
signalling properties of the Toll-like receptors. J Biol Chem 2004; 279: 19008-19017.
Iwaszki A, Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune response. Nat Immunol 2004; 5: 987-995.
Underhill DM, Ozinsky A. Toll like receptors: key madiators of microbe detection. Curr Opin Immunol 2002; 14: 103110.
Kaisho T, Akira S. Toll-like receptor function and signalling. J Allergy Clin Immunol 2006; 117: 979-987.
Kawai T, Akira S. Pathogen recognition with Toll-like receptors. Curr Opin Immunol 2005; 17: 338-344.
Rožkowá D, Novotná L, Pytlík R i wsp. Toll- like receptors on B CLL cells: expression and function consequences of
their stimulation. Int J Cancer 2010; 126: 1132-1143.
Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 46: 219-34.
Böyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one
centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Supplement, 1968; 97: 77-89.
Chomczyński P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform
extraction. Anal Biochem 1987; 162, 156-159.
Hopkins PA, Scriskandan S.Mammalian Toll-like receptors: to immunity and beyond. Clin Exp Immunol 2005; 140:
395-407.
Martin M, Rehani K, Jope RS, Mchalek SM. Toll-like receptor mediated cytokine production is differentially regulated by
glycogen synthase kinase 3. Nat Immunol 2005; 6: 777-784.
Albigier B, Dahlberg S, Henriques-Normark B, Normark S. Role of the innate immune system in host defense against
bacterial infections: fokus on the Toll-like receptors. J Intern Med 2007; 261: 511- 528.
Spaner DE, Shi Y, White D i wsp. Immunomodulatory effects of Toll-like receptor 7 activation on chronic lymphocytic
leukemia cells. Leukemia 2006; 20: 286-295.
Chiron D, Bekeredjian-Ding I, Pellat-DeceunynckC, Bataille R, Jego G. Toll-like receptors: lessons to learn from norma
land malignant human B cells. Blood 2008; 112: 2205-2213.
Ekspresja TLR2 w limfocytach B-PBL
249
25. Netea MG, Sutmuller R, Hermann C i wsp. Toll-like receptor 2 suppresses immunity against Candida albicans through
induction of IL-10 and regulatory T cells. J Immunol 2004; 172: 3712-3718.
26. Netea MG, van der G raaf CA, van der Meer JW, Kullberg BJ. Toll-like receptors and the host defense against microbial
pathogens: bringing specificity to the innate-immune system. J Leukoc Biol 2004; 75: 749-755.
27. Pulendran B, Kumar P, Cutler ChW, Mohamadzadeh M, Van Dyke T. Banchereau J. Lipopolysaccharides from Distinct
Pathogens Induce Different Classes of Immune Responses In Vivo. J Immol 2001; 167: 5067-5076.
Praca wpłynęła do Redakcji 20.06.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 29.06.2011 r.
Adres do korespondencji:
Dr hab. n. med. Halina Antosz
Samodzielna Pracownia Genetyki Klinicznej UM w Lublinie
20-950 Lublin
ul. Radziwiłłowska 11