Ocena dystrybucji subtypów endogennych retrowirusów PERV w

&ARMACEUTYCZNY0RZEGL’D.AUKOWY††
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
/CENADYSTRYBUCJISUBTYPÌWENDOGENNYCHRETROWIRUSÌW0%26
WNARZ’DACHSTADuWIÊ3USSCROFADOMESTICA
PRZEZNACZONYCHDOKSENOTRANSPLANTACJI
%STIMATIONOFDISTRIBUTIONTHESUBTYPESOFENDOGENOUSRETROVIRUSES0%26S
INORGANSOFDOMESTICPIGS3USSCROFADOMESTICA
THEDONORS
FORXENOTRANSPLANTATIONS
'RA˜YNA*ANIKOWSKA"ARBARA3TRZAŒKA*OLANTA!DAMSKA
"OGUMIŒA#ABAK)WONA+OWALCZYK5RSZULA-AZUREK
+ATEDRAI:AKŒAD"IOLOGII-OLEKULARNEJ
:AKŒAD#HEMII!NALITYCZNEJgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
W celu oceny ryzyka narażenia biorców ksenoprzeszczepów na zakażenie endogennymi retrowirusami świni, jak i
potwierdzenia możliwości wyselekcjonowania osobników
o najmniejszym prawdopodobieństwie transmisji wirusa
PERV (Porcine Endogenous Retrovirus), wyizolowane
DNA z wycinków wątroby, nerki i serca świni domowej
(Sus scrofa domestica), W wycinkach tkanek oceniano
częstość występowania retrowirusa PERV A, B i C, którego nieobecność w badanym materiale zmniejsza szanse rekombinacji pomiędzy poszczególnymi subtypami
PERV powodując zmniejszenie ryzyka zakażenia. Oceniano stopień ryzyka narażenia biorców nerek, wątroby
lub serca, na zakażenie endogennymi retrowirusami świni
(PERV),. Stwierdzono, że ryzyko zakażenia endogennymi
retrowirusami świni w ksenotransplantacjach zależy od
przeszczepianego narządu, przy czym największe wydaje
się być w przypadku biorców nerek.
Słowa kluczowe: PERV, ksenotransplantacje, świnia domowa
Summary
To estimate the risk of exposure the recipients of xenotransplants to the infection with porcine endogenous retroviruses (PERV) and confirm the possibility to select the individuals about least probability to transmission of PERV,
isolated DNA from segments of liver, kidneys and hearts
of household pig (Sus scrofa domestica), cultivated in Institute of Zootechnicses in Balice (Poland) were investigated for the occurrence of PERV and first of all subtype
C. The absence of PERV C in investigated material diminishes
chance of recombination among each subtypes PERV A and B
and C, what can reduce the infectivity of virus.
Taking into account the results of these investigations underlines oneself the possibility of selecting the individuals
without subtype PERV-C. Initial selection of individuals chosen to xenotransplantation can limited probability of the infection with PERV the organs recipients in
xenotransplantation. The estimation of risk of the infection with PERV stepping out in herds of pigs intended to
xenotransplantations of kidneys, livers and of hearts and
also delimitation the number of copy PERV DNA in whole
received from these segments DNA extracts. Ascertained,
that risk of infection with porcine endogenous retroviruses
of recipients of kidneys, livers and of hearts in xenotransplantation depends from transplanted organ, at what greatest appears to be in cause of kidneys.
Key words: PERV (porcie endogenous retrovirus), xenotransplantation, Sus scrofa domestica organs
'‚–|ª-J®RylR
Dysproporcja pomiędzy liczbą osób oczekujących na przeszczep serca, nerek, płuc, wątroby czy trzustki a ograniczoną
liczbą narządów dostępnych do przeszczepów allogenicznych skłoniła naukowców na całym świecie do poszukiwania
alternatywnych metod zastępowania niewydolnych organów.
Jednym z obiecujących kierunków badań są ksenotransplantacje. Spośród potencjalnych dawców organów do ksenotransplantacji, najbardziej optymalnym gatunkiem wydaje się
być świnia domowa (Sus scrofa domestica). Niestety, obok
wielu zalet gatunek ten posiada również cechy niekorzystne.
