Autoreferat w języku polskim - Wydział Przyrodniczy UPH w Siedlcach

Autoreferat w języku polskim - Wydział Przyrodniczy UPH w Siedlcach

Dr inż. Katarzyna Andraszek
Katedra Genetyki i Hodowli Koni
Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt
Wydział Przyrodniczy
Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach
ul. B. Prusa 14
08-110 Siedlce
Załącznik III
AUTOREFERAT W JĘZYKU POLSKIM
1. Imię i Nazwisko - Katarzyna Andraszek
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne – z podaniem nazwy, miejsca i
roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.
3.
4.
-
magister inżynier zootechniki, Wydział Rolniczy, Wyższa Szkoła RolniczoPedagogiczna w Siedlcach (obecnie Wydział Przyrodniczy, Uniwersytet
Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach), 1996 r.
-
doktor nauk rolniczych w zakresie zootechniki, Wydział Rolniczy, Akademia
Podlaska w Siedlcach (obecnie Wydział Przyrodniczy, Uniwersytet PrzyrodniczoHumanistyczny w Siedlcach, na podstawie rozprawy doktorskiej „Charakterystyka
chromosomów mitotycznych i mejotycznych oraz analiza zawartości jądrowego DNA
gęsi włoskiej (Anser anser)”, 04.01.2006 r., promotor: prof. dr hab. Elżbieta Smalec
Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych
-
asystent, Katedra Genetyki i Hodowli Koni, Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt,
uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach (obecna nazwa jednostki),
01.10.1996 – 01.03.2006 r.
-
adiunkt, Katedra Genetyki i Hodowli Koni, Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt,
Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach, 01.03.2006 r. do chwili
obecnej.
Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r.
o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie
sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):
a. Tytuł osiągnięcia naukowego.
Cykl pięciu publikacji naukowych pod tytułem: „Struktura i aktywność jąderek w
spermatocytach wybranych gatunków zwierząt gospodarskich”.
b. Wykaz prac (autor, rok wydania, tytuł publikacji, nazwa wydawnictwa)
dokumentujący osiągniecie naukowe:
O.1. Andraszek K., Smalec E., 2007, Number and size of nucleoli in the spermatocytes of
European domestic goose (Anser anser), Archiv für Geflügelkunde/European Poultry
Science, 71 (5), 237-240.
O.2. Andraszek K., Gryzińska M., Knaga S., Wójcik E., Smalec E., 2012, Number and size
of nucleoli in the spermatocytes of chicken and Japanese quail, Folia Biologica
(Krakow), 60 (3-4), 121-127.
O.3. Andraszek K., Smalec E., 2012, Structure of the nucleoli in domestic cattle
spermatocytes, Folia Histochemica et Cytobiologica, 50 (3), 346–351.
1
O.4. Andraszek K., Gryzińska M., Wójcik E., Knaga S., Smalec E., 2014, Age-dependent
change in the morphology of nucleoli and methylation of genes of the nucleolar
organizer region in a Japanese quail model Coturnix japonica (Temminck and Schlegel,
1849) (Galliformes: Aves), Folia Biologica (Krakow), 62 (4), 293-300.
O.5. Andraszek K., Danielewicz A., Smalec E., Kaproń M., 2010, Identification of the
nucleoli in domestic horse spermatocytes - preliminary investigations, Roczniki
Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, 6 (4), 13-21.
Wkład wnioskodawcy w wyżej wymienione prace przedstawiono w załączniku V, natomiast
oświadczenia współautorów w załączniku VII.
c. Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników
wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania.
Jąderko wśród struktur jądra komórkowego po raz pierwszy zauważył i opisał Fontana
w 1781 roku, jednak dopiero pod koniec XIX wieku zauważono, że jego wielkość ma
znaczący wpływ na aktywność komórki. Stwierdzono również, że w spermatocytach ssaków
jąderka są dosyć duże i dobrze widoczne w mikroskopie świetlnym, ze względu na dużą ilość
części stałych (nawet do 85% objętości jąderka) oraz na zdolność załamywania światła
(Hernandez-Verdun, 2011).
1. Rola jąderka i nukleologeneza
Jąderka są produktem aktywności rejonów jąderkotwórczych – NOR (ang. Nucleolar
Organizer Regions) określonych chromosomów. Geny w rRNA ulokowane są w pętlach DNA
chromatyny chromosomów (Gonzalez i Sylvester, 1997). Ekspresja tych genów regulowana
jest przez przegrupowanie chromatyny oraz czynników wywołujących konkretne procesy
epigenetyczne (McStay i Grummt, 2008). Liczba jąderek w prawidłowo funkcjonującym
jądrze komórkowym jest równa lub mniejsza od liczby rejonów jąderkotwórczych
chromosomów mitotycznych, ponieważ kilka NOR bierze udział w formowaniu jednego
jąderka, lub jąderka leżące w bezpośrednim sąsiedztwie zlewają się ze sobą (Raška i in.,
2006).
Jąderka występują w jądrach prawie wszystkich komórek eukariotycznych, ponieważ
zawierają geny metabolizmu podstawowego, wyjątek stanowią plemniki i dojrzałe erytrocyty
ptaków (Kłyszejko-Stefanowicz, 2002; Raška i in., 2006). Ich masa jest większa od masy
nukleoplazmy, w której są zawieszone. Dzięki charakterystycznej gęstości, zwartej strukturze
i małej ilości wody (10%) jest organellą, którą w dogodny sposób można wyodrębnić.
W związku z tym, po fragmentacji jądra komórkowego w roztworze soli jąderko pozostaje
zachowane nawet po zniszczeniu większości struktur jądrowych i możliwa jest jego izolacja
po odwirowaniu. Wyizolowane jąderko jest takie samo jak w jądrze żywej komórki, a nawet
w niektórych przypadkach zachowuje aktywność transkrypcyjną (Olson, 2004; HernandezVerdun, 2011; Raška i in., 2006). Wielkość jąderka kręgowców waha się od 5-10 µm. Jest
różna w zależności od zapotrzebowania komórki na rybosomy (Shaw i Jordan, 1995).
W komórkach organizmów eukariotycznych jąderka mogą mieć formę nieregularną,
owalną lub kulistą (Olson & Dundr, 2005). Nieregularne formy jąderka mogą świadczyć
2
o procesach starzenia się komórki oraz o zapoczątkowanym procesie apoptozy (Olson i in.,
2002). Jąderka mniejsze i mikrojąderka wskazują na nieodwracalne uszkodzenia komórek,
których przyczyną jest całkowite i nieodwracalne zahamowanie syntezy RNA (Horky i in.,
2002). Jąderka są najmniej stabilnymi organellami w komórkach dorosłych ssaków. Ich cechy
morfologiczne zależne są od wielu czynników. Do bodźców mających wpływ na zmiany
w budowie jąderek można zaliczyć: gatunek zwierzęcia, typ i stopień zróżnicowania komórki,
rolę, jaka dana komórka ma spełniać, stan fizjologiczny lub patologiczny organizmu, oraz
faza cyklu komórkowego (Olson i in., 2002; Hernandez-Verdun, 2011). Epigenetyczne
regulacje na poziomie jąderka i genów rRNA są cały czas kluczowym tematem badań
genetycznych.
Jąderko ma zdolność zwiększania i zmieniania swoich rozmiarów, zagęszczania się
i rozpraszania podczas każdego cyklu komórkowego. Jego funkcjonowanie zostało najlepiej
poznane i opisane w komórkach somatycznych (Pikaard, 2002; Raška i in., 2006; HernandezVerdun, 2011). W mitozie jąderka są strukturami bardzo dynamicznymi. Wyrazem tego może
być ich cykliczne zanikanie w czasie mitozy i pojawianie się przy jej zakończeniu (Scheer
i Hock, 1999). Jąderko zanika podczas podziału komórkowego i odtwarza się
w rekonstruowanych jądrach, jako rezultat aktywności NOR (Olson, 2004). Materiał
jąderkowy pojawia się przy NOR-chromosomach, gdy zaczyna odtwarzać się jądro
telofazowe. Następnie dochodzi do wznowienia syntezy rRNA i jąderka stają się bardziej
widoczne. W czasie interfazy jąderko ma kształt kulisty. W profazie, kiedy chromosomy stają
się widoczne, oczywiste jest powiązanie jąderka z poszczególnymi chromosomami
jąderkotwórczymi (Raška i in., 2006).
Proces nukleologenezy jest nazywany również procesem biogenezy rybosomów.
Tandemowo ułożone w procesie mitozy geny rRNA, histony oraz cząsteczki białek tworzą
aktywną transkrypcyjnie chromatynę rybosomalną (r-chromatynę) wypełniającą wnętrze
jąderka. Jednak podczas telofazy r-chromatyna umiejscowiona jest w centrach włóknistych
nowo powstającego jąderka. Dochodzi do transkrypcji rDNA, czego produktem są włókna
prerybosomowego RNA, tworzące centra włókniste w jąderku (Bartova i in., 2010). Elementy
r-chromatyny, odpowiedzialne za proces transkrypcji, wytwarzają cząsteczki prerybosomowe
zawierające kompletny transkrypt. Transkrypcja rDNA jest wynikiem współpracy pomiędzy
produktami metylacji DNA, modyfikacją histonów a także cząsteczkami chromatyny.
Procesy te mają wpływ na transkrypcję obu nici rRNA oraz loci kodujących mRNA. Dużą
rolę w omawianych procesach odgrywają również białka, między innymi takie jak białka
heterochromatyny, białka fibrylarne, oraz nukleoliny, czynnie uczestniczących w syntezie
i przetwarzaniu rRNA (Di Mario, 2004).
W głównym etapie procesu powstawania rybosomów biorą również udział białka
wytworzone w cytoplazmie, które przechodzą potem do wnętrza jąderka. Początek biogenezie
daje prekursor 45S RNA, który łącząc się z białkami tworzy cząsteczkę 80S. Nowo
syntetyzowane cząsteczki rybosomów przemieszczają się z części granularnej jąderka do
części włóknistej Z pierwotnej postaci cząstek rybosomalnych wycięte zostają trzy typy
sekwencji rRNA. Są to 18S, 5S oraz 28S. Jednak podczas budowy rybosomy obecny jest
jeszcze jeden typ kwasu rybonukleinowego - rRNA-SrRNS. Kwas ten syntetyzowany jest
poza jąderkiem komórkowym, w zupełnie odrębnym chromosomie (Prieto i McStay, 2005).
3
Aktywność procesu nukleologenezy modyfikowana jest w zależności od ciągle
zmieniającego się zapotrzebowania komórki na rybosomy. Odpowiedni przebieg ich
produkcji jest warunkiem koniecznym do odbywania się metabolizmu komórki oraz
prawidłowego przebiegu wzrostu, rozwoju i dojrzewania komórki.
2. Jąderko podczas spermatogenezy
Proces spermatogenezy był i jest przedmiotem wielu badań. Został dokładnie opisany
zarówno w odniesieniu do terminologii, jak i biologicznych etapów powstawania plemników.
