Pobierz opis

Marta Rusek
Ul. Medalionów 6/89
20-486 Lublin
tel. 48 667-195-153
e-mail: [email protected]
Uniwersytet Medyczny
II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym
Katedra i Zakład Patofizjologii
Badania doświadczalne na temat N-homocysteinylacji białek
i mechanizmów przeciwdziałających temu procesowi.
Od wielu lat homocysteina (Hcy) jest przedmiotem intensywnych badań ze względu na
pozytywną korelację z występowaniem różnych stanów patologicznych. Badania kliniczne
pokazują, że podwyższony poziom Hcy we krwi (>15 M) jest niezależnym czynnikiem
ryzyka rozwoju miażdżycy, choroby niedokrwiennej serca, chorób zakrzepowo-zatorowych,
udaru mózgu oraz chorób neurodegeneracyjnych.
Dotychczasowe badania nad metabolizmem Hcy sugerują, że jeden z jej metabolitów,
tiolakton homocysteiny (HTL) jest wysoce reaktywny, który w niskich stężeniach, rzędu 10
nM, spontanicznie tworzy wiązanie amidowe z grupą ε-aminową reszt lizyny w białku
(N-homocysteinylacja). Wykazano, że różne białka osocza ulegają modyfikacji przez HTL,
zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. N-homocysteinylowane białka występują
powszechnie w organizmach ludzi i zwierząt. W patofizjologii chorób człowieka wykazano,
że HTL powoduje powoduje: upośledzenie/inaktywacje funkcji tych białek, aktywację
szlaków immunologicznych prowadzących do syntezy przeciwciał przeciw N-Hcy-białkom,
agregację N-Hcy-fibrynogenu w zakrzepicy oraz zaostrzenie stanu zapalnego naczyń
krwionośnych.
Choroby serca, miażdżyca i osteoporoza to powszechne schorzenia, które występują
w starzejących się populacjach. W ostatnich latach wykazuje się istnienie związku między
obiema chorobami, gdyż mają szereg wspólnych czynników dla ich powstawania. Należą do
nich: hiperlipidemia, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca, menopauza u kobiet, stres oksydacyjny,
proces zapalny oraz hiperhomocysteinemia. Leki hipolipemiczne, tj. statyny hamują rozwój
miażdżycy, ale także stymulują procesy tworzenia tkanki kostnej. Natomiast leki stosowane
w leczeniu osteoporozy tj. bisfosfoniany mają wpływ na stężenie cholesterolu i hamują rozwój
płytki miażdżycowej. Okazuje się, że czynniki zwiększające ryzyko rozwoju miażdżycy
i choroby niedokrwiennej serca wywierają istotny wpływ na procesy przebudowy tkanki kostnej
i rozwój osteoporozy. Ponadto stosowanie obu grup leków jest długotrwałe i może powodować
skutki uboczne dla całego organizmu. Obecnie coraz częściej wskazuje się na próby
kompleksowej profilaktyki i leczenia obu schorzeń.
Celem pracy jest wykazanie znaczenia homocysteiny w procesach N-homocysteinylacji
białek oraz w patogenezie zmian miażdżycowych i zakrzepowych oraz zbadanie wpływu
stosowania bisfosfonianów na proces rozwoju i leczenie chorób układu krążenia, szczególnie
hiperlipidemii oraz biochemiczna ocena dynamiki wczesnych i długoterminowych zmian przy
długotrwałym stosowaniu tych preparatów.
Pierwsza część pracy dotyczy toksyczności Hcy oraz N-homocysteinylacji kolagenu,
głównego białka tkanki łącznej, występującego mi.in w ścięgnach, kościach, skórze,
chrząstkach stawowych,. Uważa się, że mechanizm patogennego działania Hcy na układ
sercowo-naczyniowy wiąże się z bezpośrednim cytotoksycznym wpływem na komórki
śródbłonka naczyniowego, co może upośledzać syntezę DNA komórki, hamować jej wzrost
i procesy naprawcze. Ponadto nadmiar Hcy pobudza proliferację mięśni gładkich naczyń,
zwiększa produkcję i gromadzenie kolagenu w ścianie naczynia. Dodatkowo HTL powoduje
potranslacyjną modyfikację kolagenu. Materiał badawczy stanowią mysie modele zwierzęce
z nokautem genu dla syntazy β-cystationinowej. Do oznaczenia poziomu tHcy, S-Hcy oraz NHcy w ekstraktach kolagenu stosuje się metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej
(HPLC).
Z kolei druga część pracy obejmuje badanie wpływu leków stosowanych w terapii
osteoporozy (bisfosfonianów) na proces rozwoju i leczenie chorób układu krążenia, szczególnie
hiperlipidemii oraz ocenę biochemiczną dynamiki wczesnych i długoterminowych zmian przy
ciągłym stosowaniu tych preparatów. W wielu badaniach epidemiologicznych udokumentowano
istnienie związku pomiędzy stosowaniem tych preparatów, a występowaniem chorób
zakrzepowo-zatorowych, choroby niedokrwiennej serca i udaru mózgowego. Wskazuje na to
relacja między poziomem Hcy, a układem naczyniowo-sercowym i kostnym. Istotą
promiażdżycowego działania Hcy jest jej wpływ na śródbłonek naczyń tętniczych i generowanie
procesów oksydacyjnych i zapalnych. Jako aminokwas o kwaśnym odczynie wpływa hamująco
na remodeling kości. Bisfosfoniany są stabilnymi analogami pirofosfonianu. Mechanizm ich
działania nie jest do końca poznany, ale polega prawdopodobnie na hamowaniu migracji
i adhezji osteoklastów do struktur tkanki kostnej oraz hamowaniu proliferacji komórek
prekursorowych osteoklastów. Ponadto bisfosfoniany hamują adhezję komórek nowotworowych
i w wyniku tego zmniejszają uwarunkowaną nowotworem osteolizę oraz hiperkalcemię. Leki te
działają drogą niereceptorową przez endocytozę (w czasie degradacji i resorpcji składników
macierzy kostnej). Obecnie stosowane bisfosfoniany należą do dwóch grup: 1) bisfosfoniany
proste o krótkim łańcuchu bocznym, bezazotowe (np. etydronian, tiludronian, klodronian); 2)
bisfosfoniany złożone, o długim łańcuchu bocznym – aminobisfosfoniany (zawierające jeden lub
więcej atomów azotu), np. alendronian, risedronian, ibandronian, zoledronian, pamidronian. Na
podstawie badań klinicznych w Polsce zostały zarejestrowane leki zawierające: etydronian sodu,
alendronian sodu, risedronian sodu, ibandronian sodu oraz zoledronian sodu.