&ARMACEUTYCZNY0RZEGL’D.AUKOWY†
Jedną z nich jest występowanie w komórkach
narządów świni endogennych retrowirusów
[1, 2]. PERV (Porcine Endogenous Retrovirus)
nie wywołują żadnych chorób u świń, ale nie
można jednoznacznie stwierdzić, czy nie będą
chorobotwórcze dla człowieka. Do chwili obecnej nie stwierdzono żadnego przypadku zakażenia komórek człowieka w warunkach in vivo,
jednak nie można lekceważyć ryzyka infekcji
wirusem PERV biorców ksenoprzeszczepów
Wyróżniono trzy subtypy wirusa PERV (PERV-A, PERV-B, PERV-C) [3]. Wykazano zdolność wirusów PERV do infekowania komórek
człowieka in vitro, przy czym poszczególne
subtypy wirusa różniły się stopniem infekcyjności. Wykazano iż subtyp wirusa PERV-C jest
całkowicie niezdolny do infekowania ludzkich ¬A‡‡Ÿ RpªRyAo-Ÿ-u‚qluR–}ªŸ&GŸŸlŸŸ7ÖJÔA-Ÿ‚|J˜ -ªÔŸJ|ŸaRy| ¬‚|ª-yl-Ÿ
komórek, jednak uczestnicząc w procesie re- –R –|ªl–¥˜}ª
kombinacji z subtypem PERV-A zdolny jest do
utworzenia cząstki wirusowej o zwiększonej infekcyjności
w stosunku do komórek ludzkich [4, 5].. Celem pracy była
ocena dystrybucji endogennych retrowirusów PERV i poszczególnych ich subtypów w narządach świń (Sus scrofa
domestica) przeznaczonych do ksenotransplantacji.
- R–l-t¬ŸlŸuR |J¬
Z pobranych od 131 świń domowych przeznaczonych do
ksenotransplantacji, wyhodowanych przez Instytut Zootechniki w Balicach wycinków wątrób, nerek i serc izolowano
DNA metodą fenolowo-chloroformową zgodnie z protokołem FBI (Federal Bureau of Investigation, RFLP Manual, U.S.
Government 1993), badając pod kątem występowania wirusa
PERV. Stężenie DNA i czystość ekstraktu oceniano metodą
spektrofotometryczną z użyciem spektrofotometru Gene Quant
II (Pharmacia), biorąc pod uwagę wielkość absorbancji przy
długości fali 260 nm. Jakość uzyskanego DNA oceniano metodą elektroforezy w 0,9% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny i po analizie elektroforogramu w systemie komputerowej dokumentacji żelowej Biotec-Fischer BaSys 1D.
Amplifikację przeprowadzano przy użyciu amplifikatora
Perkin Elmer 9600 w następujących warunkach termicznych dla PCR-env: 95ºC przez 6min, 40 cykli w 94ºC przez
30 sekund, 65ºC przez 30 sekund, 72ºC przez 30 sekund
i 72ºC przez 10 min. Zastosowano polimerazę DNA Tfl
DNA Polymerase (Epicentre Technology, Madison, Wisconsin, USA). Mieszanina reakcyjna zawierała: MasterAmp
Tfl DNA Polymerase (1U), dNTP (0,lmM każdy), MgCl2
(l,2mM), MasterAmp PCR buffer (lx), po 0,2μM starterów
oraz 500 ng DNA jako matrycy dla reakcji prowadzonej
w objętości 25μl. Startery dla genu env PERV - A, B i C. wykorzystano do genotypowania PERV. Kontrolą endogenną
w analizie ilościowej DNA PERV było DNA GAPDH (dehydrogenazy 3-fosforanu gliceraldehydu), którego detekcję
prowadzono z zastosowaniem starterów GAPDH-F 5’-GAAGGTGAAGGT-CGGAGTCA-3’ i GAPDH-R 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ Zastosowanie endogennej
kontroli pozwoliło na wyeliminowanie fałszywie negatywnych lub pozytywnych wyników i pozwoliło na dodatkową
kontrolę jakości DNA oraz kontrolę prawidłowego przebie-
¬A‡¤Ÿ 7–-®Ÿ RqRp –|\|–Ra–-u¥Ÿ ‚–®RJ˜ -ªl-oÔA¬Ÿ –|®J®l-tŸ -u‚qluRk
–}ªŸŸ&‡ŸXŸ¡`Ÿ‚®GŸ&Ÿ¤œ°‚®GŸ&Ÿ¤U`‚®
gu reakcji PCR.