Najmniej poznanym i zbadanym aspektem spermatogenezy jest zjawisko fragmentacji jąderka
podczas pierwszej profazy mejotycznej oraz jego reorganizacja po zakończonej mejozie.
Analiza jąderek mejotycznych podejmowana jest najczęściej pod kątem dwóch
mechanizmów, zmniejszania rozmiarów jąderek podczas mejozy oraz fragmentacji
i ponownej reorganizacji jąderka. Uzupełnieniem tych badań są analizy dotyczące
precyzyjnego położenia jąderka w spermatogonium i spermatocycie.
Zmniejszenie rozmiarów jąderka jest wynikiem zmniejszania się w nim zawartości
dwóch białek - białka C23 odpowiedzialnego za transkrypcję rRNA i białka B23
odpowiadającego za składanie cząsteczek rRNA (Takeuchi i Takeuchi, 1990; Biggiogera i in.,
1991; Peruquetti i in., 2008, 2010). Wyniki badań sugerują, że fragmentacja jąderka zachodzi
podczas profazy pierwszej mejozy. W okrągłych spermatydach jąderka są już
zrekonstruowane, lecz mniejsze niż w spermatogoniach i wczesnych spermatocytach
pierwszego rzędu. Prawdopodobnie fragmentacja jąderka następuje w pachytenie, podczas
jego największej aktywności. Takie zachowanie jąderek obserwowano u większości
strunowców (Wachtel i Stahl, 1993; Teruel i in., 2007). W jądrach podłużnych spermatyd
i dojrzałych plemnikach nie obserwowano już jąderek. Obecność jąderka nie jest potrzebna w
plemniku, ponieważ po zapłodnieniu zarówno jąderko męskiego, jak i żeńskiego przedjądrza
w zygocie pochodzą od matki. Jąderko komórki jajowej w połączeniu z innymi produktami
nukleoplazmatycznymi jest niezbędne do prawidłowego rozwoju embrionalnego (Lefèvre,
2008).
Badania ultrastruktury komórki i jąderka umożliwią sprawdzenie, dlaczego jąderko ulega
zmniejszeniu podczas mejozy i czy jest to wynikiem udziału fragmentów jąderka w montażu
ciałek chromatoidalnych (CB) – chromatiod body, które są obserwowane po zakończonym
drugim podziale mejotycznym na obrzeżach jądra okrągłych spermatyd. Inna hipoteza
tłumaczy zmniejszanie się jąderek na skutek migracji ich fragmentów do cytoplazmy
komórek pod koniec profazy I (Peruquetti i wsp., 2012). W literaturze opisano, że montaż CB
odbywa się równolegle z fragmentacją jąderka i oba te procesy są ze sobą skorelowane
(Kotaja i in., 2007; Peruquetti i in., 2008, 2010).
Udowodniono również, że przywrócenie morfologii jąderkowej po podziałach
komórkowych jest niezwykle ważne. Jest to cecha przyczyniająca się do wyzerowania
długości życia jąderka w gametogenezie, a co za tym idzie, do eliminacji przeróżnych
przypadkowych uszkodzeń wywołanych starzeniem się komórki. Potwierdza to związek
jąderka z telomerazą (Ünal i in., 2011).
Okrągłe spermatydy posiadają już zreorganizowane jąderko, a ich CB osiągają
maksymalną powierzchnię. Na tym etapie spermatogenezy CB mogą być obserwowane, jako
samodzielne struktury lub w połączeniu z mitochondriami i systemem akrosomowym.
4
Wcześniejsze badania sugerują, że CB są związane z mitochondriami spermatocytów
i pochodzą z materiału intermitochondrialnego (Fawcett i in., 1970). Reunov i in. (2000)
sugerują, że CB pochodzą z genomu jądrowego, a następnie są uzupełnione o produkty
genomu mitochondrialnego. Wykrycie obecności kilku elementów mitochondrialnych w CB
może potwierdzać związek pomiędzy genomem jądrowym i mitochondrialnym,
i przekazywanie tej interakcji z pokolenia na pokolenie. Również w badaniach (Peruquetti
i in., 2012) potwierdzono związek pomiędzy mitochondriami spermatocytów i CB oraz udział
CB w tworzeniu wstawki i witki plemników. Związek między CB a mitochondriami może
także tłumaczyć udział CB w syntezie i transporcie apocytochromu c - izoformy cytochromu
c, którego ekspresja jest obserwowana w tkance jądra oraz obecność oksydazy cytochromu c
(COXI), istotnego komponentu mitochondrialnego (Haraguchi i in., 2005).
Lokalizacja jąderek w spermatocytach jest ściśle określona przez specyficzną gatunkowo
architekturę wewnętrzną jądra. Każdy chromosom zajmuje w jądrze swoje określone
terytorium. Układ jąderek jest związany z pozycją NOR-chromosomów i lokalizacją NOR
wchromosomach. Gatunki, u których obszary jąderkotwórcze są umiejscowione
w terminalnych częściach ramion chromosomów posiadają jąderko zlokalizowane
w peryferyjnej części jądra spermatocytu. Gatunki, u których NOR występuje
w interstycjalnych częściach chromosomu mają jąderko w centralnej części jądra
spermatocytu (Berrios i in., 2004).
Rozmiar i liczba jąderek stopniowo zmniejszają się podczas spermatogenezy. Część
materiału pochodzenia jąderkowego prawdopodobnie migruje do cytoplazmy i bierze udział
w tworzeniu ciałek chromatoidalnych. Zjawisko fragmentacji jąderka i montażu CB zachodzi
w tym samym czasie spermatogenezy. CB biorą udział w tworzeniu akrosomu, zstępowaniu
mitochondriów do wstawki oraz tworzeniu białkowej osłony witki plemnika.
3. Jąderko w badaniach epigenetycznych
Oprócz tego, że jąderko jest bezpośrednio związane z biogenezą rybosomu,
udowodniono również jego zaangażowanie w inne procesy komórkowe (Santoro i Grummt,
2001; Olson i in., 2002; Gerbi i in., 2003; Raška i in., 2006). Niekonwencjonalna rola jąderek
została opisana przede wszystkim w odniesieniu do epigenetycznych mechanizmów
komórkowych. Jąderko bierze udział miedzy innymi w regulacji cyklu komórkowego,
biogenezie rybonukleoproterin, proliferacji komórek. Udowodniono jego związek
z kancerogenezą, zakażeniami wirusowymi, chorobami zwyrodnieniowymi i stresem
komórkowym (Gerbi i in., 2003; Khurts, 2004; Nafe i Schlote, 2004; Raška i in., 2006;
Boisvert i in., 2007).
W onkologii, na podstawie morfologii jąderek klasyfikuje się kancerogenny wpływ
onkogenów. Oceniana jest wtedy liczba, wielkość oraz lokalizacja jąderek w jądrze
komórkowym (Nafe i Schlote, 2004; Raška i in., 2006). Istnieje bezpośredni związek
pomiędzy aktywnością obszarów jąderkotwórczych, a podziałami komórki (Derenzini i in.,
1990; Raška i in., 2006). Z jąderkiem jest związane białko c-Myc, które jest produktem
protoonkogenu. Białko to reguluje biogenezę rybosomu i wszystkie trzy ludzkie polimerazy.
Kontroluje także syntezę rRNA (Arabi, 2005; Oskarsson i Trumpp, 2005). Białkami
o jąderkowej lokalizacji są także białka pRb i p53. Białka te nazywane „strażnikami genomu”
są onkosupresorami kontrolującymi cykl komórkowy i prawidłowy wzrost komórki (Ryan
5
i in., 2001). Białko p53 i jąderko są ze sobą funkcjonalnie połączone. Aktywacja białka p53
na skutek transformacji nowotworowej powoduje dezintegrację jąderek (Rubbi i Milner,
2003; Olson, 2004).
W literaturze przedmiotu można znaleźć także prace dotyczące związku jąderka
z infekcjami wirusowymi (Hiscox, 2002, 2003; Olson i wsp., 2002) oraz z jąderkową
lokalizacją telomerazy (Lukowiak, 2001). Podczas cyklu komórkowego czynnik TRF2
telomeru jest zależny od funkcjonalnych i strukturalnych zmian jąderka (Khurts, 2004).
Starzenie na poziomie komórkowym i morfologia jąderek są także procesami
skorelowanymi. Badania genomu drożdży potwierdziły, że uszkodzenie genów rRNA
powoduje dezintegrację jąderek, która jest objawem starzenia się organizmu.
Na morfologię jąderek ma również wpływ metylacja DNA. Od niej zależy konformacja
genów kodujących rRNA. Może być aktywna transkrypcyjnie, nazywana otwartą lub
zamknięta, co jest związane z załamaniem transkrypcji. Postępujący proces metylacji
związany z wiekiem osobnika może wyciszać wszystkie lub tylko niektóre geny
odpowiedzialne za reorganizację jąderek po podziale komórkowym (Grummt i Pikaard,
2003). Epigenetyczne regulacje na poziomie jąderka i genów rRNA są cały czas kluczowym
tematem badań genetycznych.
4. Cel naukowy
Celem naukowym opracowania jest analiza struktury jąderek podczas spermatogenezy
u wybranych gatunków zwierząt gospodarskich oraz określenie ich liczby i rozmiarów
w komórce oraz struktury w zależności od wieku organizmu, u którego były analizowane.
Z uwagi na wpływ mechanizmów epigenetycznych na strukturę chromatyny podjęto także
próbę analizy metylacji genów rRNA i jej wpływu na morfologię jąderek. Szczegółowe cele
naukowe zostały sformułowane w publikacjach dokumentujących osiągniecie naukowe.
1.
Określenie liczby i wielkości jąderek w spermatocytach samców europejskiej gęsi
domowej (Anser anser), kury domowej (Gallus gallus domesticus) i przepiórki japońskiej
(Coturnix coturnix japonica) – prace O.1, O.2.
2.
Ustalenie liczby i morfologii jąderek w profazie pierwszego podziału mejotycznego,
u samców bydła domowego i konia domowego – prace O.3, O.5.
3.
Określenie kształtu jąderek oraz analiza metylacji genu RN28S w spermatocytach
samców przepiórki japońskiej (Coturnix japonica) należących do dwóch grup wiekowych
– praca O.4.
4.1. Wprowadzenie metodyczne
We wszystkich analizowanych pracach materiałem poddanym analizie były
spermatocyty pierwszego rzędu, z których jąder izolowano chromosomy mejotyczne.
W przypadku materiału pochodzącego od ptaków stosowano procedurę opisaną przez Pollock
i Fechheimer (1978), natomiast w przypadku ssaków wykorzystano metodykę Evans i in.,
(1964). Jąderka, podobnie jak i obszary jąderkotwórcze, wykazują powinowactwo do metali
ciężkich i mogą być identyfikowane techniką barwienia azotanem srebra w koloidalnym
roztworze ochronnym (Howell i Black, 1980). Jest to klasyczna metoda identyfikacji
6
obszarów jąderkotwórczych na chromosomach mitotycznych sprawdzająca się doskonale
w identyfikacji jąderek mejotycznych. W przeciwieństwie do NOR obserwowanych
w mitozie jąderka są strukturami dużymi. Barwienia z użyciem AgNO3 umożliwiają
stwierdzenie liczby, wielkości oraz kształtu jąderek. Analiza metylacji była prowadzona na
DNA wyizolowanym z zawiesiny komórkowej wykorzystanej do analizy jąderek. Analizę
metylacji wykonano za pomocą techniki MSP (methylation-specyfic PCR). Startery do reakcji
zostały zaprojektowane na podstawie sekwencji genu RN28S - 28S ribosomal RNA (Gallus
gallus) (NCBI, Gene ID 100861559).