W pracy zostaną wykorzystane dwa modele zwierzęce: osobniki szczurów zdrowych oraz
osobniki z hiperlipidemią, którym zostaną podane preparaty najczęściej stosowane u ludzi
w odpowiednio mniejszych dawkach.
Substancja czynna
Nazwa handlowa preparatu/
Wytwórca
Etydronian sodu
Difosfen/
Ostedron/
Klodronian sodu
Bonefos/Schering AG
Alendronian sodu
Fosamax/MERCK
Rekostin/Biofarm Sp. z.o.o.
Ostenil/Teva Kutno S.A.
Ostolek/LEK-AM Sp. z.o.o.
Ostemax/Polpharma
Risedronian sodu
Actonel/Sanofi-Aventis
Ibandronian sodu
Bonviva/Roche
Kwas
zolendronowy
Aclasta/Novartis
Zometa/
Dawkowanie
400 mg/doba przez 2 tygodnie,
potem 76 dni przerwy, podczas
której podaje się wapń i witaminę
D3
1600 mg/doba
(3 mg/kg mc. raz na tydzień u
szczurów)
10 mg/doba lub 70 mg/raz na
tydzień
(0,1 mg/kg mc./doba lub 1 mg/kg
mc./doba u szczurów)
5 mg/doba lub 35 mg/raz na
tydzień
2,5 mg/doba lub 150 mg/raz na
miesiąc
(1
µg/dzień;
0,05
mg/kg
mc./doba u szczurów)
5 mg/raz na rok
(0,2-5 µg/ dzień; 120 µg/kg
mc./dwa razy w tygodniu)
Istotne jest bowiem poznanie nie tylko bisfosfonianów, ale również wykazanie
ewentualnych różnic pomiędzy rożnymi lekami tej grupy. Może to mieć znaczenie w doborze
konkretnych preparatów u pacjentów ze współistnieniem osteoporozy i podwyższonego
ryzyka miażdżycy lub na przykład u chorych z niską aktywnością PON1. Następnie
planowane jest wykonanie oznaczeń biochemicznych, aktywności PON1 w osoczu i w
wątrobie względem paraoksanu oraz HTL, aktywności aminotransferaz w celu wykluczenia
lub stwierdzenia ewentualnego działania hepatotoksycznego, ekspresja genu PON1 w
wątrobie metodą RT-PCR, określenie profilu lipidowego oraz oznaczenie stężenia tHcy oraz
N-Hcy-białek. Poprzednie badania wykazały, że niedobór PON1 powoduje nasilenie
homocysteinylacji białek, nawet przy prawidłowym stężeniu Hcy w osoczu.
Schorzenie to jest wyzwaniem dla współczesnej medycyny, ze względu na wzrost
średniej długości życia ludzkiej populacji. Nowe formuły leczenia pozwalają obniżać koszty
profilaktyki oraz samego leczenia. Standardowe, długotrwałe terapie, podobnie jak źle leczone
choroby wymagają ogromnych nakładów finansowych (hospitalizacja, inwalidztwo, zgony), za
które płaci całe społeczeństwo. Tworzenie nowych rozwiązań oznacza dla pacjentów szansę na
lepsze życie. Poprzednie badania wykonane w Katedrze i Zakładzie Patofizjologii Uniwersytetu
Medycznego w Lublinie wykazały, że statyny - leki powszechnie stosowane w profilaktyce i
terapii chorób krążenia mają niekorzystne działanie na aktywność paraoksonazy 1 (PON1).
Paraoksonaza 1 jest enzymem odpowiedzialnym za przeciwmiażdżycowe działanie lipoprotein o
dużej gęstości (HDL). PON1 hamuje rozwój miażdżycy rozkładając produkty peroksydacji
lipidów oraz tiolakton homocysteiny (HTL) – endogenną pochodną homocysteiny, która
powoduje potranslacyjne modyfikacje białek. Statyny są inhibitorami reduktazy HMG-CoA –
kluczowego enzymu w syntezie cholesterolu i niesterydowych izoprenoidów. Bisfosfoniany
natomiast hamują kolejny enzym tego szlaku – kinazę mewalonianiową. Ze względu na
pokrewny mechanizm działania oraz częste współistnienie miażdżycy i osteoporozy, a co za tym
idzie przewlekle stosowanie bisfosfonianów u osób z hiperlipidemią z podwyższonym ryzykiem
miażdżycy lub już istniejącą miażdżycą uzasadnione jest zbadanie wpływu tych leków na
aktywność PON1.