Specyficzność genotypowania metodą PCR oceniano na
podstawie wyników sekwencjonowanaia enzymatycznego i porównania zgodności sekwencji amplimerów z sekwencjami referencyjnymi o kodach dostępu dla PERV
A: AJ288584, PERV B: AJ288592 i PERV C: AF038600,
(ryc. 1 a, b i c.) w programie BLAST, (http://www. ncbi.
nlm.nih.gov/BLAST). Dodatkowo specyficzność amplifikacji oceniano metodą elektroforezy w 8% żelu poliakrylamidowym barwionym solami srebra. Markerem wielkości
była mieszanina fragmentów DNA pBR 322/HaeIII (ryc.2).
Otrzymane rozdziały analizowano w systemie dokumentacji
żelowej Biotec-Fisher BAS-SYS ID.
'¬ylpl
Ocena ryzyka narażenia biorców na zakażenie endogennymi retrowirusami świni (PERV), występującymi w organach
świń przeznaczonych do celów ksenotransplantacji nerek,
wątroby i serca, obejmowała przede wszystkim detekcję
DNA PERV subtypów A, B i C oraz wyznaczenie liczby kopii DNA PERV w całkowitych ekstraktach DNA otrzymywanych z tych wycinków.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
¬˜‡¡‡Ÿ ®Ö˜ |²ÉŸ ª¬˜ ւ|ª-yl-Ÿ ˜¥7 ¬‚¥Ÿ &Ÿ Ÿ ªŸ 7-J-y¬uŸ ˜ -k
J®lR
¬˜‡Ÿ^‡Ÿ®Ö˜ |²ÉŸª¬˜ ւ|ª-yl-ŸŸŸ&ŸŸªŸ7-J-y¬AiŸy-–®Ôk
J-Ai
ekspozycji na świńską tkankę nerki, jak także u dziesięciu
pacjentów cierpiących na cukrzycę, którym wszczepiono
świńskie komórki wysp trzustkowych 4-7 lat wcześniej
[8, 9]. Wynika z tego, że możliwość infekcji komórek ludzkich in vivo pozostaje jeszcze nadal sprawą niedokładnie
udokumentowaną.
¬˜‡Ÿ`‡ŸRJl-y¬Ÿª-– |²AlŸqlA®7¬ŸA®Ô˜ RpŸŸ&ŸªŸŸwaŸA-tp|ªlk
Ra|ŸŸRp˜ –-i|ª-yRa|Ÿ®ŸªÔ –|7¬GŸyR–plŸlŸ˜R–A-Ÿ7-J-y¬AiŸ²ªlÍ
Detekcję poszczególnych subtypów PERV A, B i C potwierdzano za pomocą elektroforegramów (rys. 2). Ze wszystkich badanych świń w pobranych próbach organów określano obecność subtypu PERV-C w oparciu o reakcję PCR,
z wykorzystaniem starterów specyficznych dla fragmentu
genu env, wykazującego zróżnicowanie u poszczególnych
subtypów PERV. Dla potwierdzenia wizualnego obecności
PERV-C w poszczególnych wycinkach organów wykonywano elektroforegramy (marker wielkości produktu 284
pz) i temperatury topnienia wirusowego DNA (dla subtypu C 80.4 oC). Analizując otrzymane wyniki stwierdzono
obecność PERV C tylko u 42 % badanych osobników (ryc.