4.2. Przedstawienie wyników
Określenie liczby i wielkości jąderek w spermatocytach samców europejskiej gęsi
domowej (Anser anser), kury domowej (Gallus gallus domesticus) i przepiórki japońskiej
(Coturnix coturnix japonica) – prace O.1, O.2.
W spermatocytach badanych gatunków ptaków jąderka zidentyfikowano w sposób
jednoznaczny bez względu na etap profazy i intensywność zabarwienia preparatów. Ponadto,
w komórkach charakterystycznych dla wczesnej profazy obserwowano kinetochory
centromerów, jako ciemne punkty na tle chromatyny (białka kinetochorów także wykazują
pozytywna reakcje na srebro).
W spermatocytach gęsi obserwowano zróżnicowaną liczbę jąderek. Zmienność tę
stwierdzono w komórkach pochodzących od tego samego osobnika oraz między osobnikami.
Ogółem w 199 komórkach pochodzących od 10 osobników stwierdzono 329 jąderek. Liczba
jąderek u poszczególnych osobników wahała się od 1 do 4, średnio 1,65 w komórce. Komórki
z 4 jąderkami występowały sporadycznie. U każdego osobnika zaobserwowano obecność
jąderek różnej wielkości. Obserwowane jąderka subiektywnie klasyfikowano, jako duże lub
małe. W ogólnej liczbie zidentyfikowanych jąderek 78% stanowiły duże, natomiast 22%
małe.
W spermatocytach kogutów również obserwowano zróżnicowaną liczbę jąderek.
Zróżnicowanie obserwowano w komórkach tego samego osobnika i pomiędzy badanymi
osobnikami. Liczba jąderek u poszczególnych osobników wahała się od 1 do 4, średnio 1,91
w komórce. W 500 badanych komórkach stwierdzono 23% komórek z jednym jąderkiem,
65% z dwoma, 11% z trzema i 15% z czterema. W ogólnej liczbie zidentyfikowanych
jąderek, 34% sklasyfikowano jako duże, pozostałe 66% jako małe.
W spermatocytach przepiórki także obserwowano zmienność liczby jąderek, zarówno
wewnątrz osobniczą, jak i miedzy osobnikami. U poszczególnych osobników liczba jąderek
wahała się od 1 do 2, średnio 1,13 w komórce. W 500 analizowanych komórkach, 88% miało
jedno jąderko, a 12% dwa jąderka. U każdego osobnika obserwowano obecność jąderek
różnej wielkości. W ogólnej liczbie jąderek, 12% sklasyfikowano jako duże, 88% jako małe.
7
Ustalenie liczby i morfologii jąderek w profazie pierwszego podziału mejotycznego
u samców bydła domowego i konia domowego – prace O.3, O.5.
W spermatocytach bydła domowego zaobserwowano jedno jąderko, które było dobrze
widoczne zarówno w komórkach charakterystycznych dla wczesnego, jak i późnego
leptotenu. Na początku leptotenu występują jąderka o regularnym, prawie okrągłym,
kształtcie oraz posiadające jednolitą strukturę. W końcowej fazie leptotenu jąderka ulegają
dyspersji, nadal jednak stanowią zwartą strukturę. W obrębie jąderka można wtedy
zaobserwować ciemne, drobne struktury, których liczba jest równa lub zbliżona do dziesięciu.
Jest to liczba obszarów jąderkotwórczych występujących w kariotypie bydła domowego.
W spermatocytach konia obserwowano zawsze jedno jąderko. Zróżnicowany był
natomiast kształt jąderek w komórkach poszczególnych osobników, w zależności od wieku.
Jąderka sklasyfikowano w trzech grupach: jąderka o regularnym, okrągłym kształcie, jąderka
nieregularne i jąderka o strukturze zdefragmentowanej. Zaobserwowano, że w komórkach
osobników młodych, dwuletnich przeważały jąderka o regularnej strukturze. W ogólnej
liczbie jąderek analizowanych u dwuletnich koni, 62% stanowiły jąderka regularne, natomiast
jąderka nieregularne stanowiły 38% jąderek. U dwuletnich koni nie obserwowano jąderek
o zdefragmentowanej strukturze. W komórkach koni trzyletnich stwierdzono równy udział
jąderek regularnych i nieregularnych, po 50% w każdej grupie. Podobnie jak w komórkach
koni dwuletnich, również u koni trzyletnich nie występowały jąderka o zdefragmentowanej
strukturze. Najbardziej zróżnicowane pod względem kształtu jąderek były komórki koni
siedmioletnich. Regularne jąderka stanowiły niewielki odsetek, zaledwie 2% obserwowanych
jąderek. Największą liczbę stanowiły jąderka o nieregularnym kształcie – 67%. Ponadto,
w komórkach siedmioletnich koni obserwowano także jąderka zdefragmentowane, które
stanowiły 31% wszystkich jąderek.
Określenie kształtu jąderek oraz analiza metylacji genu RN28S w spermatocytach
samców przepiórki japońskiej (Coturnix japonica) należących do dwóch grup
wiekowych – praca O.4.
W opisanych w pracy badaniach zidentyfikowano jąderka o zróżnicowanym kształcie
w spermatocytach pierwszego rzędu u przepiórek w różnym wieku. U przepiórek
obserwowano od 1 do 2 jąderek w komórce. Zidentyfikowane jąderka sklasyfikowano, jako
regularne, nieregularne oraz zdefragmentowane. Udział jąderek o określonym kształcie różnił
się w zależności od wieku ptaków. W komórkach przepiórek młodych (15-tygodniowych)
stwierdzono przede wszystkim jąderka o regularnym, owalnym kształcie. W ogólnej liczbie
1128 jąderek ponad 96% stanowiły jąderka regularne. Jąderka nieregularne stanowiły
niewiele ponad 3% wszystkich jąderek. W tej grupie nie stwierdzono jąderek
zdefragmentowanych. W komórkach 52-tygodniowych przepiórek nie zaobserwowano
jąderek regularnych. Jąderka nieregularne stanowiły ponad 37% wszystkich 1110
zidentyfikowanych jąderek. W tej grupie wiekowej najwięcej, ponad 62%, stanowiły jąderka
zdefragmentowane. W wyniku reakcji MSP stwierdzono, że gen RN28S ulega metylacji
zarówno u przepiórek 15 tygodniowych, jak i 52-tygodniowych. Badania wykazały, iż gen
28S rRNA jest zmetylowany oraz wyciszony zarówno u 15 tygodniowych jak i 52
tygodniowych przepiórek. Gen 28S rRNA w danych okresach rozwojowych jest wyciszany,
8
co wskazuje na to, że metylacja tego genu może być związana nie tylko z wiekiem, ale
i z cyklem komórkowym. Konieczna jest analiza wszystkich genów zlokalizowanych
w obszarze jąderkotwórczym (NOR), aby potwierdzić zależność metylacji z brakiem ekspresji
oraz związek z cyklem komórkowym.
4.3. Komentarz do wyników
Liczba jąderek w jądrze komórkowym jest równa lub mniejsza od liczby obszarów
jąderkotwórczych. Uzyskane w badaniach wyniki częściowo potwierdzają tę rozbieżność.
Zarówno w komórkach gęsi, przepiórek, bydła jak i koni potwierdzono regułę, że liczba
jąderek jest równa lub mniejsza od liczby aktywnych NOR. Natomiast w komórkach kur
liczba jąderek przewyższała liczbę aktywnych NOR opisanych dla Gallus domesticus.
Przyczyną tego zróżnicowania może być występująca u kur trisomia, w tym przypadku
dotycząca 16 pary chromosomów, na której zlokalizowany jest NOR. Więcej niż dwa jąderka
w komórkach u kur obserwowali także Muscarella i in. (1985) oraz Delany i in. (1991),
którzy potwierdzili, że zwiększona liczba jąderek może być przyczyną obecności
trisomicznych lub tetrasomicznych jąder w komórkach badanych ptaków.
Wpływ na zróżnicowanie liczby i wielkości jąderek w komórce, zarówno w aspekcie
osobniczym, jak i gatunkowym, mają niewątpliwie zmiany w aktywności obszarów
jąderkotwórczych. Wybarwiają się te odcinki NOR, w których transkrypcja zajdzie
w następnym cyklu komórkowym, dlatego nie wszystkie NOR ujawniają się jednocześnie
i nie wszystkie biorą udział w tworzeniu jąderek podczas konkretnego cyklu komórkowego.
Zróżnicowana jest także aktywność transkrypcyjna chromosomów homologicznych.
W obrębie homologów jeden może silniej reagować na srebro, a drugi słabiej. Ponadto
wielkość obszarów jąderkotwórczych jest cechą polimorficzną. Polimorfizm wielkości
obszarów jąderkotwórczych ujawnia się w postaci depozytów srebra lub sygnałów
w hybrydyzacji in situ o różnych rozmiarach. Różnice te mogą tłumaczyć różną liczbę jąderek
i zróżnicowane ich rozmiary w komórkach osobnika (Raška i in., 2006; Hernandez-Verdun,
2011).
Porównanie liczby jąderek w komórkach somatycznych i w spermatocytach tego samego
gatunku, dowodzi o zmniejszonej liczbie jąderek w spermatocycie. W komórkach
somatycznych oraz w diploidalnych spermatogoniach liczba jąderek jest skorelowana z liczbą
aktywnych obszarów jąderkotwórczych. W spermatocytach występuje najczęściej jedno, duże
jąderko. Możliwe, że między mitozą, a mejozą podczas spermatogenezy dochodzi do
akumulacji jąderek w celu uzyskania przez nie największej aktywności w pachytenie
pierwszej mejozy (Teruel et al., 2007; Mosgoller, 2004).
Jąderka ulegają degradacji przez całą profazę pierwszego podziału mejotycznego.
Sposób w jaki zanikają jest prawdopodobnie charakterystyczny dla określonych grup
kręgowców. Możliwe, że jest to cecha gatunkowa. W spermatocytach bydła domowego
jąderka stopniowo ulegają defragmentacji i „rozsypują” się na drobne struktury, których
liczba odpowiada liczbie obszarów jąderkotwórczych. Badania, w których analizowano liczbę
i wielkość jąderek w spermatocytach ptaków, potwierdzają odmienny proces zaniku jąderek.
U ptaków reorganizacja chromatyny podczas profazy pierwszego podziału mejotycznego
i związana z tym procesem zmiana rozmiarów jądra komórkowego jest skorelowana ze
9
zmniejszającymi się rozmiarami jąderek. Na początku profazy, we wczesnym leptotenie,
jąderka są widoczne jako duże owalne struktury, natomiast pod koniec profazy są
obserwowane jako niewielkie punkty związane z określonymi biwalentami.
Jąderka charakteryzują się dużym polimorfizmem, a ich aktywność zmienia się
w zależności od gatunku, typu komórki, stopnia jej zróżnicowania oraz fazy cyklu
komórkowego (Derenzini i in., 2005). Morfologia i ultrastruktura jąderka jest zmienna
w zależności od gatunku, typu komórki, stopnia zróżnicowania a także cyklu komórkowego.
Komórki młode mają jąderka gładkie. W miarę starzenia się organizmu, kształt jąderka staje
się nieregularny. Jąderko zmienia się także w odpowiedzi na różne stany fizjologiczne jak
i patologiczne (Shaw i Jordan, 1995; Raška i in., 2004, 2006; Lam i in., 2005). W komórkach
macierzystych jąderka są małe i liczne natomiast w komórkach proliferujących duże
i nieliczne. W końcowym stadium różnicowania jąderka łączą się w pojedynczą strukturę
(Olson i in., 2002).
Ponadto, na morfologię jąderek mają także wpływ epigenetyczne mechanizmy działające
na poziomie metylacji DNA. Geny kodujące rRNA istnieją w formie aktywnej
transkrypcyjnie i nieaktywnej transkrypcyjnie. Wyciszaniu mogą ulegać całe rejony NOR lub
tylko niektóre geny organizatorów jąderka. Prawdopodobnie głównym mechanizmem
regulującym aktywność NOR są procesy epigenetyczne.
Starzenie powoduje dezintegrację jąderek. Wybór spermatocytów do badań nie był
wyborem przypadkowym. W spermatocytach pierwszego rzędu jąderka są wyjątkowo duże,
łatwe w identyfikacji i opisie. Metylacja DNA ma wpływ na morfologię jąderek. Od niej
zależy konformacja genów kodujących rRNA. Może być aktywna transkrypcyjnie, nazywana
otwartą lub zamknięta, co jest związane z załamaniem transkrypcji(Grumt i Pikaard, 2003;
Staub i in., 2004). Wyciszenie genów rRNA na drodze nadmiernej metylacji powoduje
dezintegracje jąderek, która jest objawem starzenia się organizmu. Starzenie na poziomie
komórkowym i morfologia jąderek są także procesami skorelowanymi.
5. Podsumowanie
Analiza struktury jąderek, produktów regionów jąderkotwórczych, może być
alternatywnym źródłem informacji na temat aktywności genów kodujących rRNA. Ponadto
jąderka ulegają degradacji dopiero pod koniec profazy. Można je łatwo zidentyfikować
stosując rutynowe techniki cytogenetyczne. Analiza struktury jąderek może być prowadzona
w standardowym mikroskopie świetlnym.
Jąderko jest strukturą jądra komórkowego związaną przede wszystkim z biogenezą
rybosomów i pośrednio odpowiedzialną za biosyntezę białek. W ciągu ostatnich kilku lat
rozwój badań epigenetycznych ujawnił dodatkowe, równie istotne funkcje jąderka. Jest ono
zaangażowane w najbardziej krytyczne dla organizmu procesy, takie jak starzenie na
poziomie komórkowym i osobniczym oraz szeroko pojęty proces kancerogenezy. W związku
z powyższym, jąderko od ponad stu lat jest przedmiotem zainteresowania nauk
podstawowych i stosowanych. Coraz powszechniej podstawowe badania genetyczne
i cytogenetyczne są rozszerzane o badania ewolucyjne, głównie dotyczące ewolucji
genomów.
10
Jąderka mogą być z powodzeniem wykorzystywane w cytogenetycznych badaniach
dotyczących procesów starzenia i zmian w strukturach komórkowych zachodzących na skutek
starzenia się organizmów.
Obecnie wielu naukowców traktuje poziom metylacji, jako wskaźnik wieku lub narzędzie
do przewidywania długości życia. Nieprawidłowa metylacja może prowadzić do
przedwczesnego starzenia się. Metylacja cytozyny stanowi bardzo dobry marker w badaniach
nad ekspresją genów w zależności od wieku.
6. Piśmiennictwo
1. Arabi A., Wu S., Ridderstrale K., Bierho V.H., Shiue C., Fatyol K., Fahlen S., Hydbring P.,
Soderberg O., Grummt I., Lar on L.G., Wright A.P. 2005. c-Myc associates with ribosomal DNA
and activates RNA polymerase I transcription. Nature Cell Biology, 7: 303-310.
2. Bartova E., Harnicarova-Horakova H., Uhlirova R., Raska I., Galiova G., Orloga D., Kozubek S.
2010. Structure and Epigenetics of Nucleoli in Comparison With Non- nucleolar Compartments.
The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 58: 391-400.
3. Berrios S., Fernandez-Donoso R., Pincheira J., Page J., Manterola M., Cristina Cerda M. 2004.
Number and nuclear localization of nucleoli in mammalian spermatocytes. Genetica, 121: 219–
228.
4. Biggiogera M., Kaufmann S.H., Shaper J.H., Gas N., Amalric F., Fakan S. 1991. Distribution of
nucleolar proteins B23 and nucleolin during mouse spermatogenesis. Chromosoma, 100: 162–172.
5. Boisvert F.M., van Koningsbruggen S., Navascués J., Lamond A.I. 2007. The multifunctional
nucleolus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 8: 574-585.
6. Delany M.E., Robinson C.M., Goto R.M., Miller M.M. 2009. Architecture and organization of
chicken microchromosome 16: Order of the NOR, MHC-Y, and MHC-B Subregions. The Journal
of Heredity, 100: 507–514.
7. Derenzini M., Pession A., Trere, D. 1990. Quantity of nucleolar silver-stained proteins is related to
proliferating activity in cancer cells. Laboratory Investigation, 63: 137–140.
8. Derenzini M., Pasquinelli G., O’Donohue M.F., Ploton D., Thiry M. 2005. Structural and
functional organization of ribosomal genes within the mammalian cell nucleolus. The Journal of
Histochemistry and Cytochemistry, 54: 131–145.
9. Di Mario P.J. 2004. Cell and molecular biology of nucleolar biology of nucleolar assembly and
disassembly. International Review of Cytology, 239: 99-178.
10. Evans E.P., Breckon G., Ford C.E. 1964. An airdrying method for meiotic preparation from
mammalian testes. Cytogenetics, 15: 289-294.
11. Fawcett D.W., Eddy E.M., Phillips D.M. 1970. Observations on the fine structure and
relationships of the chromatoid body in mammalian spermatogenesis. Biology of Reproduction, 2:
129–153.
12. Gerbi S.A., Borovjagin A.V., Lange T.S. 2003. The nucleolus: A site of ribonucleoprotein
maturation. Current Opinion in Cell Biology, 15: 318–325.
13. Gonzalez I.L., Sylwester J.E. 1997. Beyond Ribosomal DNA: on towards the telomere,
Chromosoma, 105: 431-437.
14. Grummt I., Pikaard C.S. 2003. Epigenetic silencing of RNA polymerase I transcription. Nature
Reviews. Molecular Cell Biology, 4: 641-649.
15. Haraguchi C.M., Mabuchi T., Hirata S. 2005. Chromatoid bodies: aggresome-like characteristics
and degradation sites for organelles of spermiogenic cells. Journal of Histochemistry and
Cytochemistry, 53: 455–465.
11
16. Hernandez-Verdun D. 2011. Structural Organization of the Nucleolus as a Consequence of the
Dynamics of Ribosome Biogenesis. W: The Nucleolus. Red. Olson M.O.J., Springer New York
Dordrecht Heidelberg London; Springer Science+Business Media.
17. Hiscox J.A. 2002. Brief review: The nucleolus—a gateway to viral infection? Archives of
Virology, 147: 1077–1089.
18. Hiscox, J.A. 2003. The interaction of animal cytoplasmic RNA viruses with the nucleus to
facilitate replication. Virus Research, 95: 13–22.
19. Horky M., Kotala V., Anton M., Wiesierska-Gadek J., 2002. Nucleolus and apoptosis, Cell
signaling, transcription, and translation as therapeutic targets. Annals of the New York Academy
of Science, 973: 258-264.
20. Howell W.M., Black D.A. 1980. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a
protective colloidal developer a 1-step method. Experientia, 36: 1014-1015.
21. Khurts S., Masutomi K., Delgermaa L., Arai K., Oishi N., Mizuno H., Hayashi N., Hahn W.C.,
Murakami S. 2004. Nucleolin interacts with telomerase. The Journal of Biological Chemistry, 279:
51508–51515.
22. Kłyszejko-Stefanowicz L. 2002. Cytobiochemia: biochemia niektórych struktur komórkowych.
PWN, Warszawa.
23. Kotaja N., Sassone-Corsi P. 2007. The chromatoid body: a germ-cell-specific RNA- processing
centre. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 8: 85–90.
24. Lam Y.W., Trinkle-Mulcahy L., Lamond A.L. 2005. The nucleolus. Journal of Cell Science, 118:
1335-1337.
25. Lefèvre B. 2008. The nucleolus of the maternal gamete is essential for life. BioEssays, 30: 613–
616.
26. Lukowiak A.A., Narayanan A., Li Z.H., Terns R.M., Terns M.P. 2001. The snoRNA domain of
vertebrate telomerase RNA functions to localize the RNA within the nucleus. RNA, 7: 1833–1844.
27. Mc Stay B., Grummt I. 2008. The epigenetics of rRNA genes: from molecular to chromosome
biology. Annual Review of Cell Biology, 24: 131-157.
28. Mosgoeller W., 2004. Nucleolar ultrastructure in vertebrates. W: The Nucleolus. Red. Olson
M.O.J., Kluwer, New York, USA.
29. Muscarella D.E., Vogt V.M., Bloom S.E. 1985. The ribosomal RNA gene cluster in aneuploid
chicken: evidence for increased gene dosage and regulation of gene expression. The Journal of
Cell Biology 101: 1749-1756.
30. Nafe R., Schlote W. 2004. Histomorphometry of brain tumours. Neuropathology and Applied
Neurobiology, 30: 315–328.
31. Olson M.O. 2004. The nucleolus. Kluwer Academic Plenum Publisher, London.
32. Olson M., Dundr M. 2005. The moving part of the nucleolus. Histochemistry and Cell Biology,
123: 203-216.
33. Olson M.O., Hingorani K., Szebeni A. 2002. Conventional and nonconventional roles of the
nucleolus. International Review of Cytology, 219: 199–266.
34. Oskarsson T., Trumpp A. 2005. The Myc trilogy: Lord of RNA polymerases. Nature Cell Biology,
7: 215–217.
35. Peruquetti R.L., Assis I.M., Taboga S.R., de Azeredo-Oliveira M.T.V. 2008. Meiotic nucleolar
cycle and chromatoid body formation during the rat (Rattus novergicus) and mouse (Mus
musculus) spermiogenesis. Micron, 39: 419–425.