3). Porównując liczbę kopii DNA PERV w 1 μg całkowitego DNA, który wyekstrahowano z wątrób, nerek i serc
badanych świń (ryc. 4) stwierdzono największe wartości
w wycinkach pobranych z nerek świń, co świadczy o największej ilości retrowirusa tam występującego. Potwierdza
to również procentowy udział rozprzestrzenienia PERV C
w badanych wycinkach (ryc. 5). Otrzymane wyniki świadczą
o tym, że ryzyko zakażenia endogennymi retrowirusami świni biorców nerek, wątroby i serca w ksenotransplantacjach
zależy od przeszczepianego narządu, jak również można
stwierdzić, że największe ryzyko zakażenia endogennymi
retrowirusami PERV świni biorców ksenoprzeszczepów istnieje u biorców nerek (rys. 4 i 5).
¬˜p¥˜oDotychczasowe badania nie wykazały jak dotąd czy retrowirusy PERV stanowią zagrożenie dla człowieka. Na świecie
żyją już pacjenci, którzy otrzymali przeszczepy świńskich
tkanek albo w inny, równie bliski sposób kontaktowali się
z narządami świń. Niektórzy pacjenci pozostawali więc wielokrotnie i/lub długotrwale w kontakcie z komórkami świni
i nie stwierdzono u żadnego z pacjentów obecności wirusa
PERV[6, 7]. Infekcji wirusem PERV nie wykryto zarówno
u dwóch przebadanych pacjentów, poddanych krótkotrwałej
Ryzyko zoonoz wynikające z możliwości zakażenia komórek człowieka endogennymi wirusami świń związane
może być przede wszystkim wynikiem rekombinacji DNA
PERV w zakażonych komórkach gospodarza [11, 12,13].
Wszystkie infekcyjne cząstki PERV, pochodzące ze świń
zdolnych do ich uwalniania, powstały w wyniku rekombinacji homologicznej między PERV-A i PERV-C [11] . która
może zachodzić zarówno w warunkach in vitro. jak i in vivo
[14 ] Pomimo tego, że wiele osób wątpi w możliwość transmisji PERV in vivo na człowieka, to badania takie wciąż
są prowadzone na różnych gatunkach zwierząt (, 15,16,17].
Ważnym jest, aby taką ewentualność bezwzględnie wykluczyć, ale również wziąć pod uwagę powstawanie innej drogi
wzrostu infekcyjności PERV, a mianowicie drogi związanej
z powstawaniem nowych rekombinantów.
Wstępne informacje dotyczące rekombinacji PERV wskazują, że motorem rekombinacji PERV może być najpóźniej
ewolucyjnie powstały PERV-C, dlatego w wyborze zwierząt
do ksenotransplantacji ważna jest selekcja świń pozbawionych PERV-C, co zmniejszałoby ryzyko zakażenia wirusowego u biorców przeszczepu [14].
Izolaty zawierające zrekombinowane formy retrowirusa
PERV, których genom posiadał sekwencje charakterystyczne
zarówno dla PERV-A i dla PERV-C (PERV-NIH), wykryto
po raz pierwszy podczas transmisji wirusa in vitro z PBMC
(Peripheral Blood Mononuclear Cells) świń miniaturowych
(MS) do komórek linii HEK293 (Human Embryonic Kidney
Cells; nr ATCC: CRL-1573) [18]. Kolejną zrekombinowaną
formę retrowirusa (PERV-A14/220) otrzymała Oldmixon
iwsp [11], a analiza sekwencji nukleotydów jego genomu
wykazała że PERV-A14/220, jest to rekombinant PERVA
i PERV C. Rekombinacja homologiczna pomiędzy tymi
dwoma retrowirusami nastąpiła na odcinku wielkości 850
pz [19] (913 pz według innych danych literaturowych) [14],
w domenie końca 3’ genu pol i fragmentu genu env (region
VRA i VRB), kodującego białko powierzchniowe otoczki
(SU). Rekombinant posiadał sekwencję genu env PERV-A,
kodującą domenę wiążącą receptor podczas gdy sekwencja
pozostałej części genomu zrekombiomnowanego wirusa
odpowiadała sekwencji genomu PERV-C. Dzięki obecności
&ARMACEUTYCZNY0RZEGL’D.AUKOWY†
RBD PERV-A zrekombinowany retrowirus uzyskał zdolność do wiązania się z receptorami dla tego subtypu PERV
a tym samym stał się zdolny do zakażania za ich pośrednictwem wrażliwych komórek [19].
Wzrost infekcyjności rekombinanta PERV-A14/220 o około
500 razy w stosunku do PERV-A niezrekombinowanego sugeruje, że powstające spontanicznie formy zrekombinowanych wirusów mogą stanowić większe niebezpieczeństwo
dla biorców ksenogenicznych narządów, niż formy endogenne wirusa, zintegrowane z genomem świni. a za tą zmianę
odpowiedzialny jest fragment genomu pochodzący z PERV
-C [19] Badania wielu chimerycznych genów env pozwoliły
na znalezienie miejsc odpowiedzialnych za wzrost infekcyjności rekombinantów. Miejsca te leżą w regionie kodującym
białka otoczki komponenty SU, a odpowiedzialna za to jest
substytucja w pozycji 140 izoleucyny do waliny oraz region
bogaty w prolinę [14]. Chimeryczny charakter sekwencji
PERV γ1 wykazywało wielu autorów [11, 18, 20]
PERV-C jest bardziej podobny do PERV-A niż do PERV
-B, choć powstał prawie 3,5 miliona lat póżniej od niego
w wyniku ewolucyjnych przekształceń. Nie znane jest pochodzenie procesu rekombinacji PERV-C, natomiast PERV-A
powstała z powtórzeń LTR. Filogenetyczna analizaróżnych
genomów wskazuje na to, że proces rekombinacji to ważny
czynnik biologicznej ewolucji na różnym poziomie [21]
Pomimo tego, że wielu naukowców wątpi w możliwość
transmisji PERV in vivo na człowieka, to badania takie wciąż
są prowadzone na różnych gatunkach zwierząt Ważnym jest,
aby wziąć pod uwagę powstawanie różnych dróg wzrostu
infekcyjności PERV i taką ewentualność wykluczyć.
|J˜¥u|ª-ylRŸ
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Uwzględniając wyniki przeprowadzonych badań podkreśla się możliwość wyselekcjonowania osobników
pozbawionych subtypu PERV-C. Możliwość ta staje się
szczególnie istotna, gdyż zmniejsza szanse rekombinacji pomiędzy poszczególnymi subtypami wirusa PERV,
która może prowadzić do zwiększenia infekcyjności wirusa.
11.
Wstępna selekcja osobników typowanych do ksenotransplantacji może ograniczyć prawdopodobieństwo zakażenia wirusem PERV biorców narządów w ksenotransplantacjach.
12.
Stwierdzono, iż ryzyko zakażenia endogennymi retrowirusami świni biorców nerek, wątroby i serca w ksenotransplantacjach zależy od przeszczepianego narządu,
przy czym największe wydaje się być w przypadku biorców nerek.
13.
14.
Piśmiennictwo
1.
2.
Patience C., Takeuchi Y., Weiss R. Infection of human
cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nature Medicine. 1997, 3 (3):282-286.
Mazurek U., Janikowska G., Wydmuch Z., Wilczok T.
Viral infections in xenotransplantation and their detection strategies. Biotechnologia, 2006 1(72): 125-132.
15.
Boneva R.S., T. M. Folks T.M., Chapman L. E.. Infectious disease issues in xenotransplantation. C M R.
2001, 14 (1):1-14.
Takeuchi Y., Patience C., Magre S., Weiss R.S., Banerjee P.T., Le Tissier P., Stoye J.P. Host range and
interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus. J Virol. 1998, 72 (12): 9986-9991.
Quinn G., Wood J.C., Ryan D.J., Suling K.M., Moran
K.M., Kolber-Simonds D.L., Greenstein J. L., Schuurman H.J., Hawley R.J., Patience C. Porcine endogenous retrovirus transmission characteristics of galactose
1-3 galactose-deficient pig cells. J. Virol. 2004, 78 (11):
5805-5811.