36. Peruquetti R.L., Taboga S.R., de Azeredo-Oliveira M.T.V. 2010. Characterization of Mongolian
gerbil chromatoid bodies and their correlation with nucleolar cycle during spermatogenesis.
Reproduction in Domestic Animals, 45: 399–406.
37. Peruquetti R.L., Taboga S.R., de Azeredo-Oliveira M.T.V. 2012. Morphological Changes
12
of Mammalian Nucleoli during Spermatogenesis and Their Possible Role in the Chromatoid Body
Assembling. ISRN Cell Biology, Article ID 829854.
38. Pikaard C.S. 2002. Transcription and tyranny in the nucleolus: the organization, activation,
dominance and repression of ribosomal RNA genes. W: The Arabidopsis Book. Red. Somerville
C.R., Meyerowits E.M., American Society of Plant Biologists, Rockville, USA.
39. Pollock D.L., Fechheimer N.S. 1978. The chromosomes of cockerels (Gallus domesticus) during
meiosis. Cytogenetics and Cell Genetics, 21: 267-281.
40. Prieto J.L, McStay B. 2005. Nucleolar biogenesis: the first small steps. Biochemical Society
Transactions, 33: 1441-1143.
41. Raška I., Koberna K., Malinsk J., Fidlerova H., Masata M. 2004. The nucleolus and transcription
of ribosomal genes. Biology of the Cell, 96: 579-594.
42. Raška I., Shaw P.J., Cmarko D. 2006. New Insights into Nucleolar Architecture and Activity. Int.
Rev., Cytol. 225: 177-235.
43. Reunov A., Isaeva V., Au D., Wu R. 2000. Nuage constituents arising from mitochondria: is it
possible? Development Growth and Differentiation, 42: 139–143.
44. Rubbi C.P., Milner J. 2003. Disruption of the nucleolus mediates stabilization of p53 in response to
DNA damage and other stresses. The EMBO Journal, 22: 6068-6077.
45. Ryan K.M., Phillips A.C., Vousden K.H. 2001. Regulation and function of the p53 tumor
suppressor protein. Current Opinion in Cell Biology, 13: 332–337.
46. Santoro R., Grummt I. 2001. Molecular mechanisms mediating methylation dependent silencing of
ribosomal gene transcription. Molecular Cell, 8: 719–725.
47. Scheer U., Hock R. 1999. Structure and function of the nucleolus. Current Opinion in Cell
Biology, 11: 385–390.
48. Shaw P.J, Jordan E.G. 1995. The nucleolus. Annual Review of Cell and Developmental Biology,
11: 93–121.
49. Staub E., Fiziev P., Rosenthal A., Hinzmann B. 2004. Insights into the evolution of the nucleolus
by an analysis of its protein domain repertoire. Bioessays 26: 567-581.
50. Takeuchi I.K., Takeuchi Y.K. 1990. Ethanol-phosphotungstic acid and bismuth staining of
spermatid nucleoli in mouse spermiogenesis. Journal of Structural Biology, 103: 104–112.
51. Teruel M., Cabrero J., Perfectti F., Camacho J.P.M. 2007. Nucleolus size variation during meiosis
and NOR activity of a B chromosome in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Chromosome
Research, 15: 755–765.
52. Ünal E., Kinde B., Amon A. 2011. Gametogenesis eliminates age-induced cellular damage and
resets life span in yeast. Science, 332: 1554–1557.
53. Wachtler F., Stahl A. 1993. The nucleolus: a structural and functional interpretation. Micron, 24:
473–505.
13
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych
Poza tematyką związaną ze strukturą jąderek w komórkach mejotycznych, prowadzone
przeze mnie badania dotyczyły szeroko pojętej cytogenetyki zwierząt gospodarskich. Istotną
część mojego dorobku naukowego stanowi charakterystyka chromosomów mitotycznych
i mejotycznych u różnych gatunków zwierząt gospodarskich. Analiza niestabilności genomu
została także podejmowana w ramach struktury chromosomów i jej wpływu na użytkowość
zwierząt. Badanie prowadzone we współpracy z Katedrą Biologicznych Podstaw Produkcji
Zwierzęcej Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie dotyczą metylacji genomu i wybranych
ptasich genów. Podejmowane przeze mnie tematy dotyczą także struktury chromatyny
plemnika, w szczególności w aspekcie modyfikacji epigenetycznych. Publikacje
interdyscyplinarne są natomiast owocem współpracy z jednostkami naukowymi w obrębie
Wydziału Przyrodniczego Uniwersytetu Przyrodniczo-Humanistcznego w Siedlcach oraz
jednostkami z innych polskich uczelni.
Pozostałe osiągnięcia naukowo-badawcze zostaną przedstawione wg następującego
układu.
a. Charakterystyka chromosomów mitotycznych i mejotycznych.
a.1 Genom
a.2 Chromosomy mitotyczne
a.3 Chromosomy mejotyczne
a.4. Telomery
b. Analiza niestabilności chromatyny
c. Struktura chromatyny plemnika
d. Metylacja
e. Badania interdyscyplinarne
a. Charakterystyka chromosomów mitotycznych i mejotycznych
Publikacje przedstawione w tym rozdziale dotyczą analizy genomu ptaków oraz struktury
mitotycznych i mejotycznych chromosomów wybranych gatunków zwierząt gospodarskich.
Szczególnym typem chromosomów mejotycznych są opisane tutaj chromosomy
szczoteczkowe.
a.1. Genom
Terminem genom określa się pełny komplet chromosomów i wszystkie zlokalizowane
w nich geny. Ponieważ różne komórki tego samego organizmu mogą mieć różny poziom
ploidalności, wielkość genomu zawsze odnosi się do haploidalnego zestawu chromosomów.
Genom definiowany jako całkowita wielkość DNA zawartego w haploidalnym zestawie
chromosomów określany jest liczbą par zasad (pb). Rozmiar tak definiowanego genomu
można wyrazić także wielkością fizyczną – masą DNA określaną, jako C-DNA (1C)
i wyrażaną w pikogramach (pg). „C” odnosi się do słowa „constans” lub „characteristic”. Na
tle innych gatunków ptaków najlepiej poznany jest genom kury domowej Gallus domesticus.
Opublikowanie pełnej sekwencji genomu kury wskazało istnienie rejonów syntenicznych
między genomem człowieka i ptaka, wskazujących, że pomimo 300 milionów lat
14
ewolucyjnego rozdzielenia ssaków i ptaków wiele sekwencji DNA zachowało swój
konserwatyzm.
Genom ptaków stanowi około jednej trzeciej genomu człowieka i jest jednym
z najmniejszych wśród kręgowców. Najliczniejszą grupę kręgowców stanowią ptaki
i paradoksalnie to ich genom jest najmniej poznany. Celem prac (II.A.1 i II.D.6) było
ustalenie ilości C-DNA zawartego w jądrach komórek różnych tkanek gęsi domowej Anser
anser (serce, płuco, skóra, trzustka, nerki, śledziona, wątroba, mózg, krew, jajnik i jądro).
Materiał referencyjny stanowił preparat wykonany z krwi kury. Średnią zawartość C-DNA
u Anser anser ustalono na poziomie 1,306 pg. Stwierdzono wysoki stopień zróżnicowania
zawartości jądrowego DNA w analizowanych tkankach, ponad 25 %. Minimalną zawartość
C-DNA stwierdzono w komórkach serca (0,471 pg), maksymalną zawartość C-DNA
w komórkach jajnika (2,256 pg). Przeważająca liczba (ponad 57 %) jąder komórkowych
wszystkich analizowanych tkanek charakteryzowała się zawartością C-DNA na poziomie od
1 do 1,5 pg. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że zawartość jądrowego DNA
jest dodatnio wysoko skorelowana z powierzchnią jądra komórkowego. Najniższym
współczynnikiem korelacji charakteryzował się tkanka skórna (0,601), najwyższym komórki
jajnika (0,920). Dla wszystkich analizowanych tkanek współczynnik korelacji oszacowano na
poziomie 0,736.
a.2. Chromosomy mitotyczne
Celem pracy (II.A.2) było ustalenie wzoru prążków G na wybranych chromosomach gęsi
domowej Anser anser. Na podstawie analizy wyników barwienia GTG stwierdzono, że na
wszystkich analizowanych chromosomach obszary subcentromerowe ramion p i q oraz
obszary telomerowe są pozbawione prążków pozytywnych. Świadczą o tym wyraźne jasne
(negatywne) prążki obserwowane we wspomnianych obszarach chromosomów. Na
analizowanych chromosomach zidentyfikowano czterdzieści osiem prążków pozytywnych
(prążków G). W wyniku zastosowania barwienia GTG ustalono wzór prążków G na
pierwszych ośmiu autosomach oraz chromosomach Z,W i sporządzono cząstkowy ideogram
chromosomów gęsi domowej.
Chromosomy mitotyczne gęsi domowej były także charakteryzowane w pracach (II.D.4)
i (II.D.11). W pracy (II.D.4) porównano kariotyp gęsi domowej pochodzenia europejskiego
Anser anser i azjatyckiego Anser cygnoides pod względem lokalizacji bloków
heterochromatyny. Stwierdzono zróżnicowaną dystrybucję heterochromatyny konstytutywnej
w chromosomach czwartej pary i chromosomach płci. Celem pracy (II.D.11) była
identyfikacja prążków T oraz obszarów subtelomerowych w chromosomach gęsi domowej.
Prążki T stanowią podzespół prążków R, wyjątkowo odporny na wysoką temperaturę. W ich
obrębie występuje duże nasycenie par C-G. Ponadto prążki T są rejonami chromosomów
o wysokiej zawartości genów, nawet w porównaniu z prążkami R. W wyniku zastosowania
barwienia T stwierdzono obecność prążków na wszystkich analizowanych chromosomach. Na
chromosomach submetacentrycznych prążki telomerowe obserwowano w obrębie obu
ramion. Na akrocentrycznym chromosomie trzeciej pary oraz chromosomach płci Z i W
można je było wyróżnić tylko na chromosomach metafazowych, jeszcze nie podzielonych na
chromatydy. Na akrocentrycznej piątej parze chromosomów stwierdzono obecność prążka
tylko w dystalnej części ramienia q. Na skutek wydłużonej inkubacji preparatów w gorącym
15
buforze PBS stwierdzono degradację rejonu subtelomerowego na wszystkich analizowanych
chromosomach. Zdegradowany rejon subtelomerowy obserwowano w obrębie dystalnych
części obu ramion chromosomów submetacentrycznych oraz na ramieniu q chromosomów
akrocentrycznych.
Innym gatunkiem drobiu wodnego stanowiącym materiał badawczy były kaczki (II.D.1).
W pracy zidentyfikowano obszary jąderkotwórcze w chromosomach kaczorów piżmowych.
Obecność aktywnych NOR stwierdzono w terminalnych częściach czterech pierwszych par
autosomów. Aktywne obszary jąderkotwórcze występowały na chromosomach z różną
częstotliwością. Różna była też intensywność wysrebrzania się NOR na chromosomach
homologicznych.