Blusch J.H., Panience C., Martin U. Pig endogenous retroviruses and xenotranspantation. Xenotransplantation
2002, 9:242-251.
Takefman D.M., Spear G. T., Saifuddin M., Wilson
C,A. Human CD59 incorporation into porcine endogenous retrovirus particles: Implications for the use of
transgenic pigs for xenotransplantation. J. Virol. 2002,
76 (4): 1999-2002.
Onions D., Cooper D.K.C., Alexander T.J.L., Brown
C., Claassen E., Foweraker J.E., Harris D.L., Mahy
B.W.J., Minor P.D., Osterhaus A.D.M.E, Pastoret P-P,
Yamanouchi K. An approach to the control of disease
transmission in pig-to-human xenotransplantation. Xenotransplantation 2000; 7.
Paradis K, Langford G, Long Z, Heneine W, Sandstrom
P, Switzer WM, Chapman LE, Lockey C, Onions D,
Otto E. Search for cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living
pig tissue. The XEN 111 Study Group. Science. 1999,
285(5431):1236-41.
Lee D., Lee J., Park N., Oh Y..K., Kwon M., Kim Y.B.
Analysis of natural recombination in porcine endogenous retrovirus envelope genes. J Microbiol Biotechnol.
2008, 18(3):585-90.
Oldmixon, B. A., Wood, J. C., Ericsson, T. A., Wilson,
C. A., White-Scharf, M. E., Andersson, G., Greenstein, J. L., Schuurman, H. J. , Patience, C. (2002).
Porcine endogenous retrovirus transmission characteristics of an inbred herd of miniature swine. J Virol 76,
3045–3048.
Takeuchi, Y., and R. A. Weiss. (2000). Xenotransplantation: reappraising the risk of retroviral zoonosis. Curr.
Opin. Immunol. 12, 504–507.
Suling, K., G. Quinn, J. Wood, and C. Patience. (2003).
Packaging of human endogenous retrovirus sequences is undetectable in porcine endogenous retrovirus
particles produced from human cells. Virology 312,
330–336
Harrison, I., Y. Takeuchi, B. Bartosch, and J. P. Stoye.
(2004). Determinants of high titer in recombinant porcine endogenous retroviruses. J. Virol. 78, 13871–13879.
Moscoso I, Hermida-Prieto M, Manez R, Lopez-Pelaez E, Centeno A, Diaz TM, Domenech N. (2005). Lack
of cross-species transmission of porcine endogenous
retrovirus in pig-to-baboon xenotransplantation with
sustained depletion of anti-alphagal antibodies. Transplantation. 79, 777-82.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
16. Walles T, Lichtenberg A, Puschmann C, Leyh R, Wilhelmi M, Kallenbach K, Haverich A, Mertsching H. (2003).
In vivo model for cross-species porcine endogenous retrovirus transmission using tissue engineered pulmonary
arteries. Eur J Cardiothorac Surg. 24 (3), 358-63
17. Nishitai R, Ikai I, Shiotani T, Katsura N, Matsushita
T, Yamanokuchi S, Matsuo K, Sugimoto S, Yamaoka
Y. Absence of PERV infection in baboons after transgenic porcine liver perfusion. (2005). J Surg Res. 124
(1), 45-51.
18. Wilson, C. A., Wong, S., VanBrocklin, M. & Federspiel,
M. J. (2000). Extended analysis of the in vitro tropism
of porcine endogenous retrovirus. J Virol 74, 49–56.
19. Bartosch B., Stefanidis D., Myers R., Robin Weiss R.,
Patience C., Takeuchi Y. (2004). Evidence and consequence of porcine endogenous retrovirus recombination.
J. Virol. 78, 13880–13890
20. Klymiuk N., Muller M., Brem G., Aigner B. (2003) Recombination analysis of human-.tropic porcine endogenous retroviruses. J Gen. Virol. 84, 2729-2734.