Chociaż głównym tematem badań cytogenetycznych były chromosomy ptaków,
charakterystykę kariotypu prowadzono także na innych gatunkach zwierząt gospodarskich.
Obiektem badań były miedzy innymi koza (II.A.5), owca (II.D.2) i koń (II.D.10).
W pracy (II.A.5) przeprowadzono badania, których celem było ustalenie liczby
i lokalizacji aktywnych NOR na chromosomach mitotycznych, ustalenie liczby i rodzaju AS
oraz określenie liczby jąderek w mejotycznych komórkach samców kozy polskiej białej
uszlachetnionej. Zastosowanie techniki barwienia chromosomów roztworem AgNO3 ujawniło
aktywne obszary jąderkotwórcze w terminalnych częściach ramion q chromosomów par 2., 3.,
4., 5., i 28. W ogólnej liczbie 80 analizowanych komórek stwierdzono 580 aktywnych NOR.
Aktywny NOR najczęściej obserwowano chromosomach par 2. i 3., najrzadziej na
chromosomach pary 5. W ogólnej liczbie 80 analizowanych komórek zaobserwowano 102
asoscjacje satelitarne. AS występowały najczęściej w komórkach posiadających 7 aktywnych
NOR, natomiast najrzadziej w komórkach posiadających 3 lub 4 obszary jąderkotwórcze.
Najczęściej w AS obserwowano udział chromosomów par 2. i 3. oraz chromosomów pary 28.
Na chromosomach mejotycznych barwienie roztworem AgNO3 ujawniło we wszystkich
analizowanych komórkach dwa jąderka, z których jedno zawsze wybarwiało się mocniej,
a drugie słabiej. Oba jąderka w komórce były takiej samej wielkości.
W pracy (II.D.2) opisano kariotyp owcy domowej oraz sporządzono kariogram dla tego
gatunku. Celem pracy (II.D.10) była charakterystyka kariotypu konia domowego pod
względem markerów chromosomowych – bloków chromatyny konstytutywnej oraz obszarów
jąderkotwórczych. Prążki C w chromosomach konia zidentyfikowano w rejonach
centromerowych wszystkich badanych chromosomów, z wyjątkiem jedenastej pary. Na
chromosomie płci X, oprócz proksymalnego prążka C, obserwowano dodatkowy prążek
w części interstycjalnej ramienia q. Chromosom Y był w 44% heterochromatynowy. Aktywne
NOR zidentyfikowano w terminalnych częściach ramienia pierwszej pary chromosomów oraz
w subcentromerowej części ramienia q par 28. i 31. Średnia liczba NOR w komórce wynosiła
3,61±1,03. Najczęściej obserwowano komórki posiadające trzy lub cztery aktywne NOR.
a.3. Chromosomy mejotyczne
Analizę cytogenetyczną u drobiu ogranicza charakterystyczna dla ptaków duża liczba
diploidalna oraz obecność mikrochromosomów. Standardowe metody analizy chromosomów
nie pozwalają na identyfikację mikrochromosomów. W związku z tym stosuje się
alternatywne metody polegające na analizie chromosomów mejotycznych. Proces mejozy jest
zazwyczaj obserwowany u osobników męskich, ponieważ spermatocyty są stosunkowo małe
16
jest ich dużo i są łatwo dostępne. Najczęściej chromosomy mejotyczne analizowane są
w komórkach będących w pachytenie i diplotenie pierwszego podziału mejotycznego.
Komórki charakterystyczne dla drugiego podziału mejotycznego występują nielicznie.
W pracy (II.A.3) przedstawiono przebieg mejozy w spermatocytach gęsi, ze szczególnym
zwróceniem uwagi na pierwszą profazę mejozy, fazę podczas której dochodzi do crossing
over, procesu gwarantującego zmienność rekombinacyjną organizmów. Zaprezentowane
wyniki są jedynym w dostępnym piśmiennictwie studium dotyczącym mejozy u ptaków
i można je z powodzeniem traktować nie tylko, jako materiał aplikacyjny w zakresie
cytogenetyki i biologii rozrodu ptaków, ale również jako pomoc w procesie dydaktycznym.
Badania struktury chromosomów mejotycznych rozszerzono o analizę kompleksów
synaptonemalnych. Kompleks synaptonemalny (SC) jest białkową strukturą, która łączy
homologi podczas profazy I podziału mejotycznego i zapewnia prawidłowy przebieg
rekombinacji genetycznej. Celem pracy (II.A.4) było uwidocznienie i identyfikacja
kompleksów synaptonemalnych u gęsi domowej. Zastosowanie standardowych technik
identyfikacji SCs nie umożliwia analizy ich molekularnej struktury. W mejotycznych
komórkach jednodniowych piskląt i 17 tygodniowych osobników o obecności kompleksów
symaptonemalnych można wnioskować na podstawie haploidalnej liczby biwalentów oraz
ciemno wybarwionych kinetochorów i rejonów subtelomerowych. Eksperymentalne
barwienie chromosomów fluorohromem DAPI pozwoliło zaobserwować charakterystyczną
drabinkową strukturę SCs oraz przebieg tworzenia synapsis w obrębie homologów, od
leptotenu aż po degradacje w późnym pachytenie. Szczegółowa molekularna struktura
kompleksu synaptonemalnego może być analizowana jedynie przy użyciu mikroskopu
elektronowego lub skaningowego. W dostępnej literaturze obecność biwalentów jest
jednoznaczna z określeniem kompleks synaptonemalny z uwagi na fakt, iż biwalent jest
bezpośrednim skutkiem istnienia kompleksu synaptonemalnego. Jednak biwalent i kompleks
synaptonemalny to dwie odmienne struktury.
Tematyka kompleksów synaptonemalnych była także podejmowana w rozdziale
monografii (II.E.1) oraz w pracy przeglądowej (II.D.7). We wspomnianych pracach
zwrócono uwagę na specyfikę formowania kompleksów synaptonemalnych. Opisano w nich
także proces formowania biwalentu płciowego
Kompleks synaptonemalny u organizmów wyższych rozpoczyna swoje formowanie od
rejonów telomerowych i wydawać by się mogło, że również u ptaków, jako pierwsze synapsis
utworzą krótsze mikrochromosomy. Jednak w komórkach ptaków pierwsze kompletne
synapsis osiągają makrobiwalenty. Zjawisko to tłumaczy specyficzny charakter genomu
ptaków, który w przeciwieństwie do ssaków, jest obdarzony znaczną liczbą sekwencji
telomerowych w interstycjalnych miejscach ramion chromosomów. Występowanie
interstycjalne położonych sekwencji telomerowych na makrochromosomach wiąże się ze
zwiększeniem liczby miejsc inicjacji formowania się SC, co tłumaczy szybsze osiągniecie
synapsis. W biwalentach akrocentrycznych istnieją dwa potencjalne miejsca inicjacji, które
znajdują się dystalnej i proksymalnej części ramienia q. Krótkie ramiona p ulegają parowaniu
znacznie później.
Chromosomy płciowe ptaków są w większości upakowane w postaci euchromatyny
z pominięciem regionów centromerowych i całego krótkiego ramienia chromosomu W.
Podczas pachytenu osie chromosomów Z i W tworzą biwalent połączony kompleksem
17
synaptonemalnym, rozciągającym się wzdłuż całej osi chromosomu W. Nieco później
niesparowany odcinek ramienia Z zaczyna się wyraźnie skracać (od wczesnego do połowy
pachytenu) tworząc strukturę serpentynopodobną tak, aby osiągnąć długość elementów
lateralnych uformowanego SC. W ten sposób ramię Z skręca się, tworząc „pętlę” wokół
prostego ramienia W, wskazującą na rozmiar niehomologicznego parowania się tych
chromosomów w tym rejonie.
Szczególnym typem chromosomów mejotycznych są chromosomy szczoteczkowe.
W monografii (II.D.5) oraz w pracy przeglądowej (II.D.12) przedstawiono szczegółowe
studium na temat struktury i funkcji chromosomów szczoteczkowych.
Chromosomy szczoteczkowe, występujące w rozwijających się oocytach dojrzałych
płciowo samic, ze względu na swoje rozmiary i strukturę stanowią bogate w detale obiekty
analizy cytogenetycznej. Ich długość dzięki dekondensacji chromatyny rośnie i waha się w
granicach 400 do 800 m, dzięki czemu są nawet do 30 razy większe niż chromosomy
mitotyczne. Pojęcie chromosomów szczoteczkowych (lampbrush chromosomes - LBCs)
wprowadził Ruckert w 1892 roku. Nazwa wzięła się stąd, że porównał je do szczotek
wykorzystywanych do czyszczenia lamp ulicznych w XIX wieku.
Chromosomy szczoteczkowe są mało poznanymi strukturami. Nieznany jest zarówno
dokładny mechanizm tworzenia się tych form chromosomów z ich małych form
mitotycznych, jak również ich funkcja w oocycie. Wiadomo, że są przejściowymi strukturami
obecnymi podczas pierwszego podziału mejotycznego w przedłużonej fazie diplotenu.
Wywodzą się z niewielkiej telofazowej formy z końca ostatniej oogonialnej mitozy, skąd
wchodząc w stadium diplotenu pierwszego podziału mejotycznego przechodzą gwałtowną
dekondensację prowadzącą do powstawania bardzo dużych struktur chromosomów.
Chromosom szczoteczkowy we wczesnej profazie jest biwalentem złożonym z dwóch
koniugujących homologów, stając się ostatecznie tetradą. Oś każdego z chromosomów
homologicznych stanowią dwie helisy DNA (chromatydy siostrzane). Każda nić zawiera dużą
liczbę rejonów skondensowanej chromatyny (są to chromomery widoczne w postaci ciemno
zabarwionych nieregularnych struktur widocznych także w jądrze interfazowym)
poprzedzielanych pętlami bocznymi chromatyny zdekondensowanej. W homologicznych
odcinkach biwalentu chromatyna jest w stanie kondensacji (spiralnie zwinięta) lub
zdekondensowana w postaci pętli bocznych po dwie dla każdego chromosomu, a cztery na
poziomie biwalentu. Pętla stanowi część osi chromosomu, ma zdolność rozciągania się
i kurczenia.
Rutynowa analiza chromosomów mitotycznych umożliwia jedynie charakterystykę ich
morfologii. Aktywność transkrypcyjną genów można oceniać tylko metodami molekularnymi
polegającymi na detekcji ilości produkty transkrypcji. Aktywność transkrypcyjna
chromosomów szczoteczkowych widoczna jest już w mikroskopie świetlnym i można ją
oceniać na podstawie zmian w budowie morfologicznej.
W pracach (II.A.6) i (II.A.10) dokonano analizy aktywanosci transkrypcyjnej
szczoteczkowych chromosomów gęsi przed i po sezonie reprodukcji. W badaniach aktywność
transkrypcyjna chromosomów szczoteczkowych była analizowana na podstawie obecności
pętli bocznych i struktur markerowych. W chromosomach szczoteczkowych zmiany
aktywności transkrypcyjnej widoczne są, jako zmiany w budowie morfologicznej i zależą od
procesów fizjologicznych komórki. Aktywność transkrypcyjna stwierdzana była na podstawie
18
obecności pętli bocznych na chromosomach oraz struktur markerowych po zastosowaniu
standardowego barwienia chromosmów barwnikiem Coomasie Brillant Blue. Jest to
najprostsza i najczęściej stosowana technika identyfikacji chromosomów szczoteczkowych.
Analizę porównawczą prowadzono na podstawie obecności następujących struktur
markerowych (GLLs – giant lumpy loops, MLs – marker loops, DBLs – distal boundary
loops, PBLs – proximal boundary loops, TLs – telomeric loops, TBLs – telomeric bow-like
loops, TLLs - telomeric lumpy loops, DBs – double bridge, Chs – chiasmata, PBs – protein
bodies.
Odpowiednie biwalenty uzyskane przed i po reprodukcji posiadają zbliżoną wielkość,
różnią się natomiast budową morfologiczną. Chromosomy szczoteczkowe uzyskane po
okresie reprodukcji posiadają zredukowane pętle boczne będące miejscem intensywnej
aktywności transkrypcyjnej, uwidaczniają się w nich natomiast nieaktywne chromomery.
Struktury markerowe, takie jak duże pętle boczne (ML) oraz pętle telomerowe (T, TLL
i GLL) są elementami, które najpóźniej ulegają degradacji po zakończonej reprodukcji
i w związku z tym stanowią podstawę do identyfikacji poszczególnych biwalentów w różnych
okresach aktywności transkrypcyjnej komórki.
Inny obraz chromosomów uzyskanych od gęsi przed i po sezonie reprodukcji wynika ze
zmiany aktywności transkrypcyjnej, która jest związana z procesami fizjologicznymi
organizmu i uwidacznia się w budowie morfologicznej chromosomu. LBCs gęsi przed
sezonem reprodukcyjnym charakteryzowały się dużymi pętlami bocznymi świadczącymi
o aktywnej transkrypcji. Chromosomy uzyskane od gęsi pod koniec sezonu reprodukcji
charakteryzowały się małymi pętlami bocznymi i widocznymi chromomerami, co jest
związane z mniejszą aktywnością transkrypcyjną komórki. Porównanie aktywności
transkrypcji na chromosomach uzyskanych od gęsi przed i po sezonie reprodukcji pozwoliło
także ustalić, że chiazmy, PBs oraz struktury markerowe takie jak duże pętle boczne (ML)
oraz pętle telomerowe (T, TLL i GLL) są strukturami, które najpóźniej ulegają degradacji po
zakończonej reprodukcji.
Celem pracy (II.A.9) było porównanie aktywności transkrypcyjnej chromosomów
szczoteczkowych ze wzorem GTG odpowiednich chromosomów mitotycznych. Aktywne
transkrypcyjnie rejony LBCs z dobrze wykształconymi pętlami bocznymi korespondowały
z pozytywnymi prążkami G. Na chromosomach szczoteczkowych liczba wyznaczonych
obszarów aktywnych transkrypcyjnie była większa niż analogicznych prążków G na
odpowiadających im chromosomach mitotycznych. Wynika to z mniej skondensowanej
struktury LBCs, która umożliwiła uzyskanie wzoru o wyższej rozdzielczości. Obserwowane
dodatkowe prążki na LBCs odpowiadały lokalizacji szerokich pozytywnych prążków
w wyznaczonych rejonach chromosomów mitotycznych, w związku z tym wzór prążków G
i wzór aktywnych transkrypcyjnie rejonów LBCs uznano za analogiczny.
Zespół naukowy Katedry Genetyki i Hodowli Koni jest jedyną w Polsce i jedną
z nielicznych na świecie jednostką zajmującą się tematyką chromosomów szczoteczkowych.
Mieliśmy zaszczyt przedstawienia wyników naszych badań na specjalnej sekcji poświęconej
chromosomom szczoteczkowym, w ramach 18 Międzynarodowej Konferencji
Cytogenetycznej w Manchester (II.D.37).
19
a.4. Telomery
Tematyka telomerów była podejmowana zarówno w odniesieniu do chromosomów
mitotycznych, jak i mejotycznych. Została przedstawiona w dwóch pracach przeglądowych
(II.D.8) i (II.D.9).
Telomery są dystalnymi częściami ramion chromosomów organizmów eukariotycznych.
Odgrywają istotną rolę w utrzymaniu stabilności chromosomów i w replikacji zakończeń
chromosomów. Telomery eukariontów mają podobna strukturę. Są to tandemowe
powtórzenia motywu (TTAGGG)n. Sekwencje telomerowe odgrywają szczególne znaczenie
w badaniach ewolucyjnych kariotypu ptaków. Ewolucja kariotypu ptaków rozpoczęła ok. 250
mln lat temu w erze triasu, jako skutek odseparowania się tych organizmów od gadów.
Zainicjował się wówczas istotny proces — akumulacja mikrochromosomów, które średnio
stanowiły 12,4 Mb wielkości genomu. Pochodzenie mikrochromosomów opiera się na
przypuszczeniach i teoriach. Początkowo uznawano, że były to chromosomy pierwotne, które
tworzyły w wyniku fuzji makrochromosomy. Obecnie, na podstawie modelu „rozpadu i fuzji”
uznano, iż przynajmniej 10 par mikrochromosomów jest wynikiem pęknięć
makrochromosomów. Zlokalizowanie powtórzeń (TTAGGG)n w różnych częściach
chromosomów znacznie różniących się gatunków ptaków może doprowadzić do odpowiedzi
czy wysoce zmienna liczba mikro imakrochromosomów może mieć związek z telomerami.
Telomery mogą być gubione lub mogą przyrastać podczas powstawania nowych gatunków
w trakcie ewolucji gatunków. Silny konserwatyzm sekwencji telomerowej i jej obecność na
telomerowych i nietelomerowych obszarach może być narzędziem, które umożliwia
rekonstrukcję ewolucyjnych rearanżacji kariotypowych.
Analiza niestabilności chromatyny
Niestabilność chromosomowa jest terminem określającym wzrost liczby złamań
i innych uszkodzeń chromosomów, w komórkach somatycznych badanej grupy w porównaniu
z populacją kontrolną. Niestabilność chromatyny jest czynnikiem generującym powstawanie
kolejnych mutacji, najczęściej dotyczących struktury chromosomów. Ich efektem są
transformacje nowotworowe, wady rozwojowe, zamieralność embrionów, problemy
w reprodukcji. Wyniki badań pozwalają zidentyfikować osobniki nadwrażliwe na czynniki
genotoksyczne i opracowanie kryterium eliminowania ich z programów hodowlanych.
Identyfikacja niestabilności chromatyny podczas embriogenezy oraz okresów przed, po
i podczas reprodukcji u samców i samic, umożliwi identyfikowanie przyczyn zamieralności
zarodków, obniżonej wylęgowości i reprodukcji. Niestabilność chromatyny, zarówno na
poziomie DNA, jak i chromosomów metafazowych jest traktowana jako test wrażliwości
populacji i wrażliwości indywidualnej na mutageny i może być stosowana jako element
biomonitoringu populacji.
W pracach (II.A.11), (II.A.12) oraz (II.A.15) analizowano wpływ niestabilności
chromatyny na użytkowość drobiu.
Celem pracy (II.A.11) była ocena częstotliwości wymian chromatyd siostrzanych SCE
(ang. sister chromatyd exchange) w chromosomach kur zielononóżka kuropatwiana i polbar.
Średnia liczba SCE na komórkę wynosiła 7,22 u zielononóżki i 8,43 u polbara. Wyższą
średnią liczbę SCE obserwowano w grupie kur charakteryzujących się gorszą nieśnością
w porównaniu do grupy kur wykazujących lepszą nieśność. Różnice były istotne
b.
20
statystycznie. Dokonano również szczegółowej analizy występowania SCEs na chromosomie
pierwszym, drugim i trzecim. Najwięcej SCEs zaobserwowano na chromosomie pierwszym,
najmniej na trzecim. Najwięcej wymian zaobserwowano w proksymalnej części
chromosomów.
Praca (II.A.12) dotyczyła oceny częstości zachodzenia wymian chromatyd siostrzanych
w chromosomach brojlerów z objawami chondrodystrofii w porównaniu ze zdrowa grupa
kontrolną. Średnia liczba wymian na komórkę wynosiła 6,8. U kur z chondrodystrofią wartość
ta kształtowała się na poziomie 8,5; u kur zdrowych 5,1. Stwierdzono istotne statystycznie
różnice między obiema grupami kur. Wyższą średnią liczbę wymian obserwowano u samców
niż u samic, odpowiednio 6,9 i 6,7. Różnice były jednak poniżej poziomu istotności.
Określono częstość SCEs na trzech pierwszych parach chromosomów. Najwięcej SCEs
zidentyfikowano w części proksymalnej chromosomu pierwszej pary.
Badania prowadzone w ramach pracy (II.A.19) dotyczyły występowania niestabilności
chromosomowych u przepiórki japońskiej. Niestabilność oceniano testem SCE oraz
identyfikowano łamliwe miejsca chromosomów. Analizie poddano dwa pokolenia ptaków.
W badanej populacji średnia częstość zachodzenia wymian chromatyd siostrzanych wynosiła
6.04±0.45 i miejsc łamliwych 1.17±0.79. W pracy zbadano zależność pomiędzy uzyskanymi
wynikami z niestabilności chromosomów z wynikami cech reprodukcyjnych przepiórek.
Stwierdzono korelacje pomiędzy niestabilnością chromosomów na poziomie 0,51-0,64
w pokoleniu F1 i 0,1-0,23 w pokoleniu F2.
Metodą stosowaną w identyfikacji niestabilności chromosomów jest także test
kometowy. Jego zastosowanie w analizach opisano w pracy przeglądowej (II.A.15). Jest to
podstawowa metoda analizy stopnia fragmentacji DNA na skutek działania czynników
genotoksycznych. Test kometowy polega na rozdziale elektroforetycznym DNA
analizowanych komórek. Test kometowy umożliwia analizę kilku różnych modyfikacji DNA,
przy stosunkowo niewielkich zmianach w podstawowej procedurze testu. Metoda ta
identyfikuje jednoniciowe i dwuniciowe pęknięcia DNA oraz wszelkie modyfikacje
chemiczne i enzymatyczne, które mogą się przekształcić w pęknięcia DNA lub chromatyd.
Test kometowy daje możliwość detekcji uszkodzeń DNA na poziomie pojedynczej komórki.
Mogą nim być analizowane dowolne tkanki, z których uzyskuje się zawiesinę komórkową.
Analizowane komórki zatapia się w agarozie na szkiełku mikroskopowym. Po wytrawieniu
białek pozostaje DNA. Szkiełko poddaje się elektroforezie i barwi substancją fluorescencyjną.
Uzyskuje się obraz w postaci „komet”. „Głowa” to miejsce unieruchomienia komórki przed
lizą, „ogon” to uszkodzone fragmenty DNA. Miarą poziomu uszkodzeń DNA jest długość
ogona i ilość zawartego w nim DNA. Test kometowy znajduje zastosowanie w badaniach
aplikacyjnych w toksykologii genetycznej, monitoringu naprawy DNA po chemioi radioterapii, ekotoksykologii, żywieniu zwierząt i człowieka, biomonitoringu
genotoksyczności, epidemiologii, ocenie materiału deponowanego w bankach nasienia
i bankach krwi.
c.
Struktura chromatyny plemnika
Rozwój biologii, genetyki molekularnej oraz technologii umożliwia ujawnienie coraz
większej różnorodności w strukturze plemnika. Ich poznanie umożliwia z kolei wykrycie
i zrozumienie podłoża defektów plemnika, które w wielu przypadkach dotyczą zmian
21
jądrowego i mitochondrialnego DNA, a których widocznym efektem są plemniki
o zmienionej budowie morfologicznej. Barwienie azotanem srebra jest techniką prostą, tanią,
dającą szybki wynik. Azotan srebra umożliwia identyfikację zróżnicowanej budowy główki
plemnika oraz wyraźną identyfikację wstawki plemnika. W efekcie może być z powodzeniem
stosowany, jako uzupełnienie rutynowych technik oceny morfologii nasienia lub jako
technika samodzielna. Celem tego nurtu badań było określenie przydatności barwienia
azotanem srebra w ocenie morfologii i identyfikacji struktur plemnika.
W pracy (II.A.8) badano plemniki izolowane z jąder i nasienia. Barwienie azotanem
srebra umożliwiło identyfikację wielu istotnych szczegółów budowy morfologicznej
plemnika i może być z powodzeniem stosowane w ocenie morfologii plemnika.
Białka główki plemnika mają charakter zasadowy i w efekcie po zastosowaniu azotanu
srebra część akrosomowa główki wybarwia się mniej intensywnie, niż część dystalna.
Z barwienia azotanem srebra wynika, że chromatyna jądra plemnika ma inny skład w części
akrosomowej, a inny w części dystalnej, w której zlokalizowane są białka o charakterze
kwaśnym i jąderko, pozytywnie reagujące na sole srebra. Strukturą doskonale
identyfikowalną azotanem srebra jest wstawka. Wstawka plemnika w 80% swojej objętości
złożona jest z mitochondriów, które zapewniają optymalna ilość energii niezbędnej do ruchu
plemników. Gdy defekty mitochondriów występują w dużej liczbie plemników prowadzą do
obniżonej lub całkowitej niepłodności osobnika.
Stosując barwienie azotanem srebra wykonano szczegółową analizę morfometryczną
plemników pięciu gatunków zwierząt. W pracy (II.A.17) oceniano plemniki świni, dzika,
kozy i sarny, w pracy zaakceptowanej do druku w czasopiśmie Medycyna Weterynaryjna
poddano wnikliwej analizie plemniki konia domowego. Barwienie AgNO3 zróżnicowało
główkę plemnika na część akrosomową i dystalną. W obrębie witki wyraźnie odznaczała się
wstawka. Takie zabarwienie umożliwiało wykonanie szczegółowych pomiarów (długość
główki plemnika, szerokość główki plemnika, obwód główki plemnika, pole powierzchni
główki, obwód i pole części akrosomowej główki plemnika, długość wstawki plemnika,
długość witki plemnika oraz łączną długość plemnika). Na podstawie wyników pomiarów
morfometrycznych obliczono również parametry budowy morfologicznej plemnika.
Zastosowanie barwienia azotanem do oceny morfologii i morfometrii plemników
i wykorzystanie klasycznego utrwalacza cytogenetycznego do przechowywania próbek
nasienia zostało opatentowane (II.D.1).
Plemnik jest przykładem jednego z najbardziej zróżnicowanych typów komórek,
a chromatyna haploidalnego genomu plemnika różni się w istotny sposób od komórki
somatycznej składem chemicznym, strukturą i funkcją. Chociaż struktura chromatyny
plemnika ma znaczący wpływ na zapłodnienie i rozwój zarodka, nadal przeważnie do oceny
jakości nasienia stosuje się rutynowe techniki barwienia, a ocena plemników najczęściej
ogranicza się do wykrywania ich nieprawidłowej budowy morfologicznej.
Większość wad plemników ograniczających ich możliwość do zapłodnienia jest jednak
skutkiem nieprawidłowości spermatogenezy. Są to zmiany o charakterze molekularnym,
cytogenetycznym i epigenetycznym, związane z nieprawidłową organizacją chromatyny.
Zmiany epigenetyczne, takie jak modyfikacje histonów i metylacja DNA są ściśle związane
z organizacją chromatyny plemnika. W tym nurcie główną rolę odgrywa protaminacja.
Podczas spermiogenezy chromatyna plemnika podlega radykalnym zmianom, od stosunkowo
22
zdekondensowanej formy histonowej, do wyjątkowo skondensowanej konformacji
zdeterminowanej przez protaminy. Ocena upakowania chromatyny w plemniku jest nie tylko
wskaźnikiem prawidłowości spermatogenezy, ale także prawidłowości ojcowskiego genomu
i epigenomu oraz wyznacznikiem wartości biologicznej plemników.
W (II.A.16) pracy poddano ocenie plemniki buhaja izolowane z ogona najądrza, po
zabarwieniu AB (aniline blue) i CMA3 (chromomycin A3). W wyniku barwienia AB
określono udział plemników z prawidłową zawartością histonów i ze zbyt wysoką
zawartością histonów, odpowiednio 98,6% i 1,4%. Zastosowanie CMA3 umożliwiło
identyfikację plemników z prawidłowym upakowaniem chromatyny oraz plemników o niskiej
kondensacji chromatyny powstałej na skutek nieprawidłowej protaminacji, odpowiednio
98,65% i 1,35%. Badania białek jądrowych w aspekcie niepłodności pozwalają zrozumieć,
jak ważny jest wpływ prawidłowej struktury chromatyny na funkcje plemników.
d.
Metylacja
Metylacja DNA jest biochemicznym procesem kontrolującym strukturę chromatyny.
Przyłączenie grupy metylowej do cytozyny w obrębie wysp CpG skutkuje zmianami
w aktywności transkrypcyjnej genów oraz zmianą struktury i konformacji chromatyny.
Znakowany grupami metylowymi obszar, przekształca się w heterochromatynę, a ekspresja
genów znajdujących się w tym regionie zostaje zahamowana. Metylacja DNA jest procesem
niezmiernie dynamicznym. System rozmieszczenia grup metylowych jest różny w różnych
okresach życia i w różnych typach komórek. Około 90% genów człowieka w wieku
dojrzałam jest wyciszonych. Zaburzenia w regulacji metylacji DNA skutkują aktywacją
onkogenów, inaktywacją genów - supresorów nowotworów oraz zaburzeniami stabilności
chromatyny. Dotychczas prowadzone badania na drożdżach, nicieniach, muszkach
owocowych i myszach potwierdziły zmiany w ekspresji genów podczas starzenia się
organizmów. Opis procesu metylacji, jego znaczenia oraz sposobów detekcji zmetylowanej
cytozyny przedstawiono w pracach przeglądowych (II.D.13), (II.D.14) i (II.D.15).
Celem pracy (II.A.13) było określenie metylacji genu CDKN2B podczas rozwoju
embrionalnego u kur rasy Polbar za pomocą techniki MSP (methylation-specyfic PCR). Gen
CDKN2B (cyclin-dependent kinase inhibitor 2B) zlokalizowany jest na chromosomie Z
u ptaków w locus bar wraz z czterema innymi genami: micro-RNA 31 (miRNA-31),
methylthioadenosine phosphorylase (MTAP), tripartite motif 36 (TRIM36), oraz protein
geranylgeranyltransferase type I, β subunit (PGGT1B). Wszystkie są odpowiedzialne za
aktywność melaniny w melanocytach. Badania wykazały, że gen CDKN2B nie jest
wyciszony w 6 i 12 dobie rozwoju embrionalnego kur Polbar. Jako jeden z pięciu genów
odpowiedzialnych za aktywność melaniny w melanocytach, będąc w znacznym stopniu
aktywny, może przyczyniać się do produkcji tego barwnika. W pracy (II.A.20) oceniano wzór
upierzenia piskląt Polbar w ciągu pierwszego miesiąca po ich wylęgu i analizowano, czy
istnieje związek między zmianą koloru upierzenia, a zmianami poziomu metylacji genu
CDKN2B. Uzyskane wyniki wskazują, że zarówno pierwszego dnia po wykluciu i w wieku 22
tygodni cytozyna w zamplifikowanym fragmencie może być metylowana. Oznacza to, że w
badanych okresach rozwoju gen jest w znacznym stopniu aktywny. Stwierdzono, że różnice w
upierzeniu młodych kur i kogutów są najbardziej widoczne w pierwszym dniu po wykluciu.
Wraz z wiekiem, wzór upierzenia staje się jednolity u samców i samic.
23
Badania metylacji DNA genu CDKN2B u kur Polbar wprowadzają informacje na temat
epigenetycznych mechanizmów autoseksingu tego gatunku oraz ogólną wiedzę na temat
działania mechanizmów epigenetycznych u ptaków. Powyższy gen nie jest wyciszony
w badanych okresach, co może sprzyjać aktywnej produkcji melaniny w melanocytach, a tym
samym różnicować kurki od kogutków w pierwszej dobie po wykluciu.
W pracy (II.A.14) oceniano poziom globalnej metylacji DNA w zależności od etapu
rozwoju zarodka. Określono zawartość 5 – metylocytozyny w DNA w szóstym dniu inkubacji
podczas oddychania omoczniowego oraz w osiemnastym dniu inkubacji w trakcie oddychania
płucnego w zarodkach kur rasy Polbar. Wykazano wyraźną zależność między etapem rozwoju
osobniczego, a globalnym poziomem 5-metylocytozyny w DNA. W przeprowadzonych
badaniach stwierdzono istotny statystycznie wzrost poziomu metylacji DNA pomiędzy szóstą
a osiemnastą dobą inkubacji. Metylowana cytozyna jest ważnym epigenetycznym czynnikiem
regulującym aktywność genów odpowiedzialnych za proces różnicowania.
e.
Badania interdyscyplinarne
Opisywane w tej części prace są efektem współpracy z pracownikami Instytutu
Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt, którego jestem pracownikiem. Badania dotyczące struktury
mięśni wybranych gatunków bydła zostały opisane w publikacji (II.A.1). Wyniki analiz
obejmujących zróżnicowanie populacji kaczek na podstawie polimorfizmu białek surowicy
krwi przedstawiono w publikacji (II.D.3). Opracowanie dotyczące genetycznych
uwarunkowań sprawności fizycznej u koni zostało przedstawione w formie artykułu
przeglądowego (II.D.16). Wyniki analizy lęgów sokoła i papużki falistej utrzymywanych
w prywatnych hodowlach ukazały się odpowiednio w pracach (II.D.17) i (II.D.18). Badania
na temat porównania jakości jaj kur rasy Araukana i Zielononóżka kuropatwiana zostały
opisane w publikacji (II.A.18).